Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Использование трансгенных растений в качестве продуцентов антител, вакцин и терапевтически ценных белков 10
1.1.1. Синтез биофармацевтических белков в трансгенных растениях 11
1.1.2. Производство антител с помощью трансгенных растений 13
1.1.3. Вакцины на основе трансгенных растений 17
1.2. Синтез гена поверхностного антигена вируса гепатита В в различных растительных системах 20
1.2.1. Вирус гепатита В, этиология вируса и его структурные компоненты 21
1.2.2. Вакцины против гепатита В на основе растений 24
1.2.3. Выбор растительных систем экспрессии и методов трансформации 25
1.2.4. Оптимизация экспрессии HBsAg в рекомбинантных растительных системах 28
1.2.5. Структурная характеристика НВзА, синтезированного в трансгенных растениях 29
1.2.6. Исследования иммуногенности НВэАд, синтезируемого трансгенными растениями 30
1.3. Повышение биологической безопасности трансгенных растений 32
1.3.1 .Получение безмаркерных трансгенных растений 34
1.3.1.1. Использование трансформации растений без селективных маркеров устойчивости 35
1.3.1.2. Метод котрансформации 35
1.3.1.3. Сайт-специфическая рекомбинация 36
1.3.1.4. Метод получения безмаркерных растений с использованием транспозонов 39
1.3.1.5. Использование векторной системы МАТ для получения безмаркерных растений 39
1.3.1.6. Удаление маркерных генов из хлоропластов растений 41
1.4.3аключение 42
2. Материалы и методы 44
2.1. Объекты исследования 44
2.2. Штаммы бактерий и плазмиды 44
2.3. Микр обиологические среды 44
2.4. Среды для культивирования растений 46
2.5. Растворы и буферы 48
2.6. Ферменты, использованные в работе 49
2.7. Выделение, очистка и манипуляции с плазмидной ДНК... 50
2.8. Конструирование плазмид для трансформации растений ... 50
2.9. Введение метки в ДНК 53
2.10. Скрининг рекомбинантных клонов гибридизацией на фильтрах 53
2.11. Гибридизация на фильтрах по Саузерну 54
2.12. Трансформация листовых эксплантов табака 54
2.13. Трансформация семян табака и томата с помощью вакуумной инфильтрации 55
2.14. Выделение суммарной растительной ДНК для ПЦР- анализа 55
2.15. Электрофорез в агарозном геле 57
2.16. ПЦР-анализ ДНК трансгенных растений 57
2.17. Выделение белка из тканей растений 57
2.18. Определение белка в растительных экстрактах 58
2.19. Иммуноферментный анализ 58
2.20. Оральная иммунизация мышей клубнями трансгенного картофеля 60
2.21. Измерение количества антител к HBsAg в сыворотке крови иммунизированных мышей 60
3. Результаты и обсуждение 62
3.1.Получение трансгенных растений, экспрессирующих ген HBsAg под контролем комбинированных агробактериальных промоторов 63
3.2.Оптимизация экспрессии гена HBsAg в трансгенных растениях 70
3.3. Получение безмаркерных трансгенных растений с геном HBsAg 75
3.4. Иммуногенность поверхностного антигена вируса гепатита В, синтезируемого трансгенными растениями картофеля 81
Заключение 86
Выводы 89
Список использованной литературы 90
- Вирус гепатита В, этиология вируса и его структурные компоненты
- Исследования иммуногенности НВэАд, синтезируемого трансгенными растениями
- Конструирование плазмид для трансформации растений
- Иммуногенность поверхностного антигена вируса гепатита В, синтезируемого трансгенными растениями картофеля
Введение к работе
Актуальность проблемы. В России остро стоит проблема профилактики заболевания гепатитом В. Кардинально решить этот вопрос может только проведение всеобщей вакцинации населения страны против гепатита В, начинаемой с группы риска. Растительные системы перспективны для производства рекомбинантных белков медицинского назначения, поскольку обладают рядом преимуществ перед другими эукариотными продуцентами. Растения не содержат патогенных для млекопитающих вирусов, а также обладают необходимыми механизмами энзиматической постсинтетической модификации для полноценного синтеза функциональных эукариотических белков. Актуальность задачи состоит в получении растений-продуцентов поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg, HBs-антигена) для фармакологического производства на их основе вакцинных препаратов против вируса гепатита В. Трансгенные растения с тканеспецифической экспрессией гена HBsAg позволят упростить процесс выделения и очистки антигена, либо вовсе его исключить при создании дешевых и безопасных съедобных вакцинных препаратов.
