Содержание к диссертации
Введение
1 Применение обратной генетики в изучении РНКсодержащих вирусов 11
1. Создание полноценных инфекционных геномов РНКсодержащих вирусов - 11
2. Создание дефектных мини-геномов РНК-сод ержащих вирусов 18
2 Респираторно-синцитиальный вирус человека (PC вирус) 22
1. Биологическая характеристика вируса и структурнофункциональная характеристика вирусного генома - 22
2. Применение методов обратной генетики в отношении PCвирусов для изучения фундаментальных аспектов вирусного морфогенеза 35
3. Применение методов обратной генетики в отношении PC вирусов для решения задач специфической профилактики респираторных заболеваний 44
3 Вирус классической чумы свиней (КЧС) 54
1. Биологическая характеристика вируса и структурно функциональная характеристика вирусного генома 55
1.2. Локализация на геноме вируса КЧС участков, кодирующих поверхностные антигенные детерминанты 60
1.3. Исследования, направленные на изучение вакцинного штамма КС и разработку на его основе средств дифференциальной диагностики и специфической профилактики КЧС 62
1.3.3.1. Анализ генома штамма КС, филогенетический анализ и разработка теста для идентификации вакцинного штамма методом ПЦР и рестриктного анализа 62
1.3.3.2. Получение рекомбинантного поверхностного гликопротеина Е2 из вакциного штамма КС, субъединичное вакцинирование и разработка иммуноферментного анализа для определения антител к вирусу КЧС 70
1.3.4. Применение методов обратной генетики для изучения вируса КЧС 76
1.4. Заключение по обзору литературы 78
1.5. Цели и задачи исследования 80
2.1. Материалы и методы исследований 101
2.2. Результаты исследований 111
2.2.1. Выявление молекулярных детерминант вирулентности в геноме респираторно-синцинтиального вируса человека методом создания и исследования инфекционных дефектных вирусов 111
2.2.1.1. Определение и анализ первичной структуры генома штамма 2В PC-вируса человека 111
2.2.1.2. Определение и анализ первичной структуры геномов аттенуированного штамма PC-вируса 2B33F и ревертировавшего по признаку термочувствительности изолята 2B33F(TS+). Выявление потенциальных детерминант вирулентности на основе сравнительного анализа полных последовательностей геномов вирулентного и аттенуированого штамов РС-вируса человека 127
2.2.1.3. Конструирование дефектных вирусных мини-геномов, содежащих репортерый ген хлорамфениколацетилтрансферазы и регуляторные области из вирулентного и аттенуированого штаммов PC-вируса человека 131
2.2.1.4. Исследование инфекционности, репликации и транскрипции дефектных вирусных частиц при одновременном заражении различными штаммами вируса-помощника 137
2.2.1.5 Исследование инфекционности, параметров репликации и транскрипции дефектных вирусных частиц при одновременной трансфекции рекомбинантными комплементирующими плазмидами 144
2.2.1.6 Анализ транскрипции и репликации мини-геномов PC вируса в опытах по РНК-гибридизации и защите радиоактивно меченых гибридов от действия РНКаз 149
2.2.2. Получение маркированного вакцинного штамма вируса классической чумы свиней на основе полноразмерной инфекционной копии генома данного вируса 154
2.2.2.1. Анализ генов вирусных оболочечных гликопротеинов 155
2.2.2.2. Разработка стратегии и сборка полноразмерной копии генома вакцинного штамма КС вируса классической чумы свиней в E.coli под контролем промотора фага Т7, синтез in vitro геномной РНК данного штамма 168
3. Получение инфекционного вируса классической чумы свиней на основе его рекомбинантного генома и проверка его ростовых, антигенных, иммуногенных характеристик, выявление молекулярных маркеров 171
4. Внесение антигенных маркеров в рекомбининтный вирус КЧС: Получение маркированного вакцинного штамма путем замены гена Е2 в инфекционном геноме вируса КЧС (штамм КС) на ген Е2 вируса диареи крупного рогатого скота (цитопатогенный штамм NADL). 177
Респираторно-синцитиальный вирус 186
Вирус классической чумы свиней 204
Выводы 214
Список литературы 217
Приложения 246
- Создание дефектных мини-геномов РНК-сод ержащих вирусов
- Применение методов обратной генетики в отношении PCвирусов для изучения фундаментальных аспектов вирусного морфогенеза
