Экспрессия консервативных антигенов вируса гриппа A в растениях на поверхности химерных частиц ВТМ : иммуногенные и протективные свойства кандидатных вакцин Петухова, Наталья Витальевна

Введение к работе

Актуальность проблемы.

Вирус гриппа является наиболее опасным респираторным заболеванием человека и животных. Сезонный грипп вызывает около 600 миллионов случаев заболеваний человека и 400 тысяч смертей каждый год. Реассортация человеческих, птичьих и свиных штаммов может дать начало новой пандемии, сходной с «Испанкой» 1918 г. (по разным оценкам, от 20 до 50 миллионов жертв). Большинство современных вакцин содержит НА (гемагглютинин) и NA (нейраминидазу). Эти гликопротеины являются высоко иммуногенными, но, одновременно, и высоко вариабельными, поэтому поиски «Священного Грааля» (Rudolph and Ben-Yedidia, 2011) сосредоточены на разработке вакцины широкого спектра действия, содержащей консервативные вирусные антигены. Наибольшее внимание уделяется эктодомену М2е (23 аминокислотных остатка, аа; практически неизменны у всех изолятов, известных с 1933 года) минорного белка М2 вируса гриппа А, образующего тетрамерные ионные каналы вириона. Установлено, что антитела к М2е могут обеспечивать защиту против субтипов вируса гриппа со сходной последовательностью пептида (Neirynck et al, 1999). 14 аа пептида слияния (fusion-пептид, fp), расположенного в N- терминальной части субъединицы НА2, являются единственной консервативной последовательностью среди всех НА вируса гриппа (Chun et al., 2008). Было показано, что моноклональные антитела к fusion-пептиду могут взаимодействовать практически со всеми вирусными НА (Li et al., 2010).

Экспрессия белков и пептидов в растениях имеет ряд ценных преимуществ: посттрансляционная модификация белков, как правило, сходна с таковой в животных клетках (Giddings, 2001); биобезопасность; быстрота и высокий уровень накопления целевых белков и пептидов; низкая себестоимость продукта; возможность создания так называемых «съедобных» вакцин против различных инфекций (Pascual et al., 2007).

Последовательности целевых пептидов могут быть клонированы в ген белка оболочки (БО) фитовируса, например, вируса табачной мозаики (ВТМ; Tobacco mosaic virus, TMV), таким образом, чтобы чужеродный пептид был экспонирован на поверхности химерной вирусной частицы (Chimeric Virus Particle, CVP) (Porta and Lomonossoff, 1998). Внесение структурных изменений и модификаций в БО может существенно влиять на биологию вируса и характер развития вирусной инфекции в растениях (Culver et al., 2002). Для успешной вакцинации антигены должны быть представлены иммунной системе в высоко упорядоченном, мультикопийном, квазикристаллическом виде; CVP является подходящей моделью и способна стимулировать пролиферацию дендритных клеток и других антиген-презентирующих клеток (Smith et al., 2009).

Цели и задачи исследования

Основной целью данной работы было получение кандидатной «универсальной» вакцины против вируса гриппа А на основе экспрессии консервативных антигенов М2е и fр в растениях на поверхности частиц ВТМ, а также изучение биологических свойств рекомбинантных вирусов и влияния модифицированных БО на развитие вирусной инфекции, в том числе на системный транспорт.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Создание вирусных векторов, предназначенных для агроинокуляции растений и несущих последовательности консервативных эпитопов вируса гриппа А (M2e и Гр) в открытой рамке трансляции БО ВТМ; мутагенез М2е-антигена.

2. Изучение круга растений-хозяев и особенностей инфекций, вызванных рекомбинантными вирусами.

3. Анализ экспрессии и динамики накопления модифицированных вариантов БО в инокулированных и системных листьях.

4. Исследование генетической стабильности рекомбинантных вирусов.

5. Анализ иммуногенных свойств предполагаемых химерных вирионов: соотношение антител к М2е-эпитопу и к носителю (БО); профили субклассов специфических иммуноглобулинов; возможное взаимодействие с белком М2 на поверхности клеток, зараженных вирусом гриппа А.