Для отбора трансгенных растений традиционно используют селективные гены устойчивости к антибиотикам и гербицидам или гены-репортеры. Используемые в настоящее время коммерческие трансгенные растения с устойчивостью к вредителям и гербицидам представляют существенную потенциальную биологическую и экологическую опасность, связанную с их негативным влиянием на полезные организмы агробиоценозов. В связи с этим остро стоит проблема разработки методов получения трансгенных растений нового поколения без "генетического мусора", к которому относятся селективные гены устойчивости к антибиотикам и гербицидам и другие маркерные гены.
Цели и задачи исследования. Цель данной работы - создать биобезопасные трансгенные растения, синтезирующие поверхностный антиген вируса гепатита В в количестве, достаточном для проведения доклинических испытаний, и исследовать иммуногенность полученных растений-продуцентов в экспериментах на лабораторных животных.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
-
Получить трансгенные растения, содержащие ген HBsAg под контролем различных промоторов.
-
Повысить уровень синтеза HBs-антигена в трансгенных растениях.
-
Создать биобезопасные безмаркерные растения, синтезирующие HBs-антиген.
-
Провести анализ иммуногенности на лабораторных мышах съедобной вакцины против гепатита В на основе трансгенных растений.
Научная новизна работы. Получены растения табака и культуры клеток и тканей с геном HBsAg под контролем промоторов генов маннопин-и октопинсинтазы агробактерий (Aocs)3AmasPmas. Проанализирована
экспрессия антигена в трансгенных растениях, показан ее тканеспецифичный характер под контролем данных промоторов.
Получены трансгенные растения, экспрессирующие ген HBsAg под контролем модифицированного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты CaMV 35S с четырьмя энхансерами. Количество HBs-антигена достигало 0,1% от общего растворимого белка растений, достаточное для исследования их иммуногенности в доклинических испытаниях.
С целью повышения биобезопасности трансгенных растений разработан способ получения безмаркерных трансгенных растений, содержащих ген HBsAg. Преимущество разработанного способа заключается в экспрессии в растениях генов целевых белков без дополнительных селективных генов или генов-репортеров. При этом сокращается время отбора трансгенных растений и появляется возможность прямой количественной оценки синтеза продукта целевого гена. Показан стабильный синтез HBs-антигена в растениях поколения F1.
Впервые проведены длительные доклинические испытания на животных клубней трансгенных растений картофеля в качестве съедобной вакцины. Уровень антител в сыворотке крови иммунизированных мышей был значительно выше протективного (до 350 мМе/мл) и сохранялся в течение более года после начала вакцинации.
Теоретическая и практическая значимость. Применение специфических промоторов позволит синтезировать нужный белок в съедобных органах растений, что упростит производство вакцин и позволит использовать их для оральной иммунизации. Данные, полученные в ходе доклинических испытаний, подтверждают перспективность использования трансгенных растений в качестве субстанции для производства вакцины против вируса гепатита В. Разработанный способ создания безмаркерных растений позволяет получать биобезопасные растения - продуценты терапевтически важных белков. Результаты работы могут быть использованы в научных исследованиях различных организаций в областях молекулярной биологии, биохимии и физиологии растений, в том числе Институтом молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Институтом физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, МГУ им. М.В. Ломоносова.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), на IX международной конференции «Биология культивируемых клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008), на Российско-Корейском семинаре «Современная наука и высокие технологии» (Пущино, 2008), на IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), на ХХ-ХХШ зимних международных молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2008-2011), на IV российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), на XVI-XVIII международных конференциях студентов, аспирантов и молодых
ученых «Ломоносов» (Москва, 2009-2011), на Пущинской научно-практической конференции «Системная биология» (Пущино, 2009), на 13-15-ой Международных пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009-2011), на Всероссийском симпозиуме «Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности» (Москва, 2010).
Конкурсная поддержка работы. Исследования проводились в лаборатории биотехнологии растений ФИБХ. На протяжении всего этого периода исследования были частью плановых НИР. Исследования поддержаны Российским фондом фундаментальных исследований, Программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека», Программой Президиума РАН «Поддержка инноваций и разработок», Программой Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере "Участник молодежного научно-инновационного конкурса (У.М.Н.И.К)"-2009.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 29 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах, 1 патент на изобретение, 6 статей в научных сборниках.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 107 страницах, состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка литературы, включающего 187 источников, из них 173 иностранных. Работа содержит 21 рисунок и 8 таблиц.
