Содержание к диссертации
. Оглавление
1. Оглавление 2
2. Список сокращений 5
3. Введение
3.1. Актуальность темы 8
3.2. Цель и задачи исследований 11
3.3. Научная новизна работы 11
3.4. Практическая значимость результатов 12
3.5. Апробация и публикации результатов 12
3.6. Основные положения, выносимые на защиту 12
3.7. Личный вклад автора в выполнении работы 13
4. Обзор литературы 14
4.1. Характеристика инфекционного ларинготрахеита птиц 14
4.2. Краткая характеристика семейства Herpesviridae 17
4.3. Характеристика вируса инфекционного ларинготрахеита птиц
4.4.1. Выделение вируса 23
4.4.2. Гистологический метод 24
4.4.3. Реакция нейтрализации (РН) 24
4.4.4. Реакция иммунодиффузии (РИД, РДП) 25
4.4.5. Метод флуоресцирующих антител (МФА) 26
4.4.6. Встречный иммуноэлектрофорез (ВИЭФ) 28
4.4.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и другие методы молекулярной
диагностики, применяемые при идентификации вируса ИЛТ 28
4.4.8. Иммуноферментньш анализ (ИФА) 29
4.4.9. Получение и изучение свойств гибридом и сайтспецифических
иммуноглобулинов 32
4.4.10. Применение моноклональных антител в диагностике вирусных болезней 34
4.5. Заключение по обзору литературы 35
5. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 36
5.1. Материалы и методы 36
5.1.1. Материалы 36
5.1.1.1. Животные 36
5.1.1.2. Вирусы 36
5.1.1.3. Специфические сыворотки 37
5.1.1.4. Культуры клеток 37
5.1.1.5. Питательные среды и растворы 38
5.1.1.6. Приготовление питательных сред и их компонентов 38
5.1.1.7. Реактивы 39
5.1.1.8. Исходные водные растворы 40
5.1.1.9. Растворы для конъюгации иммуноглобулинов и пероксидазы хрена
5.1.1.10. Растворы для постановки ИФА 42
5.1.1.11. Оборудование 44
5.1.2. Методы 45
5.1.2.1. Получение вируссодержащего материала, определение его инфекционной
активности 45
5.1.2.2. Концентрирование и очистка вируса ИЛТ птиц 45
5.1.2.3. Получение препаратов нормальных антигенов 45
5.1.2.4. Приготовление гипериммунных антисывороток петухов, кроликов и морских свинок 46
5.1.2.5. Реакция диффузионной преципитации (РДП) 46
5.1.2.6. Иммуноэлектрофорез 47
5.1.2.7. Определение концентрации белка 47
5.1.2.8. Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела 48
5.1.2.9. Приготовление культуры клеток перитонеальных макрофагов мыши
5.1.2.10. Гибридизация 49
5.1.2.11. Скрининг гибридных антителопродуцентов 49
5.1.2.12. Клонирование стабильно пролиферирующих гибридных
антителопродуцентов 50
5.1.2.13. Определение классов и подклассов моноклональных иммуноглобулинов 50
5.1.2.14. Получение асцитических жидкостей, содержащих моноклональные антитела
5.1.2.15. Криоконсервирование гибридомных клеток и восстановление их после хранения в замороженном состоянии 50
5.1.2.16. Выделение антител из поликлональных сывороток и асцитических жидкостей 50
5.1.2.17. Приготовление конъюгатов иммуноглобулинов с пероксидазой 51
5.1.2.18. Определение полипептидной специфичности МКА методом вестерн блоттинга 51
5.1.2.19. "Сэндвич" - вариант ТФ ИФА для исключения присутствия
гетерологических антигенов в препаратах частично очищенного вируса 51
5.1.2.20. Непрямой вариант ТФ ИФА для скрининга МКА 52
5.1.2.21. Иммуногистохимия (иммунопероксидазный метод) 54
5.1.2.22. "Сэндвич"-вариант ТФ ИФА для выявления антигена 55
5.1.2.23 Вариант ингибирования ТФ ИФА для выявления специфических антител в
сыворотках крови 56
5.1.2.24. Непрямой "сэндвич"-варпант ТФ ИФА для выявления специфических
антител 56