- Выявление молекулярных детерминант вирулентности в геноме респираторно-синцинтиального вируса человека методом создания и исследования инфекционных дефектных вирусов
- Получение инфекционного вируса классической чумы свиней на основе его рекомбинантного генома и проверка его ростовых, антигенных, иммуногенных характеристик, выявление молекулярных маркеров
Введение к работе
Создание инфекционных рекомбинантных геномов представляет собой весьма актуальную задачу для изучения многих РНК-содержащих вирусов, т.к. этот современный подход позволяет выявлять и изменять генетические детерминанты, связанные с биологическими свойствами инфекционных агентов. Это создает теоретические и практические предпосылки для создания новых штаммов РНК-содержащих вирусов с полезными свойствами для диагностики и специфической иммунопрофилактики вирусных инфекций. Конструирование инфекционных вирусных геномов относится к области «обратной генетики». Термин "reverse genetics" появился в вирусологической литературе в последнее десятилетие. В четвертом издании «Fields Virology» этот термин связывают с внесением мутаций в РНК-геномы вирусов, для чего РНК переводится в форму кДНК (созвучно с «обратной транскрипцией»). Появился также термин «создание системы обратной генетики» для того или иного вируса. Подразумевается создание матрицы кДНК, в которую можно вносить изменения и получать полный или дефектный РНК-геном вируса. Таким образом, обратную генетику можно определить как методический прием, посвященный воссозданию, конструированию функционального генетического материала (полный или дефектный вирусный геном) и обеспечению экспериментальных условий для его функционирования. Такая модель позволяет вносить изменения в генетический материал, а также варьировать факторы, влияющие на его функции. Она представляет собой инструмент для прямой экспериментальной проверки рабочих гипотез о молекулярных механизмах наследственности и факторах патогенности. Это особенно важно для исследования РНК-содержащих вирусов. В последнее время продемонстрированы революционные возможности обратной генетики в области молекулярной вирусологии.
В настоящей работе поставлены задачи определения генетических детерминант вирулентности и создания рекомбинантных РНК-содержащих вирусов на примере двух объектов: респираторно-синцитиального (PC) вируса человека и вируса классической чумы свиней (КЧС).
PC вирус вызывет тяжелую инфекцию дыхательных путей (бронхо-легочный синдром) в основном у детей раннего возраста. Она особенно опасна для пожилых людей и страдающих иммунодефицитом (68). Заболевание относится к пока нерегулируемым вирусным инфекциям и встречается в развитых и развивающихся странах, а создание эффективной отечественной вакцины и методов диагностики остается важной социальной задачей здравоохранения. PC вирус относится к роду Pneumovirus (Семейство Paramyxoviridae), его геном представлен единственной одноцепочечной (минус-цепь) молекулой РНК.
На сегодняшний день не существует коммерческой вакцины против РС-вирусной инфекции человека. Разработка инактивированных вакцин на основе различных штаммов PC-вируса не принесла ожидаемого результата (153). В то же время живые вакцины на основе ослабленных штаммов других представителей семейства Paramyxoviridae (кори и паротита) эффективны и безопасны для человека. Поэтому предпринимаются попытки получить аттенуированные штаммы PC-вируса с использованием холодовой адаптации, химического (неспецифического) мутагенеза (164, 71-73, 109, 168), а в последнее время - методами обратной генетики.
Несмотря на разнообразие новых кандидатов в вакцинные штаммы РС-вируса, обладающих разной степенью иммуногенности и уровнем аттенуации, остается неясной природа самого явления аттенуации у PC-вирусов. Понимание молекулярных механизмов аттенуации позволило бы более целенаправленно конструировать новые вакцинные штаммы. Ряд исследований аттенуированных штаммов РС-вируса (70, 207) и вирусов парагриппа-3 (169) указывают на связь
аттенуированных свойств с мутациями в гене РНК-зависимой РНК-полимеразы. Это свидетельствует о том, что нарушения функций РНК-полимеразы (транскрипция и репликация вирусного генома) могут быть ответственны за аттенуацию.
