Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Актуальность работы 7
1.2. Цель и задачи исследований 8
1.3. Научная новизна 9
1.4. Практическая значимость и реализация результатов исследований ... 9
1.5. Апробация работы 10
1.6. Публикации 10
1.7. Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту 10
1.8. Личный вклад соискателя 10
1.9. Структура и объём работы 11
2. Методы и исследования 11
2.1. Современная таксономия, патогенность вируса 11
2.2. Культивирование вируса КЧС in vitro 12
2.3. Патогенез, течение и симптомы болезни 13
2.4. Средства и методы дифференциальной лабораторной диагностики классической чумы свиней - обзор и критическая оценка 16
2.4.1. "Ранние" методы лабораторной диагностики КЧС 17
2.4.1.1. Прямое обнаружение вирусных антигенов 17
2.4.1.2. Изоляция и идентификация инфекционного вируса КЧС 17
2.4.1.3. Обнаружение вирусспецифических антител 18
2.4.2. Новые методы лабораторной диагностики КЧС 20
2.4.2.1. Результаты достижения молекулярной биологии вируса и их роль в развитии методов лабораторной диагностики КЧС 20
2.4.2.2. Моноклональные антитела - получение, использование для прямого обнаружения вируса 22
2.4.2.3. Гистохимические варианты иммуноферментного анализа 26
2.4.2.4. Методы твердофазного иммуноферментного анализа для обнаружения антигена вируса КЧС в крови и пробах органов 27
2.4.2.5. Методы твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) для обнаружения антител к вирусу КЧС в сыворотках проб крови 30
2.4.2.6. Методы анализа генома 31
2.5. Методы дифференциации полевых изолятов и вакцинных штаммов вируса КЧС 32
2.6. Заключение 33
3. Собственные исследования 34
3.1. Материалы "34
3.1.1. Вирусы 34
3.1.2. Животные 35
3.1.3. Культуры клеток 35
3.1.4. Основные реактивы, приборы 36
3.1.5. Диагностические препараты: 41
3.2. Методы 42
3.2.1. Выращивание и титрование вируса КЧС 42
3.2.2. Получение препаративного количества очищенного вируса КЧС 42
3.2.3. Приготовление специфических и нормальных культуральных антигенов 43
3.2.4. Получение моноклональных антител к вирусу КЧС 43
3.2.5. Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ) 43
3.2.6. Дот-блот анализ и вестерн-блот белков 43
3.2.7. Выделение моноклональных антител из иммуно-асцитических жидкостей мышей 44
3.2.8. Приготовление иммунопероксидазных конъюгатов 45
3.2.9 Определение концентрации белка 46
3.2.10. Методы иммунофлуоресценции 46
3.2.11. Гистохимический иммуноферментный анализ 47
3.2.12. Методы твердофазного иммуноферментного анализа 47
3.2.13. Реакция нейтрализации 49
3.2.14. Определение функциональных свойств метода ТФА ИФА 50
3.2.15. Статистические методы обработки результатов 50
4. Результаты собственных исследований 51
4.2. Получение антигенов вируса КЧС 51
4.2.1.Очистка вируса КЧС 51
4.2.2. Культивирование рекомбинантного вируса осповакцины (Рек-КЧС) и оценка экспрессии полипептидов вируса КЧС 52
4.3. Получение гибридом, секретирующих МА к структурным поли пептидам вируса КЧС 55
4.3.1. Гипериммунизация мышей BALB/c вирусом КЧС и контроль иммунного ответа 56
4.3.2. Гибридизация клеток 57
4.3.3. Скрининг гибридом, секретирующих моноклональные антитела к вирусу КЧС 58
4.3.4. Результаты скрининга полученных гибридом 60
4.3.5. Получение препаративных количеств моноклональных антител, определение их активности и специфичности 62
4.3.6. Определение иммунохимических характеристик монокло нальных антител 64
4.4. Разработка двухсайтового ТФ ИФА для обнаружения антигенов вируса КЧС 67
4.4.1. Контроль активности и специфичности коньюгатов МА-ПХ 67
4.4.2. Определение и отбор улавливающих и детектирующих моноклональных антител 70
4.4.3. Оптимизация метода двухсайтового ТФ-ИФА для обнаружения культуральных антигенов вируса КЧС 74
4.4.4. Определение условий постановки двухсайтового ТФ ИФА для обнаружения антигенов вируса КЧС в патологическом материале 76
4.5. Определение аналитической и диагностической чувствительности и специфичности двухсайтового ТФ ИФА при обнаружении антигена вируса КЧС у экспериментально заражённых свиней 80
4.6. Апробация двухсайтового ТФ ИФА при вспышках КЧС на свинокомплексах 85
5.Обсуждение результатов 87
6. Выводы 99
7. Практические предложения 100
8. Список литературы 101
9. Приложения 112