5.1.2.25. Методы математического анализа 57
5.2. Результаты собственных исследований 58
5.2.1. Культивирование вируса ИЛТ кур 58
5.2.2. Очистка и концентрирование вируса ИЛТ кур 58
5.2.3. Экспериментальная инфекция 60
5.2.4. Клиническое и патологоанатомическое исследование 61
5.2.5. Приготовление гипериммунных антисывороток петухов, кроликов и морских свинок 63
5.2.6. Оценка препаратов вируса ИЛТ и специфических сывороток в реакции
диффузионной преципитации и во встречном иммуноэлектрофорезе 64
5.2.7. Определение условий постановки непрямого варианта ТФ ИФА 69
5.2.8. Влияние условий хранения на активность гипериммунных поликлональных антисывороток к вирусу ИЛТ 74
5.2.9. Определение концентрации белка в препаратах частично очищенного вируса ИЛТ 76
5.2.10. Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к антигенам
вируса инфекционного ларинготрахеита птиц 76
5.2.10.1. Иммунизация мышей линии BALB/c 76
5.2.10.2. Гибридизация 76
5.2.10.3. Скрининг и селекция стабильных антителопродуцирующих и
активнопролиферирующих клонов гибридом 78
5.2.10.4. Клонирование и культивирование in vitro клонов гибридом 80
5.2.10.5. Культивирование клонов гибридом in vivo и получение асцитических
жидкостей от мышей линии BALB/c 80
5.2.10.6. Определение титра МКА в супернатантах культуральных и иммуноасцитических жидкостей мышей в непрямом ТФ ИФА 81
5.2.10.7. Криоконсервирование гибридомных клеток 81
5.2.10.8. Изучение стабильности клонов гибридом при пассировании in vitro и in vivo 82
5.2.10.9. Определение классов и подклассов моноклональных иммуноглобулинов 82
5.2.10.10. Определение концентрации белка в глобулиновой фракции асцитов 83
5.2.10.11. Определение полипептидной специфичности МКА методом вестерн блоттинга 83
5.2.10.12. Изучение преципитирующих свойств моноклональных антител в реакции
диффузионной преципитации (РДП) 88
5.2.11. Приготовление конъюгатов иммуноглобулинов с пероксидазой хрена 92
5.2.12. Разработка модифицированных вариантов ИФА на основе моноклональных антител для лабораторной диагностики инфекционного ларинготрахеита птиц 92
5.2.12.1. Разработка непрямого варианта иммуноферментного анализа (ТФ нИФА)
для обнаружения специфических антител к вирусу ИЛТ в сыворотках крови птицы, и
МКА в супернатантах культуральных и иммуноасцитических жидкостей 92
5.2.12.2. Разработка иммуногистохимии (иммунопероксидазного метода) (ИГХ,
ИПМ) на основе МКА для обнаружения вируса ИЛТ в мазках-отпечатках пораженных
органов птиц 94
5.2.12.2.1. Разработка непрямого варианта иммуногистохимии 94
5.2.12.2.2. Разработка прямого варианта иммуногистохимии
5.2.12.3. Разработка "сэндвич"-варианта ТФ ИФА для выявления антигена 103
5.2.12.4. Определение чувствительности и специфичности "сэндвич"-варианта ТФ ИФА на основе моноклональных антител 113
5.2.12.5. Идентификация антигенов вируса ИЛТ "сэндвич -вариантом ТФ ИФА в пробах патологического материала, обработанных детергентами 119
5.2.12.6. Влияние условий хранения на активность пероксидазных конъюгатов на основе моноклональных антител 120
5.2.12.7. Изменение антигенной активности вируссодержащих препаратов при
хранении материала в различных температурных условиях 121
5.2.12.8. Разработка варианта ингибирования ТФ ИФА для выявления
специфических антител в поликлональных сыворотках птицы 125
5.2.12.9. Разработка непрямого "сэндвич"-варианта ТФ ИФА для выявления специфических антител в поликлональных сыворотках птиц 127