Рабочая гипотеза, выдвигаемая в данной работе, состоит в том, что аттенуация PC-вирусов может быть связана со сниженной репродуктивной активностью из-за мутаций в генах РНК-полимеразы и других белков полимеразного комплекса, а также в регуляторных концевых промоторных последовательностях генома. Для проверки этой гипотезы были проанализированы геномные мутации у ослабленных вариантов РС-вируса, полученных адаптацией штамма дикого типа 2В к размножению в культуре клеток при сниженной температуре и претендующих на роль кандидатов в вакцинные штаммы. Для экспериментальной проверки роли найденных мутаций была создана модельная система (обратной генетики) на основе искусственных мини-репликонов PC-вируса, позволяющая вносить изменения в белки репликативного комплекса и в регуляторные элементы генома.
Другим объектом настоящего исследования является вирус КЧС, который распространен в разных регионах мира (включая Россию) и наносит огромный экономический ущерб во время массовых эпизоотии. Геном вируса КЧС (род Pestivirus) представлен единственной одноцепочечной (плюс-цепь) молекулой РНК. Для болезни характерно острое, хроническое или латентное течение, возможность трансплацентарной передачи вируса от матери к плоду, политропное поражение органов (включая систему иммуногенеза и клетки костного мозга, эндотелий сосудов). Вирус КЧС обычно не вызывает цитопатических изменений в культуре клеток, что определяет сложность его выявления и титрования.
Специфическая профилактика КЧС как правило осуществляется живыми вакцинами, приготовленными на основе китайского лапинизированного штамма
С или других аналогичных вакцинных штаммов, что защищает животных от заболевания (202). С целью профилактики КЧС возможно применение инактивированных, а также рекомбинантных субъединичных вакцин, которые уступают живым вакцинам по протективной активности (206, ПО, 178, 147). Создание полноразмерного инфекционного клона вируса КЧС является важным инструментом для получения ответов на фундаментальные вопросы, касающиеся факторов вирулентности и патогенности, молекулярных механизмов, вовлечённых в процессы цикла репродукции вируса. Подобный подход был успешно применён к ряду вирусов с РНК геномом положительной полярности, включая вирус КЧС (150, 177, 36). Для настоящей работы представляет интерес создание инфекционной копии генома вакцинного штамма вируса КЧС, из-за необходимости создания отечественной маркированнной вакцины. Вакцинный штамм КС, взятый за прототип в данной работе, получен на основе вакцинного штамма Ж ВНИИВВиМ, который применялся в СССР на протяжении более 30 лет (В.А.Сергеев, 1993). В 1997-2000 гг. было проведено детальное изучение биологических свойств и молекулярных характеристик данного вакцинного штамма (Е.А.Непоклонов, 2000; А.Д.Забережный и др., 1999; 5, 3, 18): геном штамма КС был полностью секвенирован, разработан молекулярный тест на основе ПЦР (ТУ-9388-082-00008064-99, 18.01.99 г.), а также на основе ПЦР и рестриктного анализа для выявления и дифференциации вирулентного и вакцинного штаммов. Поверхностные гликопротеины вируса КЧС были синтезированы в бакуловирусной системе, на их основе создан иммуноферментный тест для выявления вирус-специфических антител (ТУ-9388-082-00008064-98, 08.12.98 г.). Таким образом, были созданы все предпосылки для создания новых аттенуированных штаммов на основе штамма КС, пригодных для разработки маркированной вакцины против КЧС.
Работа выполнена в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Российской
Академии Медицинских Наук, в Научно-производственном объединении
НАРВАК, г. Москва и в научно-исследовательской лаборатории Wyeth-Lederle, США. Автор приносит глубокую благодарность научному консультанту д.б.н. Е.А.Непоклонову, д.б.н. Т.И.Алиперу, к.б.н. Т.В.Гребенниковой, А.Н.Власовой, В.В.Грабовецкому, О.В.Елисеевой, д.б.н. Г.К.Воркуновой (ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского), заслуженному деятелю науки РСФСР, профессору В.А. Сергееву, М.М.Демкиной, М.А.Корицкой, к.б.н. М.И.Мусиенко (НПО НАРВАК), Jean Adamus, Dr. Joan Crowley (Wyeth-Lederle, Нью-Йорк) за разностороннюю научно-методическую и организационную помощь в работе.