- Практическая значимость и реализация результатов исследований
- Средства и методы дифференциальной лабораторной диагностики классической чумы свиней - обзор и критическая оценка
- Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ)
- Культивирование рекомбинантного вируса осповакцины (Рек-КЧС) и оценка экспрессии полипептидов вируса КЧС
Введение к работе
Несмотря на многолетние усилия, прилагаемые для ликвидации классической чумы свиней (КЧС), болезнь продолжает представлять серьезную угрозу свиноводству во всем мире. Благоприятная эпизоотическая ситуация в России, значительное сокращение числа вспышек классической чумы свиней, (9 - в 2002 г. и 6 - в 2003 г.) привели к относительному благополучию страны по КЧС, однако угроза спорадических вспышек болезни, в том числе в крупных свинокомплексах, постоянно существует.
Различные формы течения болезни, циркуляция вируса различной патогенности на фоне вакцинированного поголовья свиней, вторичные инфекции приводят к многообразию клинических симптомов, патологоанатомических изменений, что затрудняет постановку точного диагноза на классическую чуму свиней и оценку истинной эпизоотической ситуации (9).
Для проведения лабораторных исследований на КЧС применяется метод выделения вируса в культуре клеток с последующей идентификацией иммунофлуоресценцией, который в настоящее время считается эталонным (OIE, 2000), но его использование возможно только в хорошо оснащенных, вирусологических лабораториях или научных учреждениях (3, 7, 8).
Для прямого обнаружения вируса непосредственно в патологическом материале используются реакция прямой иммунофлуоресценции и полимеразная цепная реакция (ПЦР), однако первый метод обладает невысокой чувствительностью (26-77%) и субъективностью (5, 7, 9, 119), а ПЦР хотя и признан весьма полезным диагностическим инструментом, особенно при исследовании аутолизированных или цитотоксических проб, пока применяют для исследования ограниченного количества проб, и в основном, для филогенетических исследований полевых изолятов вируса (29, 104, 120).
В ведущих лабораториях Европейского Союза и США для обнаружения антигена вируса КЧС разработаны несколько вариантов иммуноферментного анализа под разными коммерческими названиями: CHEKiT® CSF-VIRUS (DR.BOMMELI AG, Швейцария), Herd Chek CSFV Ag, (IDEXX, США), SERELISA HCV Ag (RHONE MERIEUX, Франция), однако сведения об их диагностической оценке ограничены. В России были выполнены работы по разработке метода прямого обнаружения специфического антигена вируса, основанного на ингибиции рекомбинантного белка Е2 непрямым жидкофазным блокирующим вариантом ИФА (Бъядовская О.П. и соавт., 2002), но в ветеринарных лабораториях метод пока не используется.
Таким образом, в связи с очевидной необходимостью решения проблемы мониторинга и ликвидации болезни на территории России, необходим дополнительный, доступный и чувствительный метод прямого обнаружения антигена вируса КЧС в патологическом материале для использования в региональных лабораториях и, особенно, при вспышках КЧС в промышленных свинокомплексах.
1.2. Цель и задачи исследований.
Основной целью исследований являлась разработка твердофазного иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител для прямого обнаружения антигенов вируса КЧС в органах и тканях зараженных свиней.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие основные задачи:
получить стабильные клоны гибридом, продуцирующие моноклональные антитела к антигенным детерминантам структурного полипептида Е2 вируса классической чумы свиней;
- отработать методы скрининга моноклональных антител и определить их иммунологическую и полипептидную активность, специфичность, биохимические характеристики; определить оптимальные концентрации и условия взаимодействия улавливающих и детектирующих моноклональных антител с антигеном вируса КЧС;
разработать двухсайтовый ТФ ИФА для прямого обнаружения антигенов вируса КЧС и определить диагностические объекты для исследования;
изучить аналитическую и диагностическую чувствительность, специфичность двухсайтового ТФ ИФА при исследовании патологического материала от экспериментально заражённых вирусом классической чумы свиней и при вспышках болезни в свинокомплексах.
