Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы.
1. Характеристика энтеровирусов 9
2. Энтеровирусы в патологии человека 24
3. Методы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций... 36
II. Материалы и методы.
2.1. Нуклеотидные последовательности геномных РНК пикорнавирусов 45
2.2. Штаммы вирусов 45
2.3. Исследуемый материал 48
2.4. Приготовление воды, свободной от РНКаз 48
2.5. Экстракция РНК энтеровирусов 48
2.6. Олигонуклеотидные праймеры 49
2.7. Постановка реакции обратной транскрипции 49
2.8. Постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР) 50
2.9. Электрофорез ДНК 50
2.10. Анализ кДНК энтеровирусов методом ПДРФ 51
2.11. Постановка SSCP 51
2.12. Статистический анализ результатов 52
III. Результаты исследований и их обсуждение.
3..1. Унификация метода ОТ-ПЦР для выявления и дифференциации энтеровирусов человека.
3. 1.1. Сравнительный анализ 5'-НТР генома энтеровирусов... 53
3. 1.2. Оценка специфичности разработанных вариантов ПЦР 60
3.1.3. Оценка метода солевой очистки биопроб 63
3.2. ПЦР-ПДРФ анализ 5'-НТР генома энтеровирусов человека .
3.2.1. Разработка схемы ПДРФ - дифференциации энтеровирусов 66
3.2.2. Типирование изолятов энтеровирусов методом ПДРФ 79
3.3. SSCP-анализ кДНК 5' -НТР генома энтеровирусов 84
3. 4. Характеристика особенностей циркуляции нейротропных энтеровирусов среди населения Нижнего Новгорода в 1999-2002 гг 93
3.4.1. Обнаружение энтеровирусов у больных с нейроинфекцией 93
3.4.2. Характеристика энтеровирусных серозных менингитов в Нижнем Новгороде 98
Заключение 105
Выводы 117
Список литературы 118
- Энтеровирусы в патологии человека
- Приготовление воды, свободной от РНКаз
- Анализ кДНК энтеровирусов методом ПДРФ
- ПЦР-ПДРФ анализ 5'-НТР генома энтеровирусов человека
Введение к работе
Актуальность проблемы. Энтеровирусы человека (сем. Picornaviridae, род Enterovirus), характеризуются иммунологическим и генетическим многообразием. Подавляющее большинство энтеровирусов человека являются патогенными, вызывая заболевания, полиморфные по клиническим проявлениям (полиомиелит, нейропатии, серозный менингит, миокардиты, гастроэнтерит, респираторные заболевания, конъюнктивиты и т.д.) и различные по тяжести течения. Многие заболевания энтеровирусной природы представляют важную проблему здравоохранения, некоторые из них имеют тенденцию к эпидемическому распространению. Установлена этиологическая связь энтеровирусной инфекции с патологией матери, плода и ребенка [7, 12, 22, 23, 25, 44].
Значимость энтеровирусов в инфекционной патологии человека определяет необходимость их своевременного выявления, а при расшифровке случаев групповой заболеваемости - и типирования возбудителя. Множество иммунологических типов энтеровирусов, различная чувствительных клеточных культур к отдельным представителям рода предопределяют длительность и трудоемкость традиционных методов выявления энтеровирусов и делают актуальной разработку новых подходов к решению проблемы обнаружения и дифференциации энтеровирусов. Прогресс молекулярной биологии и открытие принципов ПЦР дали возможность разработки альтернативных экспрессных, высокочувствительных и специфичных методов обнаружения энтеровирусов в клиническом материале и объектах внешней среды, что расширяет методическую базу эпидемиологического надзора за циркуляцией неполиомиелитных энтеровирусов и вирусов полиомиелита.
Цель исследования: Разработать комплексный метод выявления и дифференциации РНК энтеровирусов и охарактеризовать особенности циркуляции нейротропных энтеровирусов среди населения Н. Новгорода на современном этапе.
Задачи исследования:
1. С использованием компьютерных программ провести сравнительный анализ известных нуклеотидных последовательностей генома энтеровирусов. Подобрать олигонуклеотидные праймеры для обнаружения и дифференциации энтеровирусов человека.
2. Оптимизировать метод ОТ-ПЦР для обнаружения РНК энтеровирусов в различных биологических субстратах.
3. Провести разработку метода ПДРФ-дифференциации 5 -НТР генома энтеровирусов человека.
4. С использованием типовых штаммов энтеровирусов человека и РНК энтеровирусов, выделенных от больных охарактеризовать SSCP-типы 5 -НТР генома. Оценить возможность применения SSCP-типирования фрагментов кДНК генома энтеровирусов в эпидемиологической практике.
5. Определить частоту обнаружения энтеровирусов у больных серозным менингитом и другими нейроинфекциями, охарактеризовать гетерогенность энтеровирусов, циркулировавших в Н. Новгороде в 1999-2002 гг.
Научная новизна и практическая значимость работы. Разработаны оригинальные методические подходы для выявления и дифференциации РНК энтеровирусов, основанные на анализе одного и того же участка 5 -НТР генома:
впервые подобрана серия олигонуклеотидных праймеров, позволяющая проводить выявление РНК энтеровирусов человека методом ОТ-ПЦР с одновременной дифференциацией на 2 геногруппы по 5 -НТР генома.