Создание дефектных мини-геномов РНК-сод ержащих вирусов
Дефектный мини-геном представляет собой делеционный вариант генома и в минимальном варианте может состоять из одних лишь концевых последовательностей генома, не неся в себе вирусных генов. Если на концах мини-генома сохраняются регуляторные элементы, необходимые для репликации, то в присутствии вируса-помощника (полноценного родительского вируса) в клетках такой мини- геном не только размножается, но и упаковывается в дефектные вирусные частицы. Эти частицы в присутствии вируса-помощника являются инфекционными и в процессе пассирования в клеточных культурах зачастую размножаются в значительных титрах, обгоняя рост вируса-помощника. Дефектные геномы и соответственно дефектные вирусные частицы образуются естественным образом в живой природе и давно известны для ряда вирусов. Дефектный природный вирус образуется в результате случайного мутационного события, например, делеции. Он зачастую соседствует с другими дефектными вирусами и всегда - с вирусом-помощником. Изучение дефектных природных вирусов приводит к получению новых данных и гипотез о механизмах рекомбинации вирусных геномов. С появлением обратной генетики появилась возможность создавать мини-геномы и самым прямым образом проводить с ними генетические манипуляции.
Распространенным типом мини-генома является молекула РНК, состоящая из частей, изображенных на приведенной ниже схеме: Приведенный мини-геном уникален и не может быть обнаружен среди изолятов PC-вируса. Сегодня его можно получить в лаборатории и ввести в клетки совместно с вирусом-помощником. Рассмотрим возможности, предоставляемые данной экспериментальной моделью. Как видно из приведенной выше схемы, в геном включен репортерный ген хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT), экспрессия которого может количественно измеряться как по синтезу мРНК данного гена, так и по ферментативной активности его продукта. Дополнительно есть возможность исследовать степень репликации всего мини-генома по количеству минус-цепей РНК, например, в реакции гибридизации нуклеиновых кислот со специфическими зондами. Перечисленными параметрами, по-видимому, и ограничивается возможность исследовать поведение мини-генома в культуре клеток. Однако в сочетании с другими факторами, данная модель позволяет ставить и экспериментально решать фундаментальные и практические задачи. К ним относятся (1) изучение c/s-регуляторных последовательностей вирусного генома и (2) изучение факторов регуляции, синтез которых осуществляется in trans при одновременном заражении вирусом-помощником или введении экспрессирующих векторов.
Для изучения регуляторных элементов в геноме вируса, например, промоторов, отвечающих за репликацию и транскрипцию, их изменяют в мини-геноме, вставляя готовые последовательности из хорошо охарактеризованных штаммов вируса, или изменяют нуклеотид за нуклеотидом, анализируяповышение или понижение промоторной активности. В практическом отношении такие эксперименты приводят к изучению механизмов аттенуации и к получению новых аттенуированных штаммов. Для изучения факторов вирусной репродукции, например, репликативного комплекса, последовательность мини-геномов оставляют неизменной, но заменяют вирусы-помощники, например, вирулентный на аттенуированный. Изменение уровня репликации или экспрессии репортерного гена в мини-геноме в данном случае означает связь факторов репликазного комплекса с вирулентностью. Для более глубокого изучения факторов репликации и транскрипции сегодня возможно отказаться от вируса-помощника. Ряд белков, необходимых для функционирования мини-генома, вводят в клетки при помощи рекомбинантных плазмид с соответствующими генами и обеспечения их экспрессии. Происходит репликация мини-генома и экспрессия гена-репортера. В этом случае каждая из плазмид может быть подвергнута генетическим манипуляциям, что создает неограниченную возможность изменять аминокислотную последовательность факторов репликации и транскрипции и оценивать их функции в прямых экспериментах. Каждое сделанное наблюдение относительно связи структуры РНК или белков с фенотипическими особенностями вируса может быть немедленно подтверждено в опытах по введению комплементирующих мутаций в мини-геном или в белки репликазного комплекса.Рассмотрим более сложную модель мини-генома, содержащую два репортерных гена (двухцистронный мини-геном). Его средняя часть приведена на следующей схеме: Как видно из схемы, вслед за геном CAT следует репортерный ген люциферазы (LUC). Между ними встроена последовательность РНК так же, как два соседних вирусных гена связаны в геноме. Подобная организация мини-генома позволяет исследовать относительную экспрессию каждых двух соседних вирусных генов в зависимости от всех упомянутых выше факторов, а также от структуры межгенного участка.