Вирус гепатита В, этиология вируса и его структурные компоненты
Гепатит В продолжает оставаться распространенным заболеванием в развивающихся странах. Вирус гепатита В (ВГВ) может вызывать как острую, так и хроническую форму болезни, приводя к хроническому активному гепатиту, циррозу и раку печени. Гепатит В имеет продолжительный инкубационный период (42-180 дней). Вирус передается через биологические жидкости, в основном через кровь. Новорожденные могут заражаться трансплацентарно или при прохождении через родовые пути., В развитых странах риск заражения наиболее высок у гомосексуалистов и инъекционных наркоманов, для развивающихся стран более характерна передача инфекции от матери к ребенку, что обычно приводит к хроническому носительству. Среди взрослого населения областей Африки и Юго-Восточной Азии, где высока заболеваемость гепатитом В, широко распространен рак печени. Риск особенно велик для носителей, заразившихся в раннем детстве. Рак печени развивается почти исключительно на фоне цирроза (Эмонд и др., 1998). Около 350-400 миллионов человек больны хроническим гепатитом В, что составляет 5% от общей численности населения Земли. Инфекция гепатита В может приводить к циррозу печени или гепатоцеллюлярной карциноме и, как результат, ежегодно погибает более миллиона людей в год (Michel, 2002; Sunil Kumar et al., 2007). В настоящее время наблюдается стремительный прогресс в разработке растительных вакцин против гепатита В.
Вирус гепатита В относится к семейству гепадновирусов и служит причиной сывороточного или парентерального гепатита (Murray, 1987). В сыворотке больного гепатитом В можно обнаружить частицы трех типов: крупные - частицы Дейна, и мелкие - сферические и тубулярные. Частицы Дейна - наиболее крупные и окружены двойной оболочкой (Tiollais et al., 1970) (рис. 1). Структуры, схожие с сердцевиной этих частиц, были обнаружены в печени при остром вирусном гепатите. Сферические и тубулярные частицы, по-видимому, представляют собой элементы внешней оболочки вируса. Отдельные частицы можно увидеть только на ранней стадии болезни, в дальнейшем они агглютинируются антителами в крупные комплексы. У хронических вирусоносителей такие комплексы отсутствуют. Частицы всех трех типов несут на поверхности HBsAg (поверхностный антиген вируса гепатита В). HBsAg появляется в крови после 1-3 месяцев инкубационного периода и при благоприятном течении болезни исчезает через несколько недель; у вирусоносителей HBsAg сохраняется неограниченно долго. Выработка антител к HBsAg обеспечивает иммунитет и происходит либо при заражении вирусом гепатита В, либо в результате вакцинации. HBsAg неоднороден - существует по меньшей мере восемь его подтипов. HBsAg сравнительно редко находят у европейцев и американцев и гораздо чаще - у японцев и жителей тропических стран. HBcAg (ядерный антиген вируса гепатита В) выявляется в ядрах пораженных гепатоцитов, а также в крови (как внутренний компонент частиц Дейна). Как правило, антитела к НВсА можно обнаружить через 3-5 недель после появления в сыворотке HBsAg. Они сохраняются в течение всей болезни и последующих нескольких лет. После вакцинации антитела к HBcAg не вырабатываются. Еще один антиген вируса гепатита В - HBeAg - компонент частицы Дейна. При остром вирусном гепатите он появляется на короткий срок и быстро исчезает. Считается, что его выявление в дальнейшем свидетельствует о репликации вируса. Выявление HBeAg в сыворотке говорит об инфекционности последней (Эмонд и др., 1998).
Идентифицированы гены вируса гепатита В, кодирующие соответствующие продукты генов: Рге-Э - ген для рецептора альбумина, Б- ген, кодирующий НВзА, Х-ген для HBxAg, С-ген для HBcAg/HBeAg, ген Р, кодирующий ДНК-полимеразу (обратную траснкриптазу). Рге-81-область НВзА представляет собой особый иммуногенный полипептид. Белок Рге-81 регулирует секрецию НВзА. Рге-82-область содержит место связывания для рАЛ-рецептора, который важен для связывания ВГВ с гепатоцитами (ЭйЬЬе а. ОегНс11, 1983; Тю11а1з е! а1., 1985). Во время заболевания в крови больных против этих составных частей вируса образуются различные антитела (Майер, 1999).