впервые подобран и применен на практике оригинальный набор рестриктаз для анализа методом ПДРФ 5 -НТР генома энтеровирусов геногруппы II с целью идентификации генетических маркеров полиовирусов вакцинного происхождения. Новизна предложенного способа выявления и дифференциации энтеровирусов подтверждена патентом на изобретение №2189396 «Способ обнаружения и дифференциации РНК энтеровирусов». Приоритет от 27.10.2000.
впервые в России дана характеристика SSCP-типов 5 -НТР генома энтеровирусов человека. Показаны многообразие SSCP-типов 5 -НТР генома энтеровирусов человека и возможность использования в качестве эпидемиологического маркера.
впервые комплексное исследование 5 -НТР генома энтеровирусов было применено при расшифровке групповых заболеваний. Установлена роль энтеровирусов в возникновении 3-х групповых заболеваний ОКИ.
Предложенный комплекс методов обнаружения и дифференциации энтеровирусов человека (ПЦР, ПЦР-ПДРФ и ПЦР-SSCP) был применен в совместной работе с вирусологической лабораторией ЦГСЭН в Нижегородской области при обследовании больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию и анализе проб сточных вод с очистных сооружений Нижегородской области. Полученные результаты использовались в эпиднадзоре за энтеровирусными инфекциями.
Внедрение результатов исследования в практику.
Методические рекомендации № 2001/121 «ПЦР-ПДРФ выявление и дифференциация РНК энтеровирусов человека». Утверждены МЗ РФ 31.05.2001г.
Методические рекомендации «Энтеровирусные инфекции. Этиология, клиника, диагностика и профилактика». Утверждены Департаментом здравоохранения Нижегородской области в 2000 г.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Комплекс оптимизированных приемов, включающий бесфенольную экстракцию РНК из разнообразного вируссодержащего материала, детекцию РНК методом ОТ-ПЦР с помощью сконструированных праймеров, комплементарных консервативным участкам 5 -НТР генома, обеспечивает надежное выявление энтеровирусов человека в пробах от больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию и объектах внешней среды с одновременным типированием на две 5 -НТР геногруппы.
2. Профиль ПДРФ и SSCP-тип 5 -НТР генома энтеровирусов являются штаммовыми признаками и могут быть использованы в качестве эпидемиологических маркеров.
3. Территория Нижнего Новгорода в 1999-2002 гг. характеризовалась низкой активностью циркуляции и разнообразием генетических вариантов нейротропных энтеровирусов.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на практическом симпозиуме «Клиническая лаборатория на пороге XXI века: синтез традиций и новаций (аналитика, диагностика, техника, экономика)», проходившем в рамках Национальных дней России-99 (Москва, 12-14 октября 1999 г.).
Материалы диссертации обсуждались на заседаниях Ученого Совета Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной МЗ РФ и проблемных научно-практических семинарах института.
Диссертация апробирована на межлабораторной конференции Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной 25 февраля 2003 г.
Объем и структура диссертации.
Материалы диссертации изложены на 145 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 262 литературных источника отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 17 рисунками и 10 таблицами.
По результатам диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Работа выполнена в рамках научной тематики Нижегородского НИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной в качестве фрагмента № 737/096/015 к договору № 737 «Снижение инфекционной заболеваемости в условиях социально-экономического неблагополучия», № гос. регистрации: 01200009251.
Энтеровирусы в патологии человека
Энтеровирусные инфекции способны вызывать поражения различных систем органов и тканей и вследствие этого характеризуются широким полиморфизмом клинических проявлений (полиомиелит, ОВП, серозный менингит и энцефалит, миокардиты, эпидемическая миалгия, конъюнктивит, ящуроподобный синдром, острые респираторные заболевания, гастроэнтерит и др.). Многолетний опыт изучения энтеровирусных инфекций показал, что разные штаммы энтеровирусов одного и того же серотипа могут вызывать заболевания с различной симптоматикой. Во время вспышек энтеровирусных инфекций при однотипной этиологии наряду с преобладающей формой заболевания у части больных нередко наблюдаются другие синдромы или их комбинации. [7, 12]. Так, во время эпидемических вспышек в Малайзии, Сингапуре, Австралии в 1997 г. и на Тайване в 1998 г., вызванных энтеровирусом 71, ящурободобный синдром был основной манифестной формой заболевания. В ряде случаев он ассоциировался с симптомами поражений нервной системы; инфекция проявлялась так же в виде герпангины, серозного менингита, менингоэнцефалита, энцефалита или острых вялых параличей [120, 159, 165]. В то же время, в результате многочисленных клинических наблюдений, эпидемиологических и лабораторных исследований установлено, что заболевания с идентичными клиническими проявлениями могут быть связаны с энтеровирусами разных групп и серотипов [7].
Энтеровирусы распространены по всему земному шару. Их резервуаром может служить больной человек или здоровый вирусоноситель, выделение энтеровирусов человека возможно и от домашних животных или насекомых (мух). У больных вирус выделяется из глотки в течение 1-2 недель и с фекалиями в течение нескольких недель и месяцев. Передача энтеровирусов осуществляется в результате реализации фекально-орального или аспирационного механизма [7, 52].