1.3. Научная новизна.
Получено 9 клонов гибридных клеток, стабильно секретирующие моноклональные антитела, специфичные к антигенным детерминантам основного структурного полипептида Е2 вируса КЧС. На основе сэндвич ТФ ИФА усовершенствован способ отбора моноклональных антител для использования в качестве улавливающих и детектирующих структурный полипептид Е2 вируса КЧС.
Разработан метод двухсайтового ТФ ИФА для прямого обнаружения антигена вируса КЧС в лейкоцитах крови инфицированных вирусом КЧС свиней, пригодный для лабораторной диагностики и мониторинга болезни.
1.4. Практическая значимость и реализация результатов исследований.
На основании результатов апробации в экспериментальных условиях, проведении экспертизы полевого патологического материала и комиссионных испытаний разработанный метод двухсайтового ТФ ИФА рекомендован для лабораторной диагностики КЧС и мониторинга болезни в свинокомплексах.
Результаты исследований стали основой для изготовления Набора препаратов для обнаружения вируса классической чумы свиней методом двухсайтового твердофазного иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител. Пригодность разработанного твердофазного иммуноферментного анализа для прямого обнаружения антигенов вируса классической чумы свиней подтверждена комиссионными испытаниями и при проведении диагностических исследований на классическую чуму свиней в ГНУ ВНИИВВиМ.
1.5. Апробация работы.
Результаты исследований, выполненных по теме диссертации, доложены и обсуждены на заседаниях учёного совета ГНУ ВНИИВВиМ в 2001-2004 г.г., Международной научно-практической конференции «Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов» (г. Покров 2003)
1.6. Публикации.
По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.
1.7. Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту:
- методы получения моноклональных антител к основному структурному полипептиду Е2 вируса КЧС, оценка их пригодности в качестве диагностических препаратов для иммунохимических реакций;
- отбор и характеристика улавливающих и детектирующих моноклональных антител к разным сайтам полипептида Е2 вируса, как основа разработки метода двухсайтового твердофазного иммуноферментного анализа для прямого обнаружения вируса КЧС.
- аналитическая и диагностическая чувствительность, специфичность двухсайтового ТФ ИФА, результаты его апробации при исследовании патологического материала от экспериментально заражённых животных и в лабораторной диагностике КЧС.
1.8. Личный вклад соискателя
Основной объём исследований проведён автором самостоятельно. Изучение иммунохимических характеристик моноклональных антител проводились совместно с к.б.н., старшим научным сотрудником Анохиной Е.Г.
1.9. Структура и объём работы
Диссертация изложена на ПО страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения.
Работа иллюстрирована 21 таблицей, 8 рисунками. Список литературы включает 151 источник, из которых 134 зарубежные.
Практическая значимость и реализация результатов исследований
На основании результатов апробации в экспериментальных условиях, проведении экспертизы полевого патологического материала и комиссионных испытаний разработанный метод двухсайтового ТФ ИФА рекомендован для лабораторной диагностики КЧС и мониторинга болезни в свинокомплексах. Результаты исследований стали основой для изготовления Набора препаратов для обнаружения вируса классической чумы свиней методом двухсайтового твердофазного иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител. Пригодность разработанного твердофазного иммуноферментного анализа для прямого обнаружения антигенов вируса классической чумы свиней подтверждена комиссионными испытаниями и при проведении диагностических исследований на классическую чуму свиней в ГНУ ВНИИВВиМ. Результаты исследований, выполненных по теме диссертации, доложены и обсуждены на заседаниях учёного совета ГНУ ВНИИВВиМ в 2001-2004 г.г., Международной научно-практической конференции «Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов» (г. Покров 2003) По теме диссертации опубликовано 7 научных работ. - методы получения моноклональных антител к основному структурному полипептиду Е2 вируса КЧС, оценка их пригодности в качестве диагностических препаратов для иммунохимических реакций; - отбор и характеристика улавливающих и детектирующих моноклональных антител к разным сайтам полипептида Е2 вируса, как основа разработки метода двухсайтового твердофазного иммуноферментного анализа для прямого обнаружения вируса КЧС. - аналитическая и диагностическая чувствительность, специфичность двухсайтового ТФ ИФА, результаты его апробации при исследовании патологического материала от экспериментально заражённых животных и в лабораторной диагностике КЧС.