HBsAg имеет сложную антигенную структуру. Можно выделить различные подтипы, хотя корреляции между видом подтипа и тяжестью заболевания, его течением или хронизацией острого гепатита В выявить не удается. Все иммунологические варианты детерминированы изменением в гене 8. Известные изоляты ВГВ имеют специфичную для группы антигенную «а»-детерминанту, которая состоит из двух гидрофильных петель и расположена в определенной области HBsAg. В этой области происходят мутации, обусловленные точечными мутациями ДНК ВГВ, кодирующей «а»- детерминанту (рис. 2).
Различия, связанные с подтипами, несут ответственность за одновременное появление в одной и той же пробе сыворотки HBsAg и антител к нему. Определение подтипов и серотипов (adw, ayw, adr, ayr) большой клинической значимости не представляет, однако идентификация подтипов важна в эпидемиологическом плане, так как каждый подтип имеет специфическое географическое распределение (Peterson et al., 1984). Подтип ay доминирует в Африке, среднем Востоке и области Средиземноморья, подтип ad - в Северной Америке, Северной Европе, Азии и тихоокеанских островах.
Первой вакциной против гепатита В была вакцина, содержащая HBsAg, который выделялся из плазмы крови клинически здоровых антигеноносителей (плазменные вакцины). С развитием генетической инженерии появились рекомбинантные субъединичные вакцины, производимые в клетках дрожжей-продуцентов. Плазменные и рекомбинантные вакцины обладают одинаково высокой иммуногенностью при незначительной частоте поствакцинальных осложнений и побочных реакций. Курс вакцинации из трех прививок способен обеспечить невосприимчивость к последующему заражению гепатитом В у более чем 99% привитых (Ройт и др., 2000). В целом, процесс получения рекомбинантного белка при помощи дрожжей весьма продуктивен. Как результат, во всем мире используются вакцины второго поколения против гепатита В, выделенные из рекомбинантных штаммов дрожжей, таких как Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris (Михайлов, 1999).
Исследования иммуногенности НВэАд, синтезируемого трансгенными растениями
Для выделения плазмидной ДНК использовали ночную культуру бактерий в среде LB. Собирали бактериальные клетки центрифугированием. Очистку ДНК производили с помощью метода щелочного лизиса Бирнбойма и Доли (Birnboim a. Doly, 1979) либо с помощью наборов для выделения плазмид Zyppy Plasmid Miniprep Kit (Zymo Research, США). Для клонирования фрагментов ДНК в плазмидных векторах использовали детально описанные стандартные методики молекулярной биологии (Маниатис и др., 1984). Гидролиз ДНК рестриктазами проводили согласно рекомендациям фирмы-производителя. Фрагменты ДНК после разделения в агарозном или полиакриламидном гелях выделяли, как описано (ICRO Practical Course, 1988). Для первичного скрининга рекомбинантных клонов Е. coli использовали метод выделения плазмидной ДНК в геле (Sekar, 1987), либо гибридизацию бактериальных клонов на фильтрах (Маниатис и др., 1984). Перенос плазмид в A. tumefaciens осуществляли методом прямой трансформации клеток очищенной плазмидной ДНК (An et al., 1988), либо методом электропорации на приборе Gene Pulser (Bio-Rad, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Анализ рекомбинантных клонов А. tumefaciens проводили рестрикционным анализом плазмидных ДНК с последующей гибридизацией на фильтрах по Саузерну (Southern, 1975), либо гибридизацией бактериальных клонов на фильтрах (Маниатис и др., 1984).