Самое распространенное проявление энтеровирусной, в том числе и полиовирусной, инфекции - энтеровирусная лихорадка или малая болезнь. Это острое лихорадочное кратковременное заболевание без выраженных симптомов локальных поражений нервной системы, скелетных мышц или внутренних органов, которые характерны для других заболеваний энтеровирусной этиологии. Это заболевание регистрируется в виде спорадических случаев или небольших вспышек. Как правило, энтеровирусная лихорадка в значительной части случаев встречается во время вспышек энтеровирусной инфекции, когда преобладают другие синдромы [7].
Поражения нервной системы. Энтеровирусы обладают выраженной нейротропностью. При энтеровирусной инфекции могут наблюдаться несколько типов поражений нервной системы: менингиты, энцефалиты, миелиты.Полиомиелит - самое значимое в патологии человека заболевание энтеровирусной этиологии. Для него характерны общая лихорадка, в части случаев возникают воспалительные изменения в сером веществе спинного мозга и некоторых других отделах ЦНС с развитием вялых атрофических параличей и парезов преимущественно ног, рук и туловища [7]. Возбудителями полиомиелита являются вирусы полиомиелита трех серотипов. Это заболевание сопровождало человечество с древних времен, но до середины XIX века встречалось преимущественно в виде спорадических случаев. Во второй половине XIX века Medin описал первую эпидемию в Швеции, а к середине XX века полиомиелит превратился в грозную эпидемическую болезнь, периодически поражавшую тысячи и десятки тысяч человек, из которых около 10% умирали и примерно 40% становились инвалидами [7]. После массовой иммунизации живой вакциной, проводимой во многих странах с начала 60-х гг. XX века, эпидемические вспышки полиомиелита были ликвидированы, но в тех странах, где вакцинопрофилактика не проводилась, заболеваемость возрастала. В 1988 г. на 41-й сессии Генеральной ассамблеи Всемирной организации здравоохранения была принята программа искоренения полиомиелита к 2000 г. Под искоренением понимают не только ликвидацию клинических форм болезни, но и полное исключение циркуляции вирусов полиомиелита внутри популяции. При выполнении программы искоренения полиомиелита, благодаря массовым вакцинациям ОПВ, было достигнуто резкое снижение, а в ряде стран полное прекращение заболеваемости паралитическим полиомиелитом, вызываемым диким полиовирусом. Однако на завершающем этапе ликвидации полиомиелита встал вопрос: как прекратить применение оральной полиомиелитной вакцины и циркуляцию полиовирусов вакцинного происхождения? Даже на территориях, свободных от циркуляции диких полиовирусов, отказ от массовой вакцинации ОПВ возможен только после решения ряда проблем. После прекращения иммунизации живой вакциной, вакцинные полиовирусы будут некоторое время циркулировать в популяции. Эта циркуляция будет поддерживаться за счет неиммунного населения, лиц с низким местным кишечным иммунитетом к полиомиелиту и больных с хронической полиовирусной инфекцией. В то же время известно, что благодаря высокой генетической изменчивости, при репродукции в клетках кишечника вакцинные полиовирусы восстанавливают нейровирулентность и способны вызвать заболевание. В последние годы в ряде стран зарегистрированы вспышки полиомиелита, связанные с полиовирусами вакцинного происхождения [8, 36, 37, 79, 102, 171]. Как вариант решения этой задачи, Сэйбиль В.Б. с соавторами предлагают к рассмотрению возможность использования живой энтеровирусной вакцины, приготовленной из апатогенных энтеровирусов, в качестве интерферирующего агента для вытеснения из популяции оставшихся полиовирусов вакцинного происхождения [35, 37]. Создание такой вакцины, возможно, станет полезным и при решении еще одной проблемы, возникающей в связи с прекращением иммунизациии ОПВ. Известно, что вирусы вакцины Сэйбина обладают интерферирующими свойствами в отношении неполиомиелитных энтеровирусов, благодаря чему после начала массовой иммунизации ОПВ произошло значительное снижение заболеваемости, связанной с энтеровирусными инфекциями. Таким образом, прекращение иммунизации ОПВ может привести к расширению циркуляции энтеровирусов и росту числа заболеваний энтеровирусной природы. [36].
Полиомиелитоподобные заболевания в основных чертах сходны с полиомиелитом и проявляются в виде тех же синдромов - от лёгкого лихорадочного заболевания до паралитической болезни различной выраженности и бульбарных поражений с высокой летальностью, но их этиология не связана с полиовирусами. Зарегистрированные эпидемические вспышки полиомиелитоподобных заболеваний были вызваны вирусами Коксаки А 7 - АБ IV и энтеровирусом 71. Спорадическая заболеваемость, кроме названных вирусов, может быть вызвана вирусами Коксаки А 9, В 2 - В 5, ECHO 2, 4, 6, 9, И, 30 [7, 36].Асептический серозный менингит и энцефалит. Вирусный серозный менингит является широко распространенным заболеванием во всем мире. Так, в США ежегодно регистрируется более 50 000 случаев асептического менингита. По литературным данным наиболее частой причиной асептических серозных менингитов в последние десятилетия являлись энтеровирусы, вирусы простого герпеса, вирус mumps, реже причиной серозного менингита были вирусы паротита, цитомегаловирус, вирус краснухи, аденовирусы и др. [101, 169].