6. Определение протективных свойств химерных вирусных частиц TMV-M2e при заражении гомологичным и гетерологичным штаммами вируса гриппа А.

Научная новизна и практическая значимость Созданы вирусные векторы TMV-M2e и TMV-fp. На основе консенсусной человеческой последовательности М2е получили два мутантных варианта с заменами остатков цистеина (cys) в 17 и 19 положениях на остатки серина (ser) или аланина (ala). Все векторы были генетически стабильны и способны к эффективной системной инфекции, уровень накопления БО-М2е достигал 4 г/кг верхних листьев. Частицы TMV-M2e состояли из 2-х структурных белков (содержание БО- М2е - 90%). Развитие инфекции TMV-M2e-ala существенным образом отличалось от TMV-M2e- ser. Соотношение антител (АТ) к эпитопу и носителю (БО) в сыворотках мышей варьировало от 2.7/1 (ser) до 5/1 (ala); АТ взаимодействовали с белком М2 на поверхности клеток, зараженных вирусом гриппа. Профили иммуноглобулинов IgG1/IgG2a: 0.7/1 (ser) и 3.2/1 (ala). Мыши, вакцинированные TMV-M2e-ala/ser, были устойчивы к заражению 5 летальных доз (LD50) гомологичного вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1); TMV-M2e-ala обеспечивал высокую степень защиты от 5LD₅₀ гетерологичного вируса A/Califomia/04/09 (H1N1) (4 аа замены в последовательности М2е без учета мутаций цистеинов, уровень выживаемости 70%). Апробация работы

Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова.

Результаты работы докладывались на семинарах кафедры вирусологии Биологического факультета, а также на отечественных и международных конференциях: Юбилейная научная конференция «Грипп: эпидемиология, вирусология, профилактика и лечение» к 45-летию НИИ гриппа (Санкт-Петербург, Россия), 2012; The 4^th ESWI Influenza Conference (Malta), 2011; 36^th FEBS Congress «Biochemistry for Tomorrow's Medicine» (Torino, Italy), 2011; III International Forum «Rusnanotech» (Moscow, Russia), 2010; Международная конференция «Биотехнология, нанотехнология и физико-химическая биология» (Алма-Ата, Казахстан), 2010.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из которых 2 статьи в рецензируемых журналах и 5 тезисов международных конференций.

Структура работы

Похожие диссертации на Экспрессия консервативных антигенов вируса гриппа A в растениях на поверхности химерных частиц ВТМ : иммуногенные и протективные свойства кандидатных вакцин

Вирусоподобные наноразмерные частицы - носители антигенов вирусов гриппа и краснухиКотляров Роман Юрьевич

Характеристика рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI, несущего ДНК-вакцину против ВИЧ-1, и исследование его иммуногенных свойств в составе суппозиториевДаниленко, Алексей Валерьевич

Изучение свойств химеры флавивирусов Лангат и Денге 4 как кандидата в живую вакцину против клещевого энцефалита Припузова Наталья Сергеевна

Иммунобиологические свойства штамма ERA-СВ 20М вируса бешенства и разработка на его основе антирабической вакциныЛосич Милана Анатольевна

Синтез в растениях поверхностного антигена вируса гепатита B: повышение биологической безопасности трансгенных растенийПучко, Елена Николаевна

Разработка твердофазного иммуноферментного анализа для прямого обнаружения антигенов вируса классической чумы свинейВасильев Александр Павлович

Моноклональные антитела к антигенам вируса инфекционного ларинготрахеита птиц: получение и использованиеЧурин Александр Иванович

Оптимизация размножения вирусов гриппа птиц в различных субстратах и совершенствование инактивированных вакцин против вирусов гриппа птицВасильев Юрий Михайлович

Разработка методов ПЦР для выявления вируса гриппа птиц подтипов H3, H4, H5 и изучение биологических свойств изолятов вирусаБабин, Юрий Юрьевич

Эволюция высоковирулентного вируса гриппа A (H5N1) в экосистемах Северной Евразии : 2005-2009 гг.Щелканов, Михаил Юрьевич