В качестве источника гена поверхностного антигена вируса гепатита В использовали рекомбинантную плазмиду pSS-HBsAg, содержащую ген HBsAg (Рукавцова и др., 2003). В экспериментах по клонированию использовали векторы для трансформации растений рЕ1802 и рЕ1945, которые содержат промотор (Aocs)3AmasPmas, любезно предоставленные доктором С. Гелвином (Университет Пердью, США) (Ni et al., 1995). Фланкирование гена HBsAg специфическими последовательностями для молекулярного клонирования осуществляли в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, содержащих сайты рестрикции Крп\ и Sail:
Реакционная смесь содержала 0,1 мкг плазмидной ДНК pDES20 в качестве матрицы, 25 мМ KCl, 60 мМ Трис-HCl, pH 8.5 (при 25), 1,5 мМ MgCl2, 0,1% тритон Х-100, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,2 мМ смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов («USB», США), по 0,25 мкМ каждого праймера и 2,5 ед. ДНК-полимеразы Taq («СибЭнзим», Россия). Реакцию проводили в объеме 50 мкл при следующих условиях: 94 - 5 мин; 30 циклов: 94 - 1 мин, 55 - 1 мин, 72 - 1 мин, затем 72 - 7 мин на амплификаторе MJ Mini (Bio-Rad, США). Амплифицированный ген клонировали. в бинарный вектор рЕ1802 для трансформации растений по сайтам рестрикции КрпГ и Sali. Для клонирования в вектор рЕ1945 ген HBsAg был вырезан из плазмиды pSS-HBsAg по сайтам рестрикции Xhol и fr9l и встроен в вектор по этим же сайтам. Полученными конструкциями трансформировали штамм Е. coli НВ101. Полученные конструкции, содержащие ген HBsAg, переносили в штамм A. tiimefaciens LBA4404 (pAL4404) (Hoekema et al., 1983) методом прямой трансформации (An et al., 1988). Анализ ДНК полученных клонов проводили методом гибридизации по Саузерну с меченным 32Р ПЦР- продуктом гена HBsAg.
Для модификации гена HBsAg с учетом частоты встречаемости кодонов в растениях использовали программу Grafical Codon Usage Analyser (www.gcua.schoedl.de). Синтез модифицированного гена HBsAg проведен фирмой «Евроген» (ИБХ РАН, Москва). Синтезированный ген вырезали из вектора pALA («Евроген») с помощью эндонуклеазы рестрикции EcoRI и встраивали под контроль двойного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S) в вектор для трансформации растений pSS (Voss et al., 1995). Полученную генетическую конструкцию перенесли в штамм А. tumefaciens GV3101 (pMP90RK) (Koncz а. Schell, 1986) методом прямой трансформации.
Для создания плазмиды рВМ, не содержащей генов селективных маркеров устойчивости к антибиотикам и гербицидам, использовали бинарный вектор для трансформации растений pBIN19 (Frisch et al., 1995). Плазмиду pBIN19 гидролизовали эндонуклеазой рестрикционной Sphl. Из агарозного геля выделяли фрагмент размером 9188 п.н., концы сшивали ДНК-лигазой фага Т4. В итоге была получена плазмида рВМ без маркерного гена устойчивости к канамицину nptll, содержащая полилинкер с несколькими сайтами для клонирования. Ген HBsAg, находящийся под двойным промотором CaMV 35S (Рукавцова и др., 2003) вырезали из плазмиды pSS-Ag по сайту Sphl и встраивали в вектор рВМ по этому же сайту. Полученную плазмиду pBM-Ag перенесли в штамм А. tumefaciens LBA4404 (pAL4404) (Hoekema et al., 1983) методом прямой трансформации (An et al., 1988).
Вставку гена HBsAg под контроль промотора CaMV 35S с четырьмя энхансерами в бинарный вектор для трансформации растений pPCV91 (Strizhov et al., 1996) проводили по сайту рестрикции ВатШ. Ориентацию вставки определяли с помощью гидролиза плазмидной ДНК эндонуклеазой рестрикции Xbal. Полученную плазмиду pPCV-Ag использовали для трансформации супервирулентного штамма А. tumefaciens СВЕ21 (pTiBo542) (Revenkova et al., 1993).
Меченный ДНК-зонд для гибридизации на фильтрах по Саузерну получали, используя набор "Multiprime DNA labelling systems" (Amersham, Англия). Реакцию проводили согласно рекомендациям фирмы- производителя, используя отечественный препарат [а-32Р]- 1АТФ, в течение ночи при 25С. Меченный фрагмент ДНК отделяли от невключившихся дезоксинуклеозидтрифосфатов на колонке с сефадексом G-50 элюцией в ТЕ- буфере (Маниатис и др., 1984). Измерение радиоактивности полученных фракций выполняли на счетчике радиоактивности Beckman LS 6800 (США).
Колонии штрихом высевали на чашки Петри с агаризованной средой LB, содержащей соответствующий антибиотик, и инкубировали в течение 16 ч. Вырезали мембрану для переноса Hybond N+ (Amersham, Англия) по диаметру чашки (мембраны стерилизовали под ультрафиолетом по 10 мин с каждой стороны). Мембраны накладывали на поверхность агара, затем их снимали, отмечая ориентацию на чашке, и при необходимости подращивали на соответствующей среде. В других случаях отбирали часть клеток анализируемых клонов микробиологической петлей и наносили прямо на мембрану в определенной последовательности. Подготовив мембрану одним из указанных способов, ее затем помещали колониями вверх на 5 мин на фильтровальную бумагу, смоченную в денатурирующем растворе (1,5 М NaCl, 0,5 М NaOH). После этого мембраны переносили на фильтровальную бумагу, смоченную в нейтрализующем растворе (1,5 MNaCl, 0,5 М Tris HCl, pH 7,2, 0,001 М ЭДТА) также на 5 мин. Промывали 5 мин при покачивании в кювете с 2xSSC, затем высушивали.