Серозный менингит, один из наиболее частых клинических вариантов заболеваний энтеровирусной этиологии, представляет собой острое заболевание, протекающее с воспалением оболочек головного мозга, и, как правило, заканчивается полным выздоровлением. В ряде случаев наряду с симптомами менингита наблюдаются признаки энцефалита. Болезнь поражает преимущественно детей, подростков и лиц молодого возраста. Энтеровирусный серозный менингит и энцефалит встречаются как в виде спорадических случаев, так и в виде эпидемических вспышек, охватывающих десятки, сотни и даже тысячи человек [7, 12].
В результате многолетнего изучения спорадических случаев и эпидемий энтеровирусных менингитов установлено, что серозный менингит способны вызывать большинство типов энтеровирусов [81, 141, 222]. Это заболевание может быть и проявлением полиовирусной инфекции. Как причина эпидемических вспышек и подъёма заболеваемости серозными менингитами зарегистрированы вирусы Коксаки А 7 и 9, Коксаки В 1-6, ECHO 3, 4, 6, 7, 9-11 ,13, 20, 27 и 30, энтеровирус 71. В последнее десятилетие наиболее частым этиологическим агентом эпидемических вспышек энтеровирусных менингитов и энцефалитов во многих регионах земного шара был вирус ECHO 30 [58, 81, 177, 222, 243]. В прежние годы таковым являлся вирус ECHO 9 [7, 147]
Медленные инфекции. В последнее десятилетие дискутируется вопрос о возможном участии энтеровирусов в патогенезе медленных инфекций, в частности амиотрофического латерального склероза (АЛС), для которого характерно поражение мотонейронов. Предполагают, что среди различных этиологических причин этого заболевания может быть персистентная энтеровирусная инфекция [107]. В пользу этой гипотезы свидетельствуют случаи выявления РНК энтеровирусов в тельцах мотонейронов спинного мозга
Приготовление воды, свободной от РНКаз
В работе была использована 688 проб (фекалии, носоглоточные смывы, спинномозговая жидкость, сыворотки крови) от 280 больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию, госпитализированных в инфекционные стационары Нижнего Новгорода в период 1999-2002 гг. Исследовано 45 проб от 22 больных и 21 контактного лица, собранных при расшифровке групповых инфекционных заболеваний. В работе были исследованы 74 концентрата проб сточных вод, отобранных на очистных сооружениях г. Нижнего Новгорода и городов Нижегородской области. Пробы сточных вод были концентрированы с использованием пакетов с макропористым стеклом [26]. Сбор и анализ проб проводился в совместной работе с вирусологической лабораторией ЦГСЭН в Нижегородской области. К трижды дистиллированной воде добавляли 0,001 % диэтилпирокарбоната и при плотно закрытой крышке оставляли на ночь при комнатной температуре. Для удаления диэтилпирокарбоната воду инкубировали в кипящей водяной бане в течение 2-х часов. Обработанную воду разделяли на аликвоты и хранили при минус 20С. К пробе (вируссодержащая культуральная жидкость, осветленные фекальные экстракты, носоглоточные смывы, СМЖ, сыворотки крови, концентраты сточных вод) добавляли равный объем гуанидинового лизирующего буфера, содержащего 4М гуанидинтиоизоцианата, 100 мМ ЭДТА, 2 % саркозила, 1 % (3-меркаптоэтанола, 50 мМ Трис-HCl, рН 7,6. После инкубации в течение 10 мин при 65С депротеинизацию раствора проводили двумя способами: с использованием фенола (а) или бесфенольным способом (б): а) суспензию обрабатывали равным объемом смеси водонасыщенный фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25:24:1), центрифугировали в течение 5 мин при 3000 об/мин, водную фазу отбирали. Повторную обработку проводили смесью хлороформ: изоамиловый спирт (24:1). К водной фазе добавляли 0,1 объема 2М ацетата натрия (рН 4,0), равный объем изопропанола, охлаждали в течение 30 мин при минус 20С и центрифугировали в течение 15 20 мин при 16 000 об/мин. Осадок отмывали 70 % этанолом, высушивали и ресуспендировали в 2мМ растворе ДТТ [27]. б) к суспензии добавляли 3-х кратный объем 100 % раствора перхлората натрия, после встряхивания центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин. К водной фазе добавляли равный объем изопропанола, перемешивали, охлаждали в течение 30 мин при минус 20С и центрифугировали в течение 15-20 мин при 16 000 об/мин.