В следующих разделах будут подробно описаны опыты с мини-геномами на основе PC-вируса и других пневмовирусов. Например, было изучено влияние репликазных комплексов одних представителей пневмовирусов на регуляторные области геномов других в опытах с двумя пневмовирусами: РС-вирусом человека и пневмовирусом птиц (APV) (139). Промоторы РС-вируса, которые определяют репликацию и транскрипцию вирусной РНК, были проанализированы в экспериментах с мини-репликоном, содержащим основные элементы генома (83). При помощи мини-генома PC-вируса была установлена роль последних 7 нуклеотидов в 5 -концевой области терминальной («трайлерной») последовательности геномной цепи РНК (159), что дало возможность подтвердить гипотезу о вовлеченности различных полимеразных механизмов в процессы репликации и транскрипции РС-вирусов.
Технология мини-геномов была активно использована при изучении РС-вирусов, благодаря усилиям лаборатории Питера Коллинза из NIH (Национальный Институт Здоровья, США). Данный вирус является объектом исследований и в настоящей работе. Поэтому прежде чем переходить к описанию применения методов обратной генетики в отношении РС-вируса, следует подробнее остановиться на его основных характеристиках.
Применение методов обратной генетики в отношении PCвирусов для изучения фундаментальных аспектов вирусного морфогенеза
У всех представителей Mononegavirales, как и у PC-вируса, каждый индивидуальный ген оканчивается короткой сигнальной последовательностью GE (gene end), которая отвечает за полиаденилирование и терминацию, а также, возможно, и за ре-инициацию транскрипции следующего гена. Рассмотрим ее подробнее. Как описано в предыдущем разделе, последовательности GE у РС-вирусов состоят из 12-13 нуклеотидов и содержат консервативный пятичленник З -UCAAU (по отрицательной цепи), за которой следует слабоконсервативная последовательность из 3 нуклеотидов U или А. За ними следует 4-5 остатков урацила, которые, как предполагают, ответственны за образование полиаденилирования мРНК по механизму повторного копирования. Методамиобратной генетики (196) были внесены изменения в сигнал GE гена F из РС-вируса, встроенного в репортерный ген, расположенный в первом положении в трицистронном мини-геноме. При этом исследовали уровень транскрипционной активности мини-генома PC-вируса. Установлено, что для успешной терминации и полиаденилирования необходима описанная выше последовательность именно из 3 нуклеотидов U или А. Длина участка поли-U должна быть как минимум 4 нуклеотида для достижения эффекта полиаденилирования, который достигает максимальной эффективности начиная с длины участка поли-U в 5 нуклеотидов. Для успешной терминации транскрипции последовательность GE должна была содержать урацил в положении 13. Таким образом, различия в нуклеотидной композиции последовательностей GE у PC-вирусов (часто встречающиеся в природе) должны прямо влиять на эффективность терминации транскрипции. Неожиданно для авторов этих наблюдений они обнаружили, что способность некоторых мутаций ингибировать терминацию транскрипции полностью зависит от уровня экспрессии белка М2-1. Другое наблюдение состоит в том, что мутации, подавляющие терминацию и полиаденилирование при транскрипции первого цистрона, не влияли на эффективность транскрипции следующего цистрона. Это свидетельствует о том, что в геноме РС-вируса нормальная терминация транскрипции и полиаденилирование мРНК не обязательно необходимы для нормальной ре-инициации транскрипции последующих генов.
Важным нерешенным вопросом в биологии представителей Mononegavirus является вопрос о том, усаствует ли один и тот же промотор одновременно в транскрипции и репликации вирусного генома. В опытах с мини-геномами (85), позволяющих отдельно проводить анализ интенсивности транскрипции и репликации, при помощи мутаций в 3 -концевых областях было установлено,что действительно, именно эти концевые области определяют как транскрипцию, так и репликацию РНК, выступая в роли промоторов. Однако, позиции ключевых нуклеотидов, от которых зависела эффективность этих процессов, были зачастую разными для транскрипции и репликации. Более того, установлено, что существует некоторая минимальная длина терминальной регуляторной последовательности, где одни и те же изменения важны и для транскрипции и для репликации. При этом изменения в нуклеотидном составе за пределами этой минимальной последовательности или влияют только на эффективность репликации, но не транскрипции, или влияют на оба процесса, но с противоположным эффектом (мутации усиливают репликацию и снижают транскрипцию или наоборот). Таким образом, можно предположить, что хотя промоторы транскрипции и репликации распологаются на самом 3 -конце генома, они исполоьзуют свои перекрывающиеся наборы нуклеотидов, из которых некоторые являются определяющими или для одного, или для другого процесса.