Конструирование плазмид для трансформации растений
Для анализа иммуногенности на мышах съедобной вакцины на основе трансгенных растений использовали безмаркерные трансгенные растения картофеля Solanum tuberosum L. сорта Дезире, полученные с использованием рекомбинантной плазмиды pBM-Ag (Рукавцова и др., 2009а).
Ранее показано, что синтезированный в растениях HBs-антиген по своим физико-химическим и иммунологическим свойствам не отличается от рекомбинантного антигена, синтезируемого клетками дрожжей, и при введении в организм стимулирует образование специфичных иммуноглобулинов IgG (Thanavala et al., 1995). При пероральном употреблении HBs-антиген трансгенных растений более эффективен, чем очищенный дрожжевой рекомбинантный антиген. Поскольку HBs-антиген собирается в растительных клетках в мультимерные частицы, которые накапливаются внутри мембранных везикул, то такая естественная "биоинкапсуляция" в растительной клетке защищает антиген от агрессивного воздействия в пищеварительном тракте до тех пор, пока он не вступит в контакт с эффекторами иммунной мукозальной системы кишечника (Kong et al., 2001).
Содержание HBs-антигена в полученных растениях картофеля составило до 0,05% от суммарного растворимого белка. Ранее установлено, что продукт экспрессии гена HBsAg в трансгенных растениях присутствует в высокомолекулярной мультимерной форме (Шульга и др., 2004). Таким образом, в клетках трансгенных растений, как и в клетках рекомбинантных штаммов дрожжей-продуцентов HBsAg, идет сборка мономерных форм HBs- антигена в иммуногенные мультимерные агрегаты, которые могут быть использованы в качестве субстанции для получения вакцины против вируса гепатита В. Трансгенный картофель с геном HBsAg для получения клубней выращивали в закрытом грунте на станции искусственного климата «Биотрон». Количество HBs-антигеиа в клубнях растений, определенное с помощью тест- системы для иммуноферментного выявления HBsAg, составляло до 1 мкг/г сырой массы клубня.
Для изучения иммуногенности антигена, синтезируемого клубнями картофеля, использовали три группы по 10 аутбредных мышей NMRI весом 2325 г. Животные первой и второй групп питались трансгенными клубнями картофеля на 1, 7 и 14-е сутки эксперимента, в расчете 20 г клубней на мышь (что составило 20 мкг HBsAg), причем мышам первой группы давали в качестве адъюванта по 20 мкг гликопина (ГМДП). Контрольная группа получала в качестве корма стандартный корм без картофеля.
В связи с использованием рекомбинантных вакцин, обладающих слабой иммуногенностью, появляется необходимость использования адъювантов. Показано, что наиболее эффективными адъювантами являются соединения, активирующие переход клеток иммунной системы из состояния естественного ответа в состояние адаптивного специализированного ответа через активацию патоген-ассоциированных рецепторов (Guy, 2007). Таким требованиям полностью соответствует гликопин (ГМДП). Это вещество представляет собой фрагмент клеточной стенки бактерий, способный эффективно модулировать иммунный статус и активировать биосинтез антител (Ростовцева и др., 1981; Иванов и др., 1996). В настоящее время ГМДП применяется в медицине и ветеринарии в качестве иммунокорректора и адъюванта.
Для оценки иммунитета против гепатита В у мышей каждой группы собирали препараты крови из хвостовой вены с интервалом 10-14 суток. Получаемую сыворотку крови замораживали и хранили на -20 С. Все собранные образцы анализировали методом ИФА на наличие антител против HBsAg, используя тест-систему D-0562 (ЗАО «Вектор-Бест», Россия).
Показано, что уровень антител к HBsAg в сыворотке крови мышей первой и второй групп начинал увеличиваться на 36-50-е сутки после первого кормления (рис. 21). У мышей группы, получавшей трансгенный картофель вместе с адъювантом ГМДП, содержание антител к HBsAg составило до 85 мМе/мл.