Основной объём исследований проведён автором самостоятельно. Изучение иммунохимических характеристик моноклональных антител проводились совместно с к.б.н., старшим научным сотрудником Анохиной Е.Г. Диссертация изложена на ПО страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Работа иллюстрирована 21 таблицей, 8 рисунками. Список литературы включает 151 источник, из которых 134 зарубежные. Возбудитель КЧС - мелкий (диаметр 40 нм), оболочечный, плюс-РНК содержащий вирус, имеющий икосаэдрический нуклеокапсид. Открытие близкого антигенного родства между вирусами КЧС и вирусной диареи крупного рогатого скота (42) стало основанием для группировки этих двух вирусов под названием "пестивирусы" (37). Позже в эту группу был включен вирус пограничной болезни овец, когда было доказано его антигенное родство с вирусами диареи крупного рогатого скота и КЧС (95). Между вирусами установлены антигенные связи и свиньи могут заражаться вирусами жвачных (22, 35, 100, 102, 108, 119). Основываясь на результатах фундаментального изучения структуры и организации геномов вирусов семейства "Togaviridae", в 1985 году таксономическое положение пестивирусов было пересмотрено и создано новое семейство "Flaviviridae", к которому в 1991 году отнесен род "Pestivirus" (58). В настоящее время идентифицировано 4 основные субгруппы рода "Pestivirus":
Средства и методы дифференциальной лабораторной диагностики классической чумы свиней - обзор и критическая оценка
С точки зрения разработки и усовершенствования средств и методов диагностики при КЧС можно выделить два периода: первый период (60-е -середина 80-х годов) характеризовался использованием традиционных для того времени подходов, т.е. испытание и отбор известных серологических методов или реакций. С середины 80-х годов на основании результатов молекулярного клонирования и сиквенирования был расшифрован геном вируса (126), получены моноклональные антитела (147), что дало новый толчок для целенаправленного совершенствования существующих и разработке новых методов определения вируса и антител на основе полипептидной специфичности моноклональных антител и обнаружения вирусспецифической РНК (или её фрагментов).
Использование РДП, РСК, РНГА, ИЭОФ, несмотря на длительное, детальное изучение при КЧС, не нашли применения в лабораторной диагностике из-за их низкой чувствительности и неудовлетворительной специфичности.
Первые работы по использованию метода иммунофлуоресценции для прямого обнаружения антигенов вируса в тканях органов инфицированных свиней относятся к началу 60-х годов (115). Метод оказался наиболее пригодным и признанным для быстрой и точной лабораторной диагностики КЧС во всех лабораториях мира и странах, которые успешно провели ликвидацию болезни (34). Чувствительность метода зависела от правильности отбора проб, стадии болезни, типа течения инфекции и вирулентности вируса. Так, при исследовании проб от заражённых свиней при вспышке, чувствительность составляла 77 - 95%, а проб, полученных при экспериментальном заражении -100% (9,10).
Несмотря на высокую чувствительность метода, существуют и определённые трудности. Одной из основных является проблема дифференциации полевых и вакцинных штаммов, в частности, при исследовании проб, полученных от вакцинированных свиней.
Метод изоляции инфекционного вируса КЧС, особенно с использованием культур клеток свиного происхождения (РК-15, SK-6) имеет высокую чувствительность и специфичность для лабораторной диагностики болезни. Несмотря на единичные сообщения о цитопатогенных изолятах (23, 77, 78, 91) вирус КЧС не обладает цитопатогенным эффектом для первичных и перевиваемых культур клеток свиней, поэтому его размножение определяют иммунофлуоресценцией. Чувствительность метода выделения зависела от используемой культуральной системы, правильности отбора и доставки проб для исследования и составляла 97-100 %. При соблюдении необходимых условий результат может быть получен через 24 часа после инокуляции культуры клеток исследуемым материалом. Основными факторами, влияющими на чувствительность метода, являются время отбора проб от момента заражения животных и от вирулентности вируса, содержание которого в крови или органах может быть ниже возможности чувствительности культуры клеток или присутствие специфических антител, блокирующих инфекционность вируса (8,10,124). Специфичность метода изоляции вируса с использованием культур клеток и иммунофлуоресцентного метода идентификации некоторое время была удовлетворительной, однако, доказанный позже факт отсутствия строгой видовой специфичности пестивирусов и возможность выделения от свиней пестивирусов жвачных (44, 48, 102) привело к необходимости их дифференциации. В случае использования для специфической профилактики вакцин, приготовленных на основе живых модифицированных штаммов, маловероятна циркуляция пестивирусов жвачных у свиней, однако существует необходимость дифференциации полевого изолята от вакцинного. Однако самым существенным в использовании метода, несмотря на его дороговизну, является единственная возможность выделения новых, в том числе, "непредвиденных" штаммов вируса (135, 136, 137).
