Введение к работе
Актуальность проблемы
Грипп и острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) остаются одной из самых актуальных медицинских и социально экономических проблем. Грипп является опасной высококонтагиозной инфекцией, распространенной по всему миру и вызывающей заболевания у человека, многих видов млекопитающих и птиц. Во время эпидемии заболевает не менее 20-30% детей и 5-Ю % взрослого населения, при пандемии - до 40-60% (Potter C.W., 1998; Slepushkin A.N. et al., 2004; Гендон Ю.З., 2007). Основная причина этого связана со способностью вируса гриппа преодолевать иммунитет, вызванный предшествующей гриппозной инфекцией или вакцинацией, благодаря естественной изменчивости генома возбудителя (Wilson I.A., Сох N., 1990; Гендон Ю.З., 2008).
Реассортация генов вирусов гриппа человека, птиц и свиней, последующая реассортация вирусов гриппа свиней американской и евроазиатской генетических линий (WHO, 2009; Morens et al., 2009) привела к возникновению нового вируса A(HlNl)v, его активному распространению среди людей в странах разных континентов. Это вынудило экспертов ВОЗ объявить в июне 2009г. о начале новой пандемии XXI века. Благодаря современному транспортному сообщению, произошло быстрое проникновение вирусов в Российскую Федерацию из других стран. В России первый пандемический вирус гриппа был выделен в мае 2009г. от больного, вернувшегося из США, уже через два месяца после обнаружения первого случая заболевания в мире (Львов Д.К. и др., 2009). Развитие пандемического процесса в России вызвало необходимость проведения исследований по изоляции и изучению молекулярно-биологических свойств пандемических штаммов из разных регионов.
Распространение высокопатогенного вируса гриппа A(H5N1) среди дикой и домашней птицы, а также регистрация случаев инфицирования этим вирусом людей (Сох N., 2003; WHO, 2005; Webster R.G.&Govorkova Е., 2006) также может привести к возникновению антигенного варианта вируса гриппа - нового потенциального кандидата в пандемические штаммы (Львов Д.К. и др., 2004; Webster R.G. et al., 2006; WER, 2008; MMWR, 2009). Быстрое проникновение вирусов гриппа A(H5N1) в нашу страну обусловлено соседством России со странами, где выделено большинство таких штаммов (WHO, 2010).
В связи с этим крайне важными направлениями борьбы с гриппом являются надзор за распространением инфекции, своевременная диагностика возбудителя и профилактика заболевания. Степень защищенности человеческой популяции зависит от возможности прогнозирования появления кардинально новых в антигенном отношении вирусов гриппа.
Для характеристики возбудителей проводятся вирусологические и серологические исследования. Выделение, типирование, изучение различных свойств современных циркулирующих штаммов вирусов гриппа позволяет определить направление антигенной изменчивости вирионных белков, установить эволюционные связи с ранее циркулировавшими эпидемическими и эталонными штаммами. Изучение динамики популяционного иммунитета в зависимости от периода эпидемического цикла показывает степень защиты населения к циркулирующим эпидемическим вирусам гриппа.
Данные об эпидемических актуальных штаммах необходимы как для расшифровки причин текущих и прогнозирования грядущих эпидемий, так и для проведения профилактических и противоэпидемических мероприятий, в том числе - подбора кандидатов в вакцинные штаммы и при разработке диагностических препаратов.
В настоящее время для выявления и идентификации вирусов широко используют молекулярные методы, специфичность которых основана на уникальности нуклеотидных последовательностей вирусных геномов (Ieven М., 2007, Kesson A.M., 2007). Наиболее распространенными методами являются различные модификации полимеразной цепной реакции (ПЦР). В настоящее время в России стали активно разрабатывать тест-системы на основе ПЦР для выявления вирусов гриппа и других ОРВИ. Сравнение чувствительности и специфичности, оценка способности этих систем выявлять вирусы гриппа в различных биологических образцах с учетом особенностей современного периода позволит усовершенствовать надзор за гриппом. Кроме того, важным направлением исследований является разработка новых подходов для диагностики гриппозной инфекции.
Таким образом, совокупность вирусологических и серологических данных в сравнении с циркулирующими штаммами в мире позволит получать сведения о циркуляции и изменчивости вирусов гриппа на территории России.
Цели и задачи исследования
Целью настоящего исследования является изучение распространения, молекулярно-биологических и иммуногенных свойств эпидемических и пандемических штаммов вирусов гриппа, циркулировавших в разных регионах России с 2006 по 2010гг., а также усовершенствование лабораторной диагностики гриппа.
Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:
-
Изолировать и изучить антигенные и биологические свойства новых вариантов вирусов гриппа, циркулировавших в России в период 2006-2010 гг., определить их эволюционные связи с эталонными штаммами, рекомендованными ВОЗ в этот период.