Оболочечные гликопротеины PC-вируса могут играть важную роль в процессах прикрепления вирусных частиц к клеткам хозяина, проникновения вируса в клетку и в вирусном морфогенезе. Гликопротеин G РС-вируса человека синтезируется в клетках в двух видах: в виде внутриклеточного целого белка и в виде укороченного белка без N-концевого трансмембранного домена. Последний секретируется во внешнюю среду. При помощи обратной генетики был созданы мутантные РС-вирусы (201), которые либо не обеспечивали синтез данного гликопротеина, либо производили лишь одну из его форм - полную или укороченную. Вирус, дефектный по гену G, не был способен реплицироваться in vivo, хотя размножался в некоторых клеточных линиях (Vero), а в некоторых (НЕр-2)-нет. Установлено, что дефект проявлялся на ранних стадиях проникновения вируса в клетку и не был заметен на позднихстадиях вирусного морфогенеза. Установлено, что секреторная форма данного белка, лишенная цитоплазматического и трансмембранного доменов, необходима для репликации вируса in vivo. Известно, что аминокислоты 184-198 в гликопротеине G являются главным сайтом связывания с гепарином и обеспечивают нейтрализацию вируса в присутствии растворимого гепарина (86). Однако делеция данного участка в рекомбинантном вирусе не привела к потере чувствительности к гепарину, что свидетельствует о присутствии других доменов, связывающих гепарин.PC-вирус синтезирует три поверхностных гликопротеина, (attachment (G), fusion (F), small hydrophobic (SH)). По аналогии с представителями семейства Paramyxoviridae, считается, что белки G и F требуются для первых двух этапов проникновения вируса в клетку: прикрепления и клеточного слияния. Однако, был найден жизнеспособный мутантный PC-вирус, у которого не оказалось сразу 2 генов: G и SH (122). Для того, чтобы выяснить роль вирусных трех гликопротеинов в сборке и функционировании вириона, в воздействии на клетку, были пременены методы обратной генетики (197).
Была получена инфекционная копия генома PC-вируса и на её основе получен инфекционный PC-вирус без гена G и/или гена SH. Все три рекомбинантных делеционных мутанта, так же как и родительский вирус, содержали маркерный ген зеленого флуоресцирующего белка (GFP), который необходим для визуального выявления инфицированных клеток. Было установлено, что белок G способствует связыванию вирусных частиц с клетками - мишенями, но при этом не играет роли в последующем проникновении вируса внутрь клетки. Белок G также способствует слиянию клеток в гигантские многоядерные структуры и скорее всего участвует в модуляции сборки вириона и выходу сформированных вирионов из клетки в окружающую среду. Присутствие или отсутствие в вирионах белка G не
Выявление молекулярных детерминант вирулентности в геноме респираторно-синцинтиального вируса человека методом создания и исследования инфекционных дефектных вирусов
Первым нами был изучен геном штамма 2В, т.к. этот штамм был использован для получения аттенуированных мутантов - кандидатов для использования в качестве вакцинных штаммов. Поэтому геном этого штамма был полностью секвенирован и сравнен со всеми другими геномами РС-вирусов, известными по литературе. Следует отметить, что на момент выполнения этой работы ни один геном PC-вируса подгруппы. В не был полностью секвенирован. Отсутствовали данные о концевых последовательностях генома (лидерной и трайлерной), о генах L и М, а также о межгенных областях Р-М и SH-G.
