Введение к работе
з 1.
Актуальность темы. В связи с интенсивным развитием промышленного птицеводства, возникновением новых и изменением уже известных инфекционных болезней птиц, против которых проводится профилактическая вакцинация, требуется разработка чувствительных, высокоспецифичных и поддающихся автоматизации методов оценки иммунного статуса птиц. Своевременный мониторинг инфекционных болезней птиц является неотъемлемой частью комплекса мероприятий, направленных на профилактику этих заболеваний, что предусматривает внедрение в практику диагностических исследований, отвечающих современному уровню развития науки.
Несмотря на то, что традиционные иммунологические методы по-прежнему широко используются в ветеринарной практике, метод иммуно-ферментного анализа (ИФА) занял ведущее место при проведении рутинных исследований. Преимущества ИФА как метода (скорость, чувствительность, специфичность, безопасность, возможность автоматизации процесса), широкое применение коммерческих наборов для ИФА в национальных программах борьбы с инфекционными болезнями птиц во многих странах Западной Европы и Америки определяют его одним из ведущих диагностических тестов. Высокая эффективность мониторинга инфекционных заболеваний может быть достигнута только в том случае, когда методы диагностики доступны для региональных и производственных лабораторий и широко применяются в их практической работе.
В течение последнего десятилетия в промышленном птицеводстве были предприняты попытки модернизации серологической диагностики с применением иммуноферментного анализа. Для увеличения количества тестируемых проб и уменьшения расхода реактивов и трудозатрат была проведена оценка различных методик определения в ИФА титров антител при исследовании проб сывороток крови птиц в одном разведении. (Snyder D. В., 1984, 1985; Penzes Z., 1992).
Крупнейшие фирмы - производители иммуноферментных наборов для диагностики болезней птиц (IDEXX (США), Synbiotics (KPL,CUIA), Guildhay (Великобритания), Biochek (Голландия)) при постановке реакции в одном разведении для расчёта титра антител в сыворотке крови выбрали линейную зависимость логарифма титра (lg Т) от величины логарифма S/P отношения (отношение оптической плотности испытуемой пробы к оптической плотности положительного контроля).
Применение измерительного оборудования, в частности, спектрофотометров для считывания значений оптической плотности в микропланшетном
формате, позволило разработать методологию тестирования большого количества проб сывороток одновременно против нескольких антигенов. Это, в свою очередь, привело к созданию и внедрению в ветеринарную практику специализированных компьютерных программ не только для перевода оптической плотности в числовое значение точного титра, но и для автоматической обработки, хранения и создания баз данных (Snyder D.B, 1984).
Наиболее актуальным для промышленного птицеводства является мониторинг списочных (особо опасных) и экономически значимых болезней кур - ньюкаслской болезни (НБ), гриппа птиц (ГП), инфекционной бурсаль-ной болезни (ИББ), инфекционного бронхита кур (ИБК), синдрома снижения яйценоскости-76 (ССЯ-76), реовирусной инфекции птиц (РВП), инфекционного энцефаломиелита птиц (ИЭП), респираторного микоплазмоза и мико-плазменного синовита, вызываемых Mycoplasma gallisepticum (МГ) и Mycoplasma synoviae (МС), которые определили перечень создаваемых отечественных диагностических тест-систем.
Гибель птиц при вспышках НБ и ГП, особенно молодой, может достигать 100%. По данным МЭБ, с июля 2008 по июль 2009 гг. официально зарегистрированы вспышки ньюкаслской болезни в 87 странах мира (OIE, ), в том числе и в России. По данным Россельхознадзора, всего с 2005 по 2008 гг. в России было выявлено 179 очагов высокопатогенного гриппа H5N1 в 20 субъектах, суммарные потери от которого составили 2,8 млн. голов птицы.
С середины 70-х гг. ИББ и ИБК широко распространены практически во всех странах с развитым промышленным птицеводством. При вспышках ИББ заболевание охватывает практически все поголовье, летальность может достигать 90% (Chette N., 1989), при этом переболевшие птицы приобретают восприимчивость к большинству инфекционных болезней вирусной и бактериальной этиологии (Rosenberger J., 1978). Экономические потери при ИБК складываются в основном из снижения яичной и мясной продуктивности, вынужденной выбраковки заболевшей птицы, высокой летальности молодняка до 30-дневного возраста. Ситуация осложняется регулярным появлением новых вариантов вируса ИБК с низким уровнем родства к традиционным вакцинным штаммам. (Bochkov Y. А. е.а., 2006, Torregino С. е.а., 2008)
Реовирус птиц вызывает развитие теносиновита, малабсорбционного синдрома, заболевания респираторного и кишечного трактов. Ежегодный ущерб, наносимый птицеводству в США от болезней скелета у домашних птиц, основными возбудителями которых являются в равной степени реовирус и М.synoviae, составляют от 80 до 120 млн. долларов (Sullivan Т. V.,1994).