-
Изучить изоляты пандемических штаммов вируса гриппа A(HlNl)v в России, определить их антигенные и молекулярно-биологические свойства.
-
Изучить чувствительность различных систем, используемых для изоляции (культура клеток MDCK и куриные эмбрионы (КЭ) и идентификации вирусов гриппа (эритроциты человека и кур), к эпидемическим и пандемическим штаммам, изолированным в период 2006-2010ГГ.
-
Определить влияние температурного воздействия на активность НА эпидемических и пандемических штаммов, изолированных в период 2006-2010гг. и обладающих разными антигенными свойствами.
-
Изучить состояние популяционного иммунитета населения к современным штаммам вирусов гриппа А и В в зависимости от периода эпидемического цикла.
-
Оценить возможность использования новых отечественных ПЦР тест-систем для мониторинга за современными эпидемическими и пандемическими штаммами вирусов гриппа.
-
Установить возможность использования метода поверхностного плазмонного резонанса для детекции нуклеиновых кислот и белков вирусов гриппа в растворах.
Научная новизна работы
-Впервые в России получены приоритетные данные: выявлены представители пандемического варианта вируса гриппа A(HlNl)v, антигенно родственного вирусу гриппа свиней. Установлено начало пандемического процесса в Российской Федерации в 2009г., обусловленного появлением на территории нашей страны пандемического штамма.
-На основании результатов вирусологических и серологических исследований определена этиологическая структура эпидемий гриппа в России с 2006г. по 2010г., установлена социркуляция вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В в течение всего периода.
-Впервые установлено появление в 2006г. штаммов вирусов гриппа А(НШ1), антигенно родственных новому эталону А/Соломоновы Острова/3/06. Определена дальнейшая эволюция белков НА этих вирусов гриппа в направлении НА эталонного штамма А/Брисбен/59/07.
-Установлена эволюция вирусов гриппа A(H3N2) в период с 2006 по 2009гг. Выявлена ежегодная смена антигенных вариантов, родственных новым эталонам А/Висконсин/67/05 и А/Брисбен/10/07.
-Впервые в России выявлены новые антигенные варианты, подобные В/Флорида/04/06 эволюционной линии В/Ямагата/16/88, при этом установлена социркуляция представителей двух эволюционных линий вирусов гриппа В в эпидемическом сезоне 2006-2007гг. и чередование циркуляции в следующие сезоны 2007-2008 и 2008-2010гг.
-Установлено, что системы изоляции КЭ и MDCK чувствительны к пандемическим штаммам вируса гриппа A(HlNl)v; культура клеток MDCK продолжает оставаться приоритетной системой для изоляции эпидемических штаммов вирусов гриппа из носоглоточных смывов.
-Выявлена чувствительность эритроцитов человека 0(1) группы крови и кур к пандемическим штаммам A(HlNl)v и увеличение чувствительности эритроцитов кур к современным эпидемическим штаммам вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В, изолированным в период с 2006 по 2010гг.
-Впервые в России разработаны и апробированы 2 ПЦР тест-системы для идентификации и дифференциации HI и НЗ, N1 и N2 эпидемических штаммов вирусов гриппа А и эволюционных линий вирусов гриппа В.
-Впервые проведена детекция нуклеиновых кислот, комплексов вирусов гриппа с антителами в растворах методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием пленок полианилина в качестве элемента-сенсора.
4 Практическая значимость работы
Установлено, что начало пандемического процесса в Российской Федерации в конце мая 2009г. обусловлено появлением на территории нашей страны нового пандемического штамма вируса гриппа A(HlNl)v. По материалам диссертации подана заявка на изобретение №2009129374/10 «Штамм вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl для разработки средств и методов биологической защиты» (дата подачи 30.07.2009г.). Решение о выдаче патента РФ на изобретение получено 15.09.2010г.
Полученные данные по идентификации и изучению особенностей вирусов гриппа, циркулировавших на территории России и за рубежом, а также по определению основных направлений эволюции гемагглютинина этих вирусов учитывались при прогнозировании эпидемий и отборе кандидатов в вакцинные штаммы. Результаты анализа антигенной структуры и биологических свойств циркулировавших штаммов вирусов гриппа включались в информационные материалы, отсылавшиеся в ВОЗ, НИИ гриппа, Роспотребнадзор Минздравсоцразвития РФ, базовые областные ТУ Роспотребнадзора и в их ФГУЗ «Центры гигиены и эпидемиологии».