Как и для обнаружения антигенов, для обнаружения антител были испытаны практически все известные серологические реакции, но оказалось слишком много вопросов, которые сильно затрудняли их применение (ограниченная чувствительность РДП или ИЭОФ для обнаружения антител, особенно у животных на ранней стадии болезни или персистенции вируса).
Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ)
В основе получения моноклональных антител использовали методы Kohler G., Milstein С, 1975 и Wensvoort G. и соавт.(144), в нашей модификации. Анализ белков проводили в пластинчатых гелях 12x10x0.08 см в прерывистой буферной системе как описано Laemmly U.K., (1970).
Белки переносили из агарозных гелей на нитроцеллюлозные мембраны (НЦМ) путем выжимания пластинчатого геля. При проведении переноса белков из агарозного геля на НЦМ использовали метод получения отпечатков путем отжима. Для этого готовили блок из семи слоев фильтровальной бумаги, обильно смоченных 0.05 М Tris-HCl рН 8.6 + 0.15 М NaCl, пластинчатого агарозного геля, НЦЛ, одного слоя фильтровальной бумаги, смоченных тем же буферным раствором, и двенадцати листов сухой фильтровальной бумаги. Блок сжимали с усилием (10 г/см2) между двумя стеклянными пластинами. НЦЛ извлекали через 8-10 мин.
Белки из ДСН-ПААГ переносили на нитроцеллюлозные листы путем электрофореза с использованием аппарата Транссорб А (БиоС, СССР) с плоскими электродами из пористого титана в жидкой системе (20 мМ Tris-HCl, 192 мМ глицин и 20% объем/объем метанол рН 8.6) при ограничениях по плотности тока и напряжению (1 мА на см поверхности геля, 30 В). НЦЛ извлекали через 2 часа электрофореза при 10С.
Для проведения выявления белков-антигенов использовали твердофазный (твердая фаза - нитроцеллюлоза) иммуноферментный метод. После переноса белков на нитроцеллюлозу по любой из описанных выше процедур ее листы вымачивали в ФБР-Т (ФБР + 0.05% Tween-20) при 20С в течение 1 часа и инкубировали в растворе МА (гибридомная культуральная жидкость, или асцитическая жидкость, или очищенные моноклональные иммуноглобулины) в течение 1 часа с встряхиванием при 20С или при 4С в течение ночи. Затем твердую фазу трехкратно отмывали в течение 5 мин в 100 см3 ФБР-Т, каждый раз с встряхиванием, и переносили в подходящим образом разведенный раствор конъюгата кроличьего IgG против иммуноглобулинов мыши с пероксидазой. Выявление пероксидазы проводили с использованием субстратов, дающие окрашенные нерастворимые продукты реакции. Фракцию иммуноглобулинов из асцитической жидкости иммунизированных мышей получали трехкратной преципитацией раствором сульфата аммония (рН 7,5) при 50%-ном насыщении. Центрифугирование осуществляли при 10 000 g в течение 30 мин. Фракцию IgG моноклональных антител хранили в виде преципитата в 50%-ном растворе сульфата аммония при 4С.