Экономический ущерб от болезней, вызываемых M.gallisepticum и M.synoviae, складывается из потерь, связанных с гибелью эмбрионов и цыплят, снижением массы тела птиц, уменьшением яйценоскости, оплодотворяе-мости яиц, выводимости цыплят (Ley et al., 2003, Kleven S.H., 2003).
В крупных птицеводческих хозяйствах синдром снижения яйценоскости -76 приносит ущерб из-за снижения яичной продуктивности и качества товарного яйца. (Eck J.H.,1982).
Инфекционный энцефаломиелит вызывает заболевание кур, которое охватывает практически все поголовье в промышленном птицеводстве как мясного, так и яичного направления, причем летальность может составлять 20-50%. (CalnekB.W, 1997, 1998)
Необходимость анализа результатов исследования значительного числа проб при массовом обследовании поголовья, а также хранения полученных данных делает актуальной задачу автоматизации учета результатов ИФА. Существующие программы компьютерной поддержки ИФА, как правило, разрабатываются фирмой-изготовителем диагностикумов и предназначены для работы только с наборами данной фирмы. Таким образом, возникла необходимость разработать универсальную компьютерную программу, в которой предусматривалась бы возможность работы с наборами для ИФА и спек-трофотометрами-ридерами разных производителей.
Применение в диагностических исследованиях наборов и реактивов зарубежного производства существенным образом отражается на стоимости анализов и делает отечественную ветеринарию зависимой от импортных поставок и состояния мирового рынка. В этом аспекте разработка отечественных высокочувствительных, надежных и относительно недорогих диагностикумов является важной задачей.
Объем проводимых мониторинговых исследований болезней птиц с каждым годом увеличивается и требует принципиально новых подходов к технологии тестирования. За рубежом в ведущих ветеринарных диагностических лабораториях, в частности референтных по особо опасным болезням, в последние годы активно внедряются новые методы постановки ИФА, включая основанные на технологии высокопроизводительного скрининга (Cheu М., 2001, McGiven J., 2007) с применением роботизированных устройств. Замена «ручных» технологий серологических исследований на автоматизированные позволяет достичь повышения воспроизводимости результатов, стандартизации процесса исследований и их автоматического поддержания на соответствующем уровне, повышения производительности и безопасности работы персонала.
Цели и задачи исследования. Основной целью наших исследований было создание системы комплексного серологического мониторинга на основе иммуноферментного анализа для выявления и количественной оценки специфических антител к возбудителям девяти наиболее экономически значимых инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, ССЯ-76, РВП, ИЭП, МГ, МС) при исследовании проб сывороток крови в одном разведении и ее внедрение в промышленное птицеводство.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-усовершенствовать методики очистки и концентрирования антигенов возбудителей НБ, ГП, ИБК, ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП, МГ, МС, используемых в качестве компонентов иммуноферментных тест-систем;
-оптимизировать схемы иммунизации кур для получения специфических контрольных положительных сывороток;
-разработать иммуноферментные тест-системы для выявления и количественного определения уровня антител в сыворотках крови кур к возбудителям НБ, ГП, ИБК, ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП, МГ, МС при тестировании в одном разведении;
-определить чувствительность и специфичность при сравнительном анализе данных, полученных с помощью разработанных тест-систем на основе ИФА, базовых реакций и коммерческих иммуноферментных наборов зарубежных производителей, зарегистрированных на территории РФ;
-определить диагностическую значимость результатов, полученных с использованием разработанных тест-систем на основе ИФА, для изучения эпизоотической ситуации в птицехозяйствах и оценке иммунитета после применения живых и инактивированных вакцин;
- разработать научно-техническую документацию и регламенты для опытно-промышленного производства коммерческих наборов в двух вариантах: для визуальной детекции (на 40 проб) и инструментального учета (на 180 проб);
-разработать универсальную компьютерную программу регистрации, сбора, анализа и хранения результатов с учетом возможности использования наборов для диагностики болезней птиц отечественных и ведущих зарубежных фирм-производителей;
-разработать технологию производства коммерческих наборов с внедрением автоматизированных роботизированных устройств;
-провести оценку качества разработанных тест-систем в сравнительных испытаниях, проводимых международными референтными лабораториями МЭБ и ФАО;
-внедрить в работу ветеринарных лабораторий и птицефабрик комплексную систему серологической оценки иммунного статуса кур разного возраста, основанную на ИФА, с использованием комплекта стандартизированного оборудования и универсальной компьютерной программы обработки и хранения полученных результатов.
Научная новизна. Впервые разработаны отечественные иммунофер-ментные тест-системы на основе непрямого варианта ИФА для выявления и количественной оценки специфических антител к возбудителям основных экономически значимых инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, ССЯ-76, РВИ, ИЭП, МГ и МС) при тестировании проб сывороток крови в одном разведении.