Нами установлено, что геном штамма 2В состоит из 15218 нуклеотидов из которых 33,6% приходится на гуанидиновые и цитозиновые остатки (ГЦ). Подобно другим штаммам PC-вируса, геном штамма 2В содержит выраженные участки и нуклеотидные мотивы, определяющие положение каждого гена, а также межгенные последовательности и концевые нетранскрибируемые области (лидерную на 3 -конце и трайлерную на 5 -конце).Положения межгенных, лидерной и трайлерной областей определяли на основании сравнения генома штамма 2В с данными штаммов А2 и 18537 (59; 120). Характерные последовательности начала и окончания генов в штамме 2Ввесьма консервативны в сравнении со штаммами группы А и даже с РС-вирусом крупного рогатого скота. Это видно из результатов, приведенных в таблице 10. Сравнение последовательностей на конце гена L приведены на рис. 12. (59; 120; 158; 237).
Как видно из приведенных данных (табл. 10), размеры межгенных областей в геноме штамма 2В варьируют в диапазоне от 3 до 56 нуклеотидов, причем все оканчиваются аденозиновым остатком за исключением межгенной области N-P. Следует отметить, что в отличие от начальных и концевых последовательностей индивидуальных генов, межгенные пространства сильно отличаются у PC вирусов, принадлежащих к подгруппам А и В и еще более отличаются от межгенных пространств у PC-вируса крупного рогатого скота. При этом между представителями подгруппы В (штаммы 2В и 18537) гомология последовательностей межгенных областей составляет 93-100%. Лидерная последовательность на 3 -конце генома штамма 2В содержит 44 нуклеотида подобно штамму А2. При этом первые 18 нуклеотидов полностью совпали, оставшаяся часть лидерной последовательности содержит 5 несовпадений, как показано ниже:
При этом последние 27 нуклеотидов трайлерной области полностью совпадают у этих 2 штаммов, а остаток трайлерной области показывает весьма низкую гомологию между штаммами групп А и В (144).Таблица 11 содержит данные о гомологии нуклеотидных и расчетных аминокислотных последовательностей 10 генов штамма 2В с соответствующими генами из 3 штаммов PC-вируса: В1, А2 (66, Из данных, приведенных в таблице 11, следует, что консерватизм нуклеотидных последовательностей генов в геноме PC-вируса изменяется в следующем порядке: N-M2-L-M-P-F-NS2-NS1-SH-G, при этом ген N наиболее консервативен, а ген G наиболее вариабелен. Гомология аминокис лотных последовательностей между представителями подгрупп А и В варьирует от 53.2% до 96.2%, тогда как между представителями подгруппы В (штаммы 2В и 18537) она варьирует в диапазоне от 88.6% до 99.7%. Любопытно отметить, что для двух наименее консервативных генов (SH и G) гомология аминокислотных последовательностей между штаммами 2В и А2 меньше, чем гомология нуклеотидных последовательностей.
Сравнительный анализ гена L. На рис.13 показано распределение консервативных и вариабельных областей в аминокислотной последовательности РНК-зависимой РНК полимеразы PC-вируса на основе сравнения соответствующих даных для штаммов А2, 2В, В1 и 18537.Как видно из рис.13, протяженные консервативные области аминокислотных последовательностей располагаются в основном центральной и N-концевой части белка, тогда как наиболее вариабельные участки расположены в С-концевой части. Можно выделить 7 наиболее консервативныхучастков по следующему критерию: они содержат более 100 аминокислот и имеют более 97% гомологии между всеми 4 штаммами РС-вируса.Известны 6 консервативных фрагментов, найденных в аминокислотных последовательностях РНК-полимераз из разных источников (152), они все попадают в консервативную область 2 на рис. 14.Незначительное количество аминокислотных несовпадений обнаружено между белками РНК-полимеразы при сравнении штаммов РС-вируса подгруппы В. Все они располжены в вариабельных участках, полученных на основе сравнения штаммов PC-вируса подгрупп А и В.Сравнительный анализ гена G. При сравнении генов G из штамма 2В и других штаммов PC-вируса (рис. 15) была выявлена делеция в 6 нуклеотидов в позициях 486-491. Эта делеция не привела к сдвигу рамки трансляции, а привела к потере 2 кодонов ААА-АСС и соответственно аминокислот Lyshr. Обнаружена также вставка из 3 нуклеотидов ААС в позиции 642-644. Эта вставка привела к включению дополнительной аминокислоты Asn. На рис.16 приведены предсказанные вторичные структуры гликопротеина G из 3 различных штаммов PC-вирусов подгруппы В: 2В, В18537, Long. Видно, что делеция приходится на гидрофильную часть белка, которая выступает из клеточной мембраны.