В рамках сотрудничества с ВОЗ в штаб-квартиру ВОЗ в Женеве (Швейцария) и Всемирные справочные центры по гриппу в Лондоне (Англия) и Атланте (США) высылались ежегодные отчеты и наиболее актуальные отечественные штаммы, которые затем входили в состав коллекций вирусов этих центров.
В Государственную коллекцию вирусов депонированы оригинальные штаммы, которые определили новые этапы в распространении и изменчивости вирусов гриппа: 3 эпидемических штамма вирусов гриппа А/Москва/68/2007 (H1N1) (ГКВ№2610), А/Москва/40/2008 (H1N1) (ГКВ№2612), А/Москва/45/2007 (H3N2) (ГКВ№2611); 82 пандемических штамма вирусов гриппа A(HlNl)v, полученных в соавторстве с сотрудниками НИИ вирусологии. Вирусы могут быть использованы в качестве кандидатов в вакцинные штаммы, а также для приготовления диагностикумов.
Обосновано применение культуры клеток MDCK для изоляции современных эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В и КЗ - для пандемических штаммов, использование эритроцитов человека 0(1) группы крови при их индикации и идентификации.
Результаты анализа и апробации 10 отечественных ПЦР тест-систем позволяют рекомендовать их как эффективные и специфичные системы для мониторинга циркулирующих современных эпидемических и пандемических штаммов вирусов гриппа в дополнении к классическим методам. Внедрение этих тест-систем в лабораторную практику будет способствовать усовершенствованию лабораторной диагностики гриппа и повышению уровня надзора за гриппом в России.
Результаты исследования нуклеиновых кислот и комплексов антиген-антитело методом ППР могут быть использованы при разработке сенсорных систем для определения вирусов гриппа и противогриппозных антител в растворах.
5 Основные положения, выносимые на защиту
-
В эпидемический период 2006-201 Огг. в России социркулировали вирусы гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В. Антигенный дрейф поверхностных белков НА происходил в направлении эталонных штаммов, рекомендованных ВОЗ.
-
Выявлена общая тенденция к увеличению тропизма эпидемических штаммов вирусов гриппа периода 2006-2009гг. к эритроцитам кур, по сравнению с предыдущими периодами наблюдения. Вирусы гриппа А(НШ1) и В сохраняют тропизм к системе изоляции КЭ, а вирусы гриппа A(H3N2) практически полностью утратили тропизм к КЭ.
-
С мая 2009г. в России установлен факт циркуляции представителей вирусов гриппа A(HlNl)v, вызвавших пандемию гриппа XXI века в мире. По антигенным свойствам эти штаммы близкородственны эталону A/California/07/09. Пандемические штаммы имеют ярко выраженный тропизм к эритроцитам кур и тканям КЭ и MDCK.
-
Отечественные ПЦР тест-системы, предназначенные для выявления фрагментов генов различных белков вирусов гриппа, могут быть использованы для мониторинга вирусов гриппа человека в вирусологических лабораториях.
-
Для обнаружения нуклеиновых кислот, вирусов и комплексов вирусов гриппа с антителами может быть применен метод ППР с использованием в составе сенсора пленок, содержащих полианилин.
Апробация работы
Результаты работ были представлены на международных симпозиумах и конференциях: Всероссийской научной конференции «Эпидемиология, лабораторная диагностика и профилактика вирусных инфекций» (Санкт-Петербург, 2005); IV, VII, VIII Российских конгрессов детских инфекционистов «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей» (Москва, 2005, 2008, 2009); Международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2006); International Conference Infections and digestive tract diseases (France, Paris, 2006); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); X International Symposium on Respiratory Viral Infections (Singapore, 2008); I, II, III Конференции молодых ученых НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН (Москва, 2008, 2009, 2010); V Конференции молодых ученых с международным участием; «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008); IV Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008); Third European Influenza Conference (Vilamoura, Portugal, 2008); Пятом московском международном конгрессе «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009); XVI и XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009, 2010); II Научно-практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ» (Москва, 2009); ERS Annual Congress (Austria, Vienna, 2009); 14* Congress of the APSR and 3rd Joint Congress
of the APSR/ACCP (Korea, Seoul, 2009); Всероссийской научной конференции «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2009); Options for the Control of Influenza VII (Hong Kong SAR, China, 2010); Rusnanotech. Nanotechnology. Internationa] Forum (Москва, 2010); Всероссийская научно-практическая конференция «Вакцинология-2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней (Москва, 2010).
В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела экологии вирусов с Центром экологии и эпидемиологии гриппа и апробационного совета ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского 21 октября 2010г.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 31 научная работа, в том числе 9 статей в реферируемых российских научных журналах, 1 заявка на патент и материалы докладов в сборниках российских и международных конгрессов и конференций.
Объем и структура диссертации