5.2.12.10. Определение специфичности и чувствительности непрямого "сэндвич"-варианта ТФ ИФА 130
5.2.12.11. Определение специфичности антивидовых (антикуриных) поликлональных и моноклональных антител к иммуноглобулинам сывороток крови птиц 133
5.2.12.12. Выявление антител в сыворотках крови домашних, диких и синантропных птиц непрямым "сэндвич"-вариантом ТФ ИФА 1
6. Обсуждение 140
7. Выводы 154
8. Практические предложения 155
9. Список использованной литературы 156
10. Приложения 185
Введение к работе
Инфекционный ларинготрахеит (ИЛТ) - вирусная контагиозная респираторная болезнь, поражающая кур всех возрастов, индеек, фазанов [27, 84, НО, 171, 204, 275], куропаток и павлинов [ПО, 204, 240]; протекающая сверхостро, остро, подостро [2, 14, 294] и хронически; часто болезнь протекает атипично, а клинические признаки при атипичном течении слабо выражены или их нет [38, 240]. ИЛТ распространён повсеместно и зарегистрирован на всех континентах, но наиболее широко - среди поголовья крупных птицеводческих комплексов в странах Европы, Австралии, США, Новой Зеландии, Великобритании, Китае, странах Юго-восточной Азии. К настоящему времени ареал болезни значительно расширился [77, 114, 240, 249, 276].
Штаммы вируса антигенно идентичны и гомологичны на основе реакции нейтрализации, реакции иммунофлюоресценции [73, 109, 268, 281]. Известные отечественные штаммы вируса в антигенном отношении родственны эталонному штамму ЦНИИПП [43].
Заболеваемость птицы в хозяйствах, где ИЛТ регистрируется впервые, составляет 80-100%, а летальность - 30-72% [2, 66, 188]. При подостром течении отмечается высокая заболеваемость птицы, но уровень летальности может быть ниже, чем при остром и сверхостром течении, и колебаться от 10% до 30% [113, 200, 240, 267]. Умеренный ИЛТ (хроническое течение) наиболее распространён среди поголовья крупных птицеводческих комплексов, проявляется в разной степени как серозно-катаральный трахеит, синусит, конъюнктивит, при этом заболеваемость может быть около 1-2% и низкой летальностью, и может длиться в течение месяцев [240].
Решающее значение в борьбе с заболеванием имеет эпизоотический контроль и проведение своевременных и эффективных противоэпизоотиче-ских мероприятий. Для этого необходимо иметь надежные и экспрессные методы лабораторной диагностики.
Диагностика ИЛТ в настоящее время представляет собой комплекс методов, включающий анализ эпизоотологических данных, клинического и па-тологоанатомического обследований, а также лабораторных методов. Лабораторные исследования направлены на: выделение вируса на куриных эмбрионах (КЭ) или культурах клеток (КК) [3, 11, 15, 51, 84, 92, 98, 196, 272, 291] и обнаружение внутриядерных включений гистологическим методом с электронной микроскопией мазков-отпечатков слизистой трахеи и/или экссудата из её просвета от больных птиц [52, 101, 105, 133, 169, 232, 261, 267, 278, 321]. Индикацию и идентификацию вируса в пробах патматериала проводят в реакции диффузионной преципитации (РДП) [5, 38, 201, 323], реакции иммунофлюоресценции (РИФ) [20, 42, 54, 86, 101, 102, 175, 180], в твердофазном иммуноферментном анализе (ТФ ИФА) с использованием поли-клональных антител [52, 63, 73, 102, 161, 227, 270, 327], на основе молекулярных методов [53, 56, 60, 124, 127, 148, 260, 273]. РДП, РИФ, ТФ ИФА с использованием препаратов поликлональных антител низко чувствительны, так как последние, зачастую, имеют перекрестную реактивность [OIE, 2005].