Осадок отмывали 70 % этанолом, высушивали и ресуспендировали в 2мМ растворе ДТТ[6]. Сконструированные олигонуклеотидные праймеры для специфичной амплификации участков генома энтеровирусов человека, кодирующих 5 НТР, были синтезированы в фирме «Литех», г. Москва. Реакцию обратной транскрипции проводили в объеме 5 мкл. В пробирку объемом 0,5 мл вносили 2,8 мкл РНК, 0,5 мкл обратного олигонуклеотидного праймера в количестве 0,2 мкМ и покрывали минеральным маслом. РНК денатурировали при 94С в течение 1 мин и охлаждали при комнатной температуре. К РНК под масло вносили 1,7 мкл реакционной смеси, содержащей 50мМ Трис-HCl (рН 8,3), 7мМ MgCl2, 40мМ КС1, ЮмМ DTT, 0,1мг/мл БСА, 0,5 мМ дНТФ, 5 е.а. РНКзина и 20 е.а. ревертазы M-MLV ("Promega", США). ПЦР проводили в пробирках для ПЦР объемом 0,5 мл. Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл при выявлении РНК или 50 мкл при синтезе фрагментов для ПДРФ. Реакционная смесь содержала 10 мМ Трис-НСІ (рН 8.8), 50 mM КС1, 1,5 мМ MgCl2, 1,0 % Triton Х-100, по 0,2 мМ каждого из дНТФ, 2,5-5 е.а. Tag- полимеразы («Силекс», Москва), по 0,1 мкМ прямого и обратного олигонуклеотидного праймера. Реакционную смесь покрывали минеральным маслом и инкубировали в амплификаторе «Терцик» фирмы «ДНК-Технология» в режиме: а) при амплификации участка 5 -НТР генома энтеровирусов (94С 30 с; 60С 30 с; 72С 30 с) х 35 для 1 раунда ПЦР и (94С 30 с; 65С 30 с; 72С 30 с) х 25 для 2 раунда ПЦР; б) при синтезе кДНК5з4 для анализа методом ПДРФ (94С 30с; 60С 30 с; 72С 30 с) х 25; в) при синтезе кДНК321 для анализа методом ПДРФ (94С 30 с; 65С 30 с; 72С30с)х25. Электрофорез амплификатов и рестриктных фрагментов ДНК проводили в 1,5-2,5 % агарозном геле, содержащем 5мкг/мл бромида этидия, в течение 1-2 ч при 100 В на гель в трис-боратном буферном растворе (ТББ): 0,089 М трис-борат, 0,002 М ЭДТА, рН 8,0. Перед нанесением пробы на гель к ней добавляли 0,1 объёма буфера для нанесения образцов, содержащего 50 % глицерина и 0,1 % бромфенолового синего. Учет результатов проводили в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм. Размер фрагментов ДНК определяли путем сравнения электрофоретической подвижности исследуемой ДНК с фрагментами ДНК маркера. Перед постановкой реакций рестрикции продукты ПЦР, содержащие кДНК5з4 или кДНК32ь переосаждали. С этой целью к раствору кДНК добавляли 1,0 объема ацетата натрия и 0,6 объема охлажденного изопропанола и центрифугировали 15 мин при 16 000 об/мин. Осадок промывали 70 % этанолом, высушивали и растворяли в воде, свободной от нуклеаз. Реакцию с рестриктазами Ava I, Ava II, Alu I, Bam HI, Cla I, Nco I, Pvu II, Sma I производства фирмы «Promega» проводили в объеме 20 мкл согласно инструкции, в соответствующем каждому ферменту фирменном реакционном буфере и температурном режиме. Продукты рестрикции анализировали методом электрофореза в 2,0 % агарозном геле. К 5-7 мкл смеси продуктов ПЦР добавляли равный объем формамида, содержащего 20мМ ЭДТА, прогревали 5-Ю мин при 94С и помещали в лед на 1-2 мин. Электрофорез денатурированных к ДНК проводили в неденатурирующем 7,5 % ПААГ с 3 % концентрирующим гелем в системе буферных растворов Лэммли: буфер для нижнего геля (4х) - 0,5 М трис-HCl, рН 8,8, 0,4 % додецил сульфат натрия; буфер для верхнего геля (4х) - 0,5 М трис-HCl, рН 6,8, 0,4 % додецил сульфат натрия; электродный буфер - 0,25 М трис-HCl, рН 8,4, 0,192 М глицин, 0,1 % додецил сульфат натрия [153]. Пре-электрофорез проводили в течение 30 мин при 20 мА на гель, электрофорез - в течение 3,5-4,0 ч при 15-20 мА на гель. После электрофореза к гель выдерживали в 0,19 % растворе нитрата серебра в течение 40 мин, затем промывали дистиллированной водой, заливали восстанавливающим раствором (0,75 М NaOH, 0,3 % формальдегид) и экспонировали до развития окраски. Реакцию останавливали погружением геля в 5 % раствор уксусной кислоты [10]. Статистическую обработку результатов проводили общепринятым методом расчета средней ошибки (ш) и показателя существенности и вероятности (t) по Стьюденту:
Анализ кДНК энтеровирусов методом ПДРФ
Перед постановкой реакций рестрикции продукты ПЦР, содержащие кДНК5з4 или кДНК32ь переосаждали. С этой целью к раствору кДНК добавляли 1,0 объема ацетата натрия и 0,6 объема охлажденного изопропанола и центрифугировали 15 мин при 16 000 об/мин. Осадок промывали 70 % этанолом, высушивали и растворяли в воде, свободной от нуклеаз. Реакцию с рестриктазами Ava I, Ava II, Alu I, Bam HI, Cla I, Nco I, Pvu II, Sma I производства фирмы «Promega» проводили в объеме 20 мкл согласно инструкции, в соответствующем каждому ферменту фирменном реакционном буфере и температурном режиме. Продукты рестрикции анализировали методом электрофореза в 2,0 % агарозном геле. К 5-7 мкл смеси продуктов ПЦР добавляли равный объем формамида, содержащего 20мМ ЭДТА, прогревали 5-Ю мин при 94С и помещали в лед на 1-2 мин. Электрофорез денатурированных к ДНК проводили в неденатурирующем 7,5 % ПААГ с 3 % концентрирующим гелем в системе буферных растворов Лэммли: буфер для нижнего геля (4х) - 0,5 М трис-HCl, рН 8,8, 0,4 % додецил сульфат натрия; буфер для верхнего геля (4х) - 0,5 М трис-HCl, рН 6,8, 0,4 % додецил сульфат натрия; электродный буфер - 0,25 М трис-HCl, рН 8,4, 0,192 М глицин, 0,1 % додецил сульфат натрия [153].