Впервые в России создана комплексная система серологического мониторинга в птицеводстве, основанная на методологии ИФА с применением отечественных диагностических наборов, сертифицированного оборудования, реагентов и компьютерной программы, которая обеспечивает получение надежных данных об иммунном статусе птицепоголовья.
Проведена сравнительная оценка чувствительности и специфичности реакций по результатам, полученным с помощью разработанных тест-систем на основе ИФА, базовых реакций (РДП, РТГА) и коммерческих наборов зарубежных производителей, зарегистрированных на территории РФ.
Определена диагностическая значимость результатов, полученных с применением разработанных тест-систем на основе ИФА при оценке трансо-вариального иммунитета, изучении динамики накопления антител после применения живых и инактивированных вакцин в промышленном птицеводстве.
Разработана и сертифицирована компьютерная программа регистрации, анализа и хранения результатов для работы с отечественными и зарубежными иммуноферментными коммерческими наборами ведущих фирм-производителей .
Утверждена научно-техническая документация и регламент для опытно-промышленного производства коммерческих наборов в двух вариантах: при визуальной детекции и инструментальном учете с применением программного обеспечения.
Качество лабораторных исследований с применением коммерческих наборов для ИФА на основе разработанных тест-систем подтверждено результатами международных сравнительных испытаний, проведенных аккредитованной лабораторией (GD, Голландия) в 2006-2008 гг. при тестировании
зашифрованных проб сывороток с разным уровнем антител к НБ, ГП, ИБК, ИББ, МГ и МС.
Научная новизна исследований подтверждена 3 патентами на наборы и свидетельством на компьютерную программу «СИНКО-ИФА», зарегистрированную в Российском агенстве по патентам и товарным знакам.
Практическая значимость. Методики, разработанные в ходе научно-исследовательских работ по теме диссертации, включены в два сборника: "Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом" (1998 г.) и "Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц с использованием серологических реакций" (2008 г.), утвержденные Россельхоз-надзором в качестве пособия для работников ветеринарных диагностических лабораторий.
Результаты экспериментальной работы вошли в нормативные документы по изготовлению и контролю 16 наборов для ИФА, утвержденных Рос-сельхознадзором.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 81 научная работа, в том числе 22 в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК РФ.
Апробация работы. Основные материалы исследований по теме диссертации опубликованы, доложены и обсуждены: на конференциях, проводимых в ФГУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир, 1995, 1997-2000, 2003, 2008); на международной конференции «Птицеводство - мировой и отечественный опыт», Москва, 2002; на Всероссийском совещании-семинаре директоров ветлабораторий - субъектов РФ «Совершенствование ветеринарной лабора-торно-диагностической работы в Российской Федерации», Брянск, 2004; Международных ветеринарных конгрессах по птицеводству, Москва, 2005, 2006; на Международных научных конференциях и конгрессах в Российской Федерации (Москва, 2001; Казань, 2005; Покров, 1999, 2000; Новосибирск, 2008),в Украине (Харьков, 2001-2003, 2006-2008; Крым, 2006-2008), Казахстане (Ал-маты, 2000), Республике Беларусь (Минск, 2000; Витебск, 2001), Марокко (Маракеш, 2009), Австрии (Вена, 2009), на заседаниях учёного совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 1995-2009 гг.
Основные положения, выносимые на защиту: - разработка иммуноферментных тест-систем для выявления и количественного определения антител к возбудителям девяти экономически значимых инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, ССЯ-76, РВП, ИЭП, МГ и МС) при исследовании проб сывороток крови в одном разведении;
-результаты определения корреляционной зависимости при сравнении данных, полученных с использованием разработанных тест-систем, базовых тестов и коммерческих наборов зарубежного производства;
-программное обеспечение для учета, обработки и хранения результатов анализа «СИНКО-ИФА»;
-результаты исследований сывороток крови кур с применением разработанных наборов для ИФА при ретроспективной диагностике заболеваний и оценке поствакцинального иммунитета после применения живых и инактиви-рованных вакцин в птицехозяйствах РФ в 1995-2008 гг.;
-результаты лабораторных исследований в международных сравнительных испытаниях, проведенных аккредитованной лабораторией (GD, Голландия) в 2006-2008 гг.;
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 322 страницах, иллюстрирована 55 таблицами и 41 рисунками. Список цитируемой литературы включает 363 источников, из них 311 иностранных.
Исследования по диссертационной работе выполнены в 1993-2009 гг. в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (до 2003 г. «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных» (г. Владимир).
Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в планировании, проведении и анализе экспериментов. Имена соавторов, выполнявших отдельные этапы работы, указаны в соответствующих публикациях, за что автор выражает им глубокую благодарность.