Ретроспективная диагностика ИЛТ направлена, прежде всего, на обнаружение антител к вирусу: в РДП [5, 23, 38, 45, 90, 102], в непрямой РИФ [52, 102], в ТФ ИФА [19, 73, 216, 226, 270, 326], в реакции нейтрализации (РН) на цыплятах, КЭ и КК [11, 23, 38, 47, 91, 174, 263, 268].
Однако перечисленные методы исследований имеют ряд недостатков:
1. Для получения результата требуется несколько дней;
2. Высокая стоимость, трудоёмкость;
3. Диагностические исследования с использованием данных методов можно проводить лишь в ограниченном количестве специализированных центров, проводящих вирусологические исследование и обеспеченных специальным оборудованием и кадрами;
4. Недостаточная универсальность, экспрессность и чувствительность.
Твердофазный ИФА и МФА при использовании поликлональных сывороток обладают сравнительно одинаковой чувствительностью и специфичностью, и превосходят по этим показателям РДП и РН. РН - трудоемка, длительна в исполнении и требует значительных материальных затрат. Кроме того, и ИФА и МФА наиболее приемлемы для массовых исследований проб патматериала [52, 73, 102, 161, 226, 327].
По данным Bauer В. с соавтор. ТФ ИФА при обнаружении антител в сыворотках крови больных и вакцинированных против ИЛТ цыплят был специфичным и в 8 раз более чувствительным по сравнению с РН [73]. А по данным York J.J. с соавтор. (1983) чувствительность ТФ ИФА при определении уровня антител в сыворотках крови больных и вакцинированных против ИЛТ цыплят превышала в 16 - 32 раза РН [323].
Для ретроспективной серодиагностики ИЛТ в настоящее время в России используется непрямой ТФ ИФА с использованием контрольных поликлональных антител [19, 46, 48]. Однако поликлональные антитела часто имеют высокую перекрестную реактивность, что делает затруднительным интерпретацию результатов диагностических исследований. Получение биохимически гомогенных, стабильных высокоспецифичных и авидных реагентов в необходимых препаративных количествах на основе поликлональных антител из сывороток крови птицы и животных или из иммунноасцитических жидкостей очень сложно или практически невозможно. Поликлональные антитела гетерогенны, их наработка отличается по иммунологической активности в зависимости от вида животного - донора, метода иммунизации, степени очистки антигенсодержащего препарата и других неспецифических неопределенных причин. Получение гомогенных иммунных реагентов из поликлональных антител в больших препаративных количествах - технологически сложная, трудоемкая и дорогая работа.
Эти недостатки преодолеваются при постановке ИФА с использованием моноклональных антител (МКА). Кроме того, применение моноклональ-ных антител значительно повышает чувствительность и специфичность серологических методов диагностики и позволяет применять также РН и РИФ. При этом значительно сокращаются сроки исследований, по сравнению с рутинными серологическими методами, что немаловажно при одновременном массовом анализе проб.
Поэтому разработка в настоящее время модифицированных вариантов ТФ ИФА на основе МКА для обнаружения вируса ИЛТ в исследуемом материале и специфических антител в сыворотках вакцинированной, больной и переболевшей птицы; использование для диагностики заболевания и дифференциации от гриппа птиц, инфекционной бурсальной болезни, болезни Ньюкасла, болезни Марека, чумы уток, является актуальным. Кроме того, ИФА с использованием МКА к вирусу ИЛТ перспективен для дальнейшего исследования антигенных и иммуногенных свойств возбудителя.
ю
3.2. Цель н задачи исследований
Целью работы является разработка и усовершенствование средств и методов лабораторной диагностики ИЛТ на основе моноклональных антител. Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Получить антигенно-активные препараты очищенного вируса ИЛТ.