Пре-электрофорез проводили в течение 30 мин при 20 мА на гель, электрофорез - в течение 3,5-4,0 ч при 15-20 мА на гель. После электрофореза к гель выдерживали в 0,19 % растворе нитрата серебра в течение 40 мин, затем промывали дистиллированной водой, заливали восстанавливающим раствором (0,75 М NaOH, 0,3 % формальдегид) и экспонировали до развития окраски. Реакцию останавливали погружением геля в 5 % раствор уксусной кислоты [10]. Статистическую обработку результатов проводили общепринятым методом расчета средней ошибки (ш) и показателя существенности и вероятности (t) по Стьюденту: t = 3,29-p 0,001 Методы выявления и генотипирования патогенных микроорганизмов и вирусов на основе ПЦР находят все большее применение в практической медицине. Возможности этого метода таковы, что, при использовании соответствующих серий специфичных олигонуклеотидных праймеров, он позволяет проводить идентификацию геномных последовательностей на уровне семейства, рода, вида, антигенного типа или геноварианта возбудителя. Однако, известные на сегодняшний день варианты ОТ-ПЦР, в каждом случае специфичны лишь для одной из перечисленных систематических единиц пикорнавирусов. Настоящая работа посвящена разработке универсального комплексного метода, при использовании которого выявление и дифференциация РНК энтеровирусов человека может быть осуществлена путем анализа одного и того же фрагмента вирусного генома. Исследования включали унификацию ОТ-ПЦР для выявления и дифференциации энтеровирусов человека, разработку и оценку методов генотипирования, основанных на ПДРФ и SSCP, и характеристику циркуляции нейротропных энтеровирусов среди населения Нижегородской области.
Для решения поставленной задачи было необходимо выбрать область генома энтеровирусов, которая, содержит и консервативные участки, и расположенную внутри вариабельную зону. В этом случае существует возможность конструирования пар универсальных олигонуклеотидных праймеров, специфичных для всех энтеровирусов человека. Анализ вариабельной зоны позволяет проводить дифференциацию РНК, выявленных с помощью праймеров, комплементарных консервативным участкам. Самой обширной высоко консервативной областью генома энтеровирусов является 5 -НТР размером около 750 нуклеотидов. Консервативность этого участка связана с важными функциями, выполняемыми в цикле репродукции вируса. При этом первые 88 нуклеотидов 5 -НТР, которые формируют центр рибонуклеинового комплекса, участвующего в синтезе вирусной РНК, и следующие приблизительно 450 нуклеотидов, формирующие IRES, являются наиболее консервативными [59, 60, 195, 245]. Последние 120-150 нуклеотидов 3 -конца нетранслируемой области, функция которых окончательно не установлена, включают участки, варьирующие у разных штаммов одного серотипа [66, 213]. Как упоминалось выше, по структурным и функциональным свойствам 5 -НТР генома энтеровирусы сходны с риновирусами, но отличаются от кардио-, афтовирусов и вируса гепатита А [55, 129]. Таким образом, структурные свойства 5 -НТР генома вирусов семейства Picornaviridae позволяют подобрать праймеры, с помощью которых можно проводить специфичную амплификацию геномной РНК всех представителей рода Enterovirus, исключая выявление вирусов, принадлежащих другим родам этого семейства. Варианты амплификации РНК энтеровирусов человека с помощью универсальных праймеров, фланкирующих участки 5 -НТР генома, были разработаны в прежние годы. К началу наших исследований предложенные пары праймеров позволяли амплифицировать фрагменты кДНК размером до 160 п.н., которая не является оптимальной для последующей дифференциации методом ПДРФ [83, 216, 217].