В данном разделе были приведены особенности генома PC-вируса штамма 2В при его сравнении с имеющимися в литературе аналогичными данными о других штаммах. Теперь следует перейти к анализу геномов ослабленных штаммов-производных от штамма 2В с тем, чтобы при сравнении их структуры получить представление о генетических детерминантах вирулентности РС-вирусов.
Получение инфекционного вируса классической чумы свиней на основе его рекомбинантного генома и проверка его ростовых, антигенных, иммуногенных характеристик, выявление молекулярных маркеров
Сборка вирусного генома и получение инфекционного вируса. Для сборки генома был использован известный плазмидный вектор pACYC177, состоящий из 3941 нуклеотидных пар, из которого был удален фрагмент, ограниченный сайтами Aatll, Xhol. При обработке плазмиды данными рестриктазами образовывались фрагменты ДНК, содержащие 2329 и 1612 нуклеотидных пар. Фрагмент из 2329 нуклеотидных пар был очищен методом препаративного электрофореза в агарозном геле и использован для дальнейшей работы в качестве основы для бактериального вектора. Для встраивания полилинкера, специально предназначенного для сборки кДНК-копии вирусного генома, были синтезированы комплементарные олигонуклеотиды, образовавшие после отжига полилинкер (MCS), содержащий следующие сайты: Aatll-Sall-Bglll-Sfil-Sfrl-Xhol. Последовательность данного полилинкера после отжига комплементарных цепей представлена на рис. 32.
После встраивания данного фрагмента в плазмиду был получен вектор, содержащий 2366 нуклеотидных пар, пригодный для сборки вирусного генома. Три описанных выше фрагмента генома были встроены в вектор по отдельности. Всего было получено 244 плазмиды. После проверки правильности клонирования при помощи рестриктного анализа было отобрано всего было отобрано 42 плазмиды. Полученные клоны были секвенированы по одному до тех пор, пока один из клонов, содержащий каждый из 3 фрагментов кДНК, не совпадал по первичной структуре с исходными последовательностями вирусного генома. Отобранные 3 клона, не содержащие мутаций, были использованы для сборки полного генома.
Плазмида, содержащая полный геном, была переведена в линейную форму при помощи обработки эндонуклеазой рестрикции Sfrl точно в месте окончания последовательности, подлежащей транскрипции, и использована для синтеза РНК-копии генома при помощи ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7. Полученная очищенная РНК была использована для проведения трансфекции с CellFECTIN Reagent (Gibco BRL, Life Technologies), а также для проведения электропорации. Для данных экспериментов использовались перевиваемыеклеточные линии почки свиньи SK-6 (swine kidney), РК -15 (porcine kidney) и первичная культура клеток ТЯ (тестикулы ягнят).Выявление инфекционного вируса в клеточных культурах проводили различными методами.Полимеразная цепная реакция была использована для обнаружения РНК вируса КЧС. Общую РНК выделяли из 200-300 мкл клеточной суспензии, зараженной вирусом. Результаты анализа приведены на рис 33.Иммуноферментный метод (PLA) был использован для выявления вируса КЧС в зараженной культуре клеток. Результаты окрашивания приведены на рис. 34.
Иммунофлуоресцентный анализ был использован для обнаружения вирусных частиц и динамики накопления вируса при пассировании. Зараженные культуры клеток (2-й и 3-й пассаж) либо подмораживали, либо снимали монослой трипсином. Капля суспензии клеток в культуральной жидкости помещалась на предметное стекло. Проводили контрастирующее окрашивание с реагентом Evans Blue, после чего учитывали в иммунофлуоресцентном микроскопе под водной или PBS-глицериновой иммерсией. Результаты выявления вируса приведены на рис. 35 Таким образом, инфекционность рекомбинантной РНК была доказана в опытах по трансфекции клеток. Полученный рекомбинантный вирус не отличался по ростовым характеристикам от своего прототипа, накапливаясь в тех же титрах (данные не приведены). Таким образом, создана конструкция кДНК, позволяющая вносить генетические изменения в вирус КЧС. В следующем разделе будет описано введение антигенных маркеров в рекомбинантный вирус.