2. Получить гибридомы, стабильно продуцирующие моноклональные антитела к антигенам вируса ИЛТ; изучить иммунохимические свойства моноклональных антител.
3. Разработать и испытать модификации иммуноферментных методов (иммуногистохимии и твердофазного ИФА) на основе полученных моноклональных антител для обнаружения вирусных антигенов в тканях и органах больных и павших птиц и для выявления антител в сыворотках крови больных и вакцинированных птиц.
4. Разработать методические указания по диагностике ИЛТ птиц твердофазным иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител.
3.3. Научная новизна работы
Научная новизна состоит в том, что в результате исследований:
- получены шестнадцать новых клонов гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к полипептидам с молекулярной массой 30, 34, 35, 39, 60 кДа вируса ИЛТ;
- на основе моноклональных антител клонов гибридом 4А5В8, 2А10ЕЗ, 1C4F12, 1H8G11 и 1C10D10 разработан прямой вариант иммунопероксидаз-ного гистохимического метода для выявления антигенов вируса ИЛТ в мазках-отпечатках гортани и трахеи больных кур;
- на основе моноклональных антител клонов гибридом 4А5В7, 4А5В8, 2А10ЕЗ, 4А5С6, 4А5С10, 1С4Е7, 1C4F3, 1C4F12, 1С4В9, 1H8G11 и 1C10D10 разработан "сэндвич"-вариант ТФ ИФА для обнаружения и идентификации антигенов вируса ИЛТ;
- на основе моноклональных антител клонов гибридом 4А5В7, 4А5В8, 2AI0E3, 4А5С6, 4А5С10, 1С4Е7, 1C4F3, 1C4F12, 1H8G11 и 1C10D10 разработан непрямой "сэндвич"-вариант ТФ ИФА для обнаружения антител в сыворотках птиц.
3.4. Практическая значимость результатов
Депонированы и занесены в банк данных музея гибридом ГНУ ВНИ-ИВВиМ 16 клонов гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к полипептидам с молекулярной массой 30, 34, 35, 39, 60 кДа вируса ИЛТ.
Рекомендованы для включения в схему лабораторной диагностики прямой "сэндвич"-вариант ТФ ИФА на основе МКА для выявления антигенов вируса ИЛТ и непрямой "сэндвич"-вариант ТФ ИФА на основе МКА для выявления антител в сыворотках птиц.
Предложены методические указания для лабораторной диагностики инфекционного ларинготрахеита птиц твердофазным иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител.
3.5. Апробация и публикации результатов
Материалы диссертации доложены на научной конференции ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ (2004 г.), на международной конференции УГСХА (2006 г.) и на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ (2004, 2005г.г.). По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе статья в журнале "Ветеринария".
3.6. Основные положения, выносимые на защиту
1. Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к антигенам вируса ИЛТ.
2. Результаты разработки вариантов иммуноферментных методов на основе полученных моноклональных антител: прямой вариант иммуноперок-сидазного гистохимического метода и прямой "сэндвич"-вариант твердофазного иммуноферментного анализа для выявления антигенов вируса ИЛТ, непрямой "сэндвич"-вариант твердофазного иммуноферментного анализа для выявления антител в сыворотках крови птицы.
3. Диагностическая ценность прямого "сэндвич"-варианта ТФ ИФА для выявления антигенов вируса ИЛТ и непрямого "сэндвич"-варианта ТФ ИФА для выявления антител в сыворотках крови птицы. 3.7. Личный вклад автора в выполнении работы
Основной объем исследований проведен автором самостоятельно.
В выполнении отдельных этапов работы принимали участие следующие сотрудники института: д.б.н., ведущий научный сотрудник Пономарев В.Н. и к.в.н., старший научный сотрудник Капустина О.В. (получение препаратов очищенного вируса ИЛТ), к.б.н., старший научный сотрудник Середа СВ., к.б.н., старший научный сотрудник Анохина Е.Г. (определение полипептидной специфичности МКА).