Мы поставили задачу разработать вариант ПЦР, в котором синтезируется фрагмент генома, пригодный для последующего рестриктного анализа. При подборе праймеров учитывали следующие критерии: 1) специфичность и универсальность для РНК энтеровирусов человека; 2) достаточный для анализа методом ПДРФ размер амплифицируемого участка, длина фрагментов рестрикции которого позволяла бы осуществить простой, удобный при визуальном чтении гель-электрофорез в агарозе или ПААГ; 3) наличие в амплифицируемом участке вариабельных зон, обеспечивающих возможность дифференциации. В середине 1990-х гг. в результате филогенетического анализа 5 -НТР генома энтеровирусов человека были выделены 2 генетических кластера: первый включал вирусы Коксаки А 9 и 16, вирусы Коксаки В 1-6 , вирусы ECHO 6, 9, 11 и 12, энтеровирусы 69 и 71; другой - полиовирусы, вирусы Коксаки А 21 и 24, энтеровирусы 68 и 70 [203]. К моменту начала наших исследований были определены полные последовательности 5 -НТР генома многих штаммов большинства серотипов энтеровирусов. Представляло интерес установить филогенетические отношения новых охарактеризованных штаммов энтеровирусов. С использованием программы Clustal X мы построили филогенетическое древо на основе анализа 5 -НТР генома размером 750 нуклеотидов, с включением новых последовательностей штаммов энтеровирусов, зарегистрированных в GenBank. Результаты анализа представлены на рисунке 2, где видно распределение энтеровирусов на те же 2 геногруппы. Первая геногруппа включает вирусы Коксаки В1-6, вирусы ECHO 5, 6, 9, 11, 25, 30 вирусы Коксаки А 9 и 16, энтеровирусы 71 и Yanbian. В этот же кластер вошли и штаммы вируса везикулярной болезни свиней, близкое родство которого вирусам Коксаки В отмечалось и ранее [125, 126]. Во вторую группу, как и прежде, вошли полиовирусы, вирусы Коксаки А 21 и 24, энтеровирус 70. Большинство энтеровирусов животных по 5 -НТР генома формируют самостоятельные генетические кластеры [126], что было подтверждено и в нашем исследовании. Деление энтеровирусов человека на 2 геногруппы на основе последовательности 5 НТР генома послужило основанием для подбора праймеров, позволяющих определять принадлежность энтеровирусов к той или иной геногруппе, что может быть полезным инструментом для ориентации в многообразии типов энтеровирусов и являться первым шагом в генотипировании вирусных изолятов. Такая дифференциация энтеровирусов
ПЦР-ПДРФ анализ 5'-НТР генома энтеровирусов человека
На момент начала нашей работы область применения метода полиморфизма длины рестриктных фрагментов (ПДРФ) при молекулярно-генетической характеристике энтеровирусов человека была не изучена. В научной литературе были опубликованы немногочисленные сообщения о вариантах ПДРФ области генома, кодирующей VP1, применённых для серотиповой дифференциации энтеровирусов человека и определения последовательностей, свойственных диким и вакцинным полиовирусам [29, 150]. Задачей настоящего исследования явилась разработка схемы ПДРФ, основанной на анализе кДНК участков 5 -НТР генома, которые фланкируются праймерами, сконструированными нами для вариантов ОТ-ПЦР РНК энтеровирусов человека, и оценка области её применения. С использованием программы MicroGeni проанализировано 35 последовательностей энтеровирусов геногруппы I и 13 последовательностей энтеровирусов геногруппы II. Были составлены рестриктные карты 2-х участков кДНК 5 -НТР генома энтеровирусов, фланкируемых праймерами: EvR2-EvFl, EvR2-EvIF2 (или EvIIF2), которые далее будут именоваться кДНК5з4 и кДНКз21, соответственно размеру амплифицируемого фрагмента.
Размер фрагментов указан по геному полиовируса типа 1 штамма Mahoney и может несколько варьировать у разных типов и штаммов энтеровирусов. Участок КДНК534 разных энтеровирусов в среднем содержал сайты для 75-80 из 215 рестриктаз, использовавшихся в компьютерном анализе. Однако обнаружить рестриктазы, с помощью которых можно идентифицировать геногруппу энтеровируса по 5 -НТР генома, нам не удалось. В связи с этим единственным способом дифференциации энтеровирусов на геногруппы осталась ПЦР с группо-специфичными праймерами: EvIF2 и EvIIF2, и общим праймером - EvR2. Варианты дифференциации 5 -НТР генома методом ПДРФ были рассмотрены для каждой из геногруппы энтеровирусов человека отдельно, с учетом того, что на первом этапе геногруппа будет идентифицироваться методом ПЦР. При анализе рестриктных карт кДНК энтеровирусов мы отметили, что по отношению к данным участкам генома все рестриктазы условно можно разделить на 3 группы. Положение и количество сайтов одних рестриктаз стабильно и идентично для кДНК всех энтеровирусов; такие рестриктазы не подходят для дифференциации. Некоторые рестриктазы могут специфично узнавать кДНК энтеровирусов одного типа или штамма, и, следовательно, их сайты могут быть использованы в качестве генетических маркеров типа или штамма энтеровирусов. И, наконец, третья группа рестриктаз имеет сайты, которые отличаются по количеству и положению на кДНК энтеровирусов разных типов и штаммов. При этом большинство профилей ПДРФ, полученных с помощью таких рестриктаз, являются полиморфными у штаммов одного серотипа, но в тоже могут время совпадать для кДНК энтеровирусов разных типов. Это свойство не позволяет составить простую схему типовой дифференциации энтеровирусов при использовании небольшого набора рестриктаз, т. е. создать нетрудоемкий и дешевый метод.