У мышей, получавших картофель без адъюваита, уровень антител на 50-е сутки с начала эксперимента был выше - до 170 мМе/мл. В крови мышей третьей, контрольной группы, антител к HBsAg не обнаружено.
С целью исследования усиления иммунного ответа против HBsAg, синтезируемого трансгенными растениями, на 71-е сутки эксперимента животным первой и второй экспериментальных групп вводили внутрибрюшинно по 0,5 мкг рекомбинантной дрожжевой вакцины против гепатита В (НПК «Комбиотех», Москва). Содержание антител стало повышаться у мышей обеих экспериментальных групп уже через неделю и достигло максимума у разных мышей через 15-43 суток после инъекции (до 250-350 мМе/мл). Скорость и амплитуда повышения титра HBs-антител были различны среди животных, что зависит от физиологических особенностей отдельных мышей. Вторичный иммунный ответ очень быстро развивался при повторном введении антигена, что происходит за счет клеточного и гуморального иммунитета, активируются клетки памяти. Достоверных различий в уровне антител между группами мышей, получавших трансгенный картофель с адъювантом ГМДП и без адъюванта, не обнаружено. Однако в первой группе больше мышей дали иммунный ответ (8 из 10) по сравнению со второй группой (4 из 10). На 120-е сутки после начала эксперимента уровень антител к HBsAg в обеих группах мышей оставался протективным (более 10 мМе/мл) и составлял 50-100 мМе/мл.
Через год было проведено повторное трехкратное кормление мышей экспериментальных групп клубнями трансгенного картофеля без дополнительного введения адъюванта и рекомбинантной вакцины. У мышей, проявляющих иммунный ответ к вирусу гепатита В во время предыдущего эксперимента, уровень антител к HBsAg в сыворотке крови повысился до 140185 мМе/мл и сохранялся в течение нескольких месяцев (рис. 21). Таким образом, была проведена бустерная вакцинация для усиления постиммунизационной защиты, а также подтверждено, что у животных сохраняется стойкая иммунологическая память к инфекции. Следует отметить,
Иммуногенность поверхностного антигена вируса гепатита В, синтезируемого трансгенными растениями картофеля
Различия в преимуществе использования кодонов среди разных организмов приводят к многочисленным проблемам, касающимся экспрессии гетерологичных генов. Некоторые гены, в частности бактериальные, неэффективно экспрессируются в растениях, поскольку их ДНК содержит множество последовательностей, которые воспринимаются растительными клетками как места сплайсинга, сигналы полиаденилирования, терминации транскрипции и сигналы деградации мРНК (van Aarssen et al., 1995; De Rocher et al., 1998). Кроме того, y растений другая частота использования кодонов по сравнению с бактериями и другими организмами. Значительно повысить экспрессию чужеродных белков в растениях обычно удается с помощью значительной модификации исходных последовательностей генов (Strizhov et al., 1996).
Для повышения экспрессии HBs-антигена в клетках трансгенных растений нами проведено изменение нуклеотидной последовательности гена HBsAg с учетом частоты встречаемости кодонов в растениях (рис. 13). Для модификации гена использовали программу Grafcal Codon Usage Analyser (www.gcua.schoedl.de).
Синтез модифицированного гена HBsAg проведен фирмой «Евроген» (ИБХ РАН, Москва). Синтезированный ген встроен под контроль сильного вирусного промотора с двойным энхансером на основе промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S). Генетические конструкции перенесли в штамм A. tumefaciens GV3101 (pMP90RK) методом прямой трансформации. Полученные штаммы агробактерий использовали для заражения листовых дисков табака, картофеля и томата.
Регенеранты трансгенных растений были подвергнуты комплексному молекулярно-биологическому и биохимическому анализу. Исследования показали, что при использовании модифицированной последовательности гена HBsAg уровень экспрессии антигена остался таким же, как и при последовательности гена HBsAg. Точками обозначены замены нуклеотидов. использовании исходной последовательности (не более 0,01-0,05% от общего растворимого белка). Вероятно, для достижения более высокого уровня синтеза НВз-антигена в растениях требуется использование более сильных регуляторных элементов, например, промотора с несколькими энхансерами.