Конъюгирование IgG моноклинальных антител с пероксидазой хрена проводили модифицированным методом периодатного окисления по Tjissen Р. (128). Для этого 10 мг пероксидазы хрена Rz 2,7-3,0 растворяли в 1 см3 бидистиллированной воды в небольшом флаконе темного стекла. К растворённой пероксидазе добавляли 1 см3 0,012 М раствора NaI04, герметично укупоривали и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 2 часов. К активированной пероксидазе добавляли 20 мг IgG моноклональных антител в 3 см3 0,1 М карбонатно-бикарбонатного буфера рН 9,3-9,5, перемешивали и вносили в вертикально установленный шприц емкостью 10 см3 с закрытой канюлей. Быстро добавляли сухой сефадекс G-25 (1/6 весовую часть) до полного исчезновения мениска жидкости над гелем и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 3 часов. Гельфильтрацию проводили 0,2 М карбонатно-бикарбонатным буферным раствором рН 9,3-9,5 до полного обесцвечивания выходящей из канюли жидкости. К полученному раствору коньюгата добавляли, перемешивая, 1/20 объема свежеприготовленного раствор NaBH и инкубировали при 4С. Через 30 минут добавляли еще 1/10 объема свежеприготовленного NaBHt и оставляли на ночь при 4 С.
Конъюгаты поликлоналъных антител к вирусу КЧС, антисвиные IgG и протеина-А с пероксидазой хрена готовили периодатным методом. Для этого пероксидазу хрена активизировали свежеприготовленным раствором периодата натрия смешивали с приготовленными IgG. Конъюгацию осуществляли в течение 2 часов при комнатной температуре, реакцию останавливали боргидридом натрия, освобождались от несвязавшейся пероксидазы гель-фильтрацией на сефадексе G-200 или сефакриле S-200. Для работы отбирали фракции с отношением пероксидаза/белок равным 0,3-0,6. Полученные препараты лиофилизировали как описано выше.
Культивирование рекомбинантного вируса осповакцины (Рек-КЧС) и оценка экспрессии полипептидов вируса КЧС
Рекомбинанатный вирус осповакцины (Рек-КЧС) культивировали в монослое перевиваемой культуры клеток CV-I, во флаконах РУ или в пробирках со стеклянными пластинками при множественности заражения 0,01-0,001 ТЦД5о/клетка в течение 24-48-72 часов (до обнаружения признаков ЦПД). Экспрессируемые рекомбинантным вирусом полипептиды вируса КЧС в инфицированнных клетках CV-I идентифицировали реакцией непрямой иммунофлуоресценции с использованием смеси моноклональных антител к El (gp33), Е0 (gp44/48) и Е2 (gp55). Для этого, культуру клеток CV-I, выращенную на стеклянных пластинках в пробирках инокулировали рекомбинантным вирусом осповакцины, инкубировали при 37С и исследовали в динамике инфекционного процесса. Была установлена четкая корреляция обнаружения вирусспецифических белков вируса КЧС в виде специфической флуоресценции цитоплазмы инфицированных клеток в зависимости от срока культивирования. Наиболее интенсивную флуоресценцию цитоплазмы инфицированных клеток наблюдали через 48-72 часа культивирования при множественности заражения 0,01-0,001 ТЦД5о/клетка (рис 2). При проверке непрямым ТФ ИФА с использованием смеси моноклональных антител активность экспрессированных белков в культуральной жидкости составила 1:1280 (табл. 3). Для подтверждения антигенной активности и специфичности экспрессируемых рекомбинантных белков 4-м кроликам внутрикожно вводили по 0,2 мл осветлённого концентрата ПЭГ-6000 культуральной вируссодержащей жидкости инфицированных клеток CV-1 и детрита инфицированных клеток CV-1, разрушенных ультразвуком. На 30 сутки после 2-го введения материалов (интервал 15 суток) в сыворотках крови кроликов обнаружены вируснейтрализующие антитела к вирусу КЧС (шт. "Ши-Мынь") в титре 1:16-1:32. вирус осповакцины, выращенный в культуре клеток CV-1 экспрессирует протективные полипептиды вируса КЧС.
Активность полученных препаратов антигенов вируса КЧС, в том числе и рекомбинантного белка определяли непрямым методом ТФ ИФА с использованием смеси моноклональных антител к белкам El (gp33), ЕО (gp44/48), и Е2 (gp55). Результаты сравнительного определения инфекционной и антигенной активности препаратов вируса КЧС представлены в таблице 4. Препараты антигенов вируса КЧС,(штаммов «Ши-Мынь-51», Alfort-187», «ЛК-К») и рекомбинантного вируса Рек-КЧС использовали для иммунизации мышей и отработки непрямого метода ТФ ИФА, скрининга гибридом, продуцирующих вирусспецифические МА. Для получения гибридом, стабильно секретирующих