Введение к работе
Актуальность темы
Вакцинация является одним из основных способов профилактики инфекционных заболеваний. Первым прототипом вакцины было использование ослабленной формы возбудителя заболевания, позднее были разработаны способы инактивации возбудителей, позволяющие сохранить их иммуногенные свойства. Следующим этапом явилось создание субъединичных вакцин, использующих один или несколько белков патогенного организма или даже их отдельных фрагментов-эпитопов. Этот подход позволяет создавать полностью безопасные вакцины, однако подобные вакцины могут вызывать гораздо менее выраженный иммунный ответ, чем в случае использования аттенуированных или инактивированных возбудителей.
Решением этой проблемы может являться направленное конструирование наноструктур, имитирующих патоген и содержащих отдельные белки патогена на поверхности частицы-носителя. Данный подход позволяет использовать преимущества белковых вакцин и нивелировать их недостатки, имитируя взаимодействие вируса с иммунной системой. Способность биологических макромолекул к самосборке и самоорганизации является одной из отличительных черт живых систем и предоставляет поистине неисчерпаемые возможности для использования биомолекул в качестве строительных блоков «молекулярного конструктора» для направленного создания новых наноархитектур с заданными пространственными и функциональными свойствами. Одним из наиболее ярких примеров таких структур, обладающих четкой симметрией, обширными возможностями направленной модификации современными методами генной инженерии являются вирусные частицы и имеющие сходную структуру вирусоподобные частицы, образуемые в результате самособорки капсидных белков вирусов. В отличие от вирусов, такие вирусоподобные частицы не содержат генетического материала и
являются полностью безопасными. С использованием методов генетической инженерии можно получить «химерные» капсидные белки, к которым присоединен целевой антиген, а в результате самосборки таких гибридных белков могут быть получены рекомбинантные вирусоподобные частицы, на поверхности которых представлен целевой антиген. Представление антигенных детерминант на поверхности ВПЧ обеспечивает их высокую иммуногенность в сочетании с высоким выходом, легкостью очистки и стабильностью при хранении.
Рекомбинантные ВПЧ - вакцины могут быть получены в различных системах экспрессии, включая бактерии, дрожжи, клетки животных и растения. Растения могут стать недорогой и эффективной «биофабрикой» для получения таких вакцин. Важными преимуществами растительных систем экспрессии являются безопасность продукта и возможность получения больших объемов биомассы. Традиционные методы получения рекомбинантных белков в растениях предполагают проведение генетической трансформации ядерного или хлоропластного генома, однако, обычной проблемой является низкий выход рекомбинантного белка, обусловленная им высокая стоимость очистки, а также длительное время, необходимое для создания растений-продуцентов. Альтернативой являются вирусные системы транзиентной экспрессии. Амплификация целевого гена при репликации вируса-вектора в клетке растения обеспечивает высокий уровень экспрессии в течение нескольких дней.
Предметом настоящей работы является дизайн и получение рекомбинантных вирусоподобных частиц - носителей антигенов возбудителей двух социально-значимых заболеваний, - гриппа и краснухи. В качестве основы для создания рекомбинантных ВПЧ мы использовали ядерный антиген вируса гепатита В (НВс - антиген), мономеры которого собираются в наноразмерные вирусоподобные НВс-частицы.
Современные противогриппозные вакцины основаны на получаемом в куриных эмбрионах вирусе гриппа или его компонентах. Изменчивость
высокоиммуногенных поверхностных белков вируса гриппа гемагглютинина и нейраминидазы - требует практически ежегодного создания вакцин, соответствующих новым штаммам вируса. Поэтому актуальной является задача создания рекомбинантных противогриппозных вакцин «универсального» действия, основанных на отдельных высококонсервативных белках вируса гриппа, иммуногенность которых может быть повышена за счет присоединения к наночастице - носителю. Для решения этой задачи мы сконструировали НВс-частицы, представляющие внеклеточный домен М2 белка вируса гриппа и разработали методы их получения в бактериях и растениях.
В настоящее время иммунопрофилактики краснухи используется живая вакцина, разработанная более 30 лет назад. Задача создания рекомбинантной вакцины против краснухи, не проявляющей негативных эффектов, обусловленных использованием живого вируса, является актуальной. Одним из путей ее решения является создание нановакцин, в которых в иммуногенной форме представлены основные эпитопы поверхностного белка Е1 вируса краснухи.
В целом, разработка новых методов создания рекомбинантных вакцин с использованием достижений нанотехнологий и получения вакцинных препаратов в растениях-биофабриках является основой создания новых недорогих и эффективных препаратов для иммунопрофилактики социально-значимых заболеваний населения Российской Федерации. Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы является конструирование вирусоподобных наноразмерных частиц - носителей вакцинных белков вирусов гриппа и краснухи, и разработка методов их продукции в бактериях и растениях. Для этого в работе решались следующие задачи:
Создание систем экспрессии в клетках Escherichia coli вакцинных белков вируса краснухи и рекомбинантных НВс-частиц - носителей иммуно доминантных эпитопов белка El.
Получение рекомбинантных НВс-частиц, несущих М2е пептид вируса гриппа, в клетках Escherichia coli.
Конструирование самореплицирующихся вирусных векторов для экспрессии целевых белков в растениях.
4. Создание систем экспрессии вакцинных белков вируса краснухи и
гриппа в растениях Nicotiana benthamiana с помощью вирусных
векторов.
Научная новизна
Впервые получены рекомбинантные вирусоподобные частицы -носители иммуно доминантных эпитопов гликопротеина Е1 вируса краснухи, которые могут быть использованы как основа рекомбинантной вакцины против краснухи. Разработаны методы конструирования, получения в бактериальной системе экспрессии, выделения и очистки вирусоподобных НВс-частиц - носителей М2е пептида вируса пандемического штамма «свиного» гриппа HlNlv-2009. Показано, что иммунизация лабораторных животных полученным препаратом обеспечивает их защиту от летальной гриппозной инфекции.
Сконструированы вирусные векторы, обеспечивающие
высокоэффективную экспрессию целевых белков в растениях за счет повышения эффективности трансляции РНК вируса-вектора благодаря использованию трансляционного энхансера.
Впервые продемонстрирована возможность экспрессии в растениях белка Е1 вируса краснухи и продукции НВс-частиц - носителей эпитопов этого белка. Впервые создана система продукции в растениях вирусоподобных НВс-частиц, представляющих М2е пептид вируса гриппа на своей поверхности, что открывает возможность получения «универсальных» противогриппозных вакцин в растениях-биофабриках.
Практическая значимость
Разработанные методы конструирования и получения рекомбинантных вирусоподобных частиц - носителей антигенов вирусов гриппа и краснухи могут быть использованы для создания новых недорогих и эффективных рекомбинантных вакцин для профилактики этих заболеваний. В частности, НВс частицы - носители внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа являются основой «универсальной» противогриппозной вакцины, эффективной в отношении различных штаммов вируса гриппа типа А, в том числе новых потенциально пандемических штаммов птичьего и свиного гриппа. Апробация работы
Полученные в диссертации результаты были представлены автором на следующих международных и российских конференциях: международном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, Украина, 2008), 12-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых (Пущино, 2008г.), V съезде ВОГИС (Москва, 2009), The 1st Workshop on Plant Molecular Biotechnology - XV Biotechnology Summer School (Гданьск, Польша, 2009), конференции «Горизонты нанобиотехнологии» (Звенигород, 2009).
Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором, под его непосредственным руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Публикации
По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК. Получен патент на изобретение РФ.
Объем и структура диссертации