Поэтому мы отказались от дальнейшей разработки универсальной схемы дифференциации методом ПДРФ энтеровирусов геногруппы I, которая включает большинство энтеровирусов человека (вирусы Коксаки А 2-10, 12, 14, 16, Коксаки В 1-6, ECHO, энтеровирусы 69 и 71). Следует отметить, что в 1997 г. Kuan предложил схему типовой дифференциации энтеровирусов человека, основанную на анализе кДНК участка 5 -НТР генома (позиции 166-462) с помощью 3-х рестриктаз: Sty I, Bgl I, Xmn I. Однако, разработка этой схемы была осуществлена на основе анализа кДНК прототипных штаммов энтеровирусов 32 серотипов (по одному штамму каждого типа). Наше исследование включало и анализ кДНК нескольких штаммов энтеровирусов одного типа. Рассмотрена возможность использования предложенных Kuan рестриктаз при разработке собственной схемы. В результате было установлено, что сайты этих рестриктаз могут иметь разное положение в геноме штаммов энтеровирусов одного типа и, следовательно, не являются строгими генетическими маркерами серотипа. Кроме того, на сегодняшний день показано, что существование множества геновариантов среди энтеровирусов одного типа обусловлено не только мутационной, но и рекомбинационной изменчивостью, благодаря которой вывод о серотиповой принадлежности изолята энтеровируса, сделанный только на основе анализа участка 5 -НТР генома может быть недостоверным [1, 2, 4]. Недавно это положение было подтверждено экспериментально Siafakas с соавторами, которые установили несоответствие определения серотипа изолятов энтеровирусов методами ПДРФ и частичного секвенирования участка 5 - НТР генома результатам типирования в реакции нейтрализации [227]. Существующая мутационная и рекомбинационная изменчивость у энтеровирусов затрудняет применение ПДРФ 5 - НТР генома для определения серотипа энтеровирусов, но этот метод может быть полезен при молекулярно-генетической характеристике изолятов энтеровирусов и эпидемиологических исследованиях. При характеристике энтеровирусов геногруппы II представляет интерес исследование по наблюдению за циркуляцией полиовирусов. В этом случае важно не только определить тип изолята полиовируса, но и идентифицировать его происхождение. Нуклеотидная последовательность генома является стабильной характеристикой штамма вируса или его генетическим маркером. На основе идентификации генетических маркеров у изолята вируса можно сделать вывод о филогенетической связи этого вируса или анализируемого участка его генома с тем или иным штаммом. В 1992 г. метод ПДРФ, был рекомендован ВОЗ для идентификации вакцинных штаммов Сэйбина и родственных им вирусов.
Этот вариант ПДРФ представляет собой анализ кДНК участка генома полиовирусов (2401-2880 позиции по Pl/Mahoney), кодирующего N-концевую область белка VP1, с помощью рестриктаз Нае III, Dde I и Нра II, [29]. Мы рассмотрели варианты идентификации кДНК полиовирусов и генетических маркеров полиовирусов дикого и вакцинного происхождения, основанные на анализе участка 5 -НТР генома, предполагая возможность их использования в качестве эпидемиологических маркеров. Для разработки алгоритма идентификации маркеров вакцинных штаммов полиовирусов были выбраны рестриктазы, которые имеют сайты только в кДНК полиовирусов, а также различаются по наличию и положению сайтов на к ДНК 5 -НТР генома штаммов полиовирусов дикого и вакцинного происхождения (Табл.7). В первую очередь мы провели поиск рестриктаз, которые имеют сайты в кДНК только одного или группы родственных штаммов полиовирусов и не могут гидролизовать кДНК других энтеровирусов человека или энтеровирусов геногруппы II (в таблице отмечены заливкой серого цвета). В ряду рестриктаз, специфично узнающих последовательности штаммов полиовирусов, может быть рассмотрена AIu I, поскольку профили ПДРФ как кДНК5з4 так и кДНК32і всех штаммов полиовирусов, полученные после обработки этим ферментом будут отличны от профилей кДНК остальных вирусов геногруппы И, последовательности генома которых были использованы в теоретическом анализе (Табл. 8). При этом профили кДНК Sabin 2 и пары Sabin 3 и Leon 37 будут оригинальными, что может быть использовано для идентификации последовательностей, характерных для вакцинных полиовирусов. В то же время, рестриктные профили Alu І кДНК штаммов полиовируса типа 1, диких штаммов полиовируса типа 2 и дикого штамма 23127 полиовируса типа 3 будут совпадать. Для полиовирусов, родственных вирусу типа 1 живой полиовакцины Сэйбина, идентифицирующей рестриктазой является Bam HI. Поскольку штамм полиовируса типа 1 Mahoney является предшественником вакцинного полиовируса Sabin 1, а штамм IDP имеет вакцинное происхождение, сайт рестриктазы Bam HI можно рассматривать как генетический маркер вакцинного полиовируса Sabin 1.