Для усиления экспрессии НВз-антигена в трансгенных растениях нами получена генетическая конструкция с геном HBsAg на основе бинарного растительного вектора рРСУ91 (БйягЬоу et а1., 1996). Вектор для трансформации растений рРСУ91 был создан на основе плазмиды рРСУ720 (Копсг е1 а1., 1994). Этот вектор содержит промотор СаМУ 358 с четырьмя энхансерами и нетранслируемую лидерную последовательность АО, тРНК вируса табачной мозаики (ЭаШе а. Каёо, 1989). Ген HBsAg встроили в этот вектор по сайту рестрикции ВатШ и получили плазмиду pPCV-Ag (рис. 14), которую перенесли в супервирулентный штамм А. Ште/аЫет СВЕ21 (рТШо542) (Ыеуепкоуа е! а1., 1993).
Трансгенные растения табака и томата, содержащие ген НВяА% под контролем промотора СаМУ 358 с четырьмя энхансерами, получены методами агробактериальной трансформации листовых эксплантов и вакуумной инфильтрации семян. Экспрессия гена в таких растениях возросла не менее, чем в два раза по сравнению с экспрессией в ранее полученных растениях, в которых ген HBsAg находился под контролем двойного промотора 35Б РНК вируса мозаики цветной капусты. Синтез НВз-антигена составил до 0,1% от общего растворимого белка, что является уровнем, достаточным для получения вакцины против гепатита В на основе таких растений и проведения доклинических испытаний (рис. 15).
Нами разработан способ получения безмаркерных трансгенных растений, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В (Захарченко и др., 2009; Рукавцова и др., 2009а, б). Преимущество разработанного метода заключается в том, что обеспечивается экологическая и биологическая безопасность трансгенных растений, экспрессирующих гены целевых белков без дополнительных селективных генов или генов- репортеров. При этом сокращается время отбора трансгенных растений и одновременно появляется возможность прямой количественной оценки синтеза продукта целевого гена.
На основе вектора pBIN19 (Frisch, 1995) в лаборатории биотехнологии растений ФИБХ сконструирована плазмида рВМ с репликоном широкого круга хозяев RK2, путем удаления гена устойчивости к антибиотику канамицину nptll, вместе с промотором и сигналом полиаденилирования (Рукавцова и др., 2009а, б). Вектор для трансформации растений рВМ содержит область Т-ДНК агробактерий для интеграции в растительный геном, а также полилинкер исходного вектора с удобными сайтами для клонирования (рис. 16). При этом плазмида рВМ укорочена на 2600 п.н. по сравнению с исходным вектором pBIN19, что дает преимущества при трансформации растений, так как может снизить нежелательный эффект длинных векторных последовательностей на плотность упаковки ДНК в хроматин и, соответственно, на экспрессию целевого гена (Etchberger а. Hobert, 2008). Для отбора бактериальных генов в векторе присутствует ген nptlll (Trieu-Cuot, 1983), который в растительный геном не включается, поскольку содержится вне области агробактериальной Т-ДНК. С целью создания трансгенных растений без дополнительных селективных генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам, в вектор рВМ был встроен ген HBsAg под контролем промотора CaMV 35SS (рис. 16) . Плазмиду pBM-Ag перенесли в A. tumefaciens LBA 4404 (pAL4404) и полученными агробактериями трансформировали листовые экспланты табака и гипокотили томата, а также семена методом вакуумной инфильтрации. С помощью имму но ферментного анализа произвели отбор трансгенных растений, содержащих ген HBsAg. Этот анализ, основанный на высокой избирательности и специфичности реакций "антиген-антитело", обладает рядом преимуществ: использование минимальных количеств образцов, высокая чувствительность (0,1-0,5 нг/мл), возможность как качественной, так и количественной оценки результатов экспрессии целевого гена (рис. 17).
Семена, полученные от безмаркерных трансгенных растений табака и томата, экспрессирующих HBs-антиген под контролем двойного промотора CaMV 35SS, были простерилизованы и высажены на среду МС без селективных агентов. Спустя месяц у проростков табака и томата поколения F1 отбирали листья и подвергали молекулярно-генетическому и биохимическому анализу. Наличие гена HBsAg в растениях поколения F1 подтверждено с помощью ПНР (рис. 18).
Белковые экстракты из листьев некоторых линий растений поколения F1 проанализированы на наличие HBs-антигена (рис. 19, 20). Проведено сравнение безмаркерных трансгенных растений табака и томата поколений F0 и F1, содержащих ген HBsAg под контролем промотора CaMV 35SS. Показано, что экспрессия антигена в нескольких линиях трансгенных растений табака и томата, выращенных в культуре in vitro, составляла до 0,02-0,05% от общего растворимого белка. В экстрактах контрольных, трансформированных растений антигенной активности не выявлено.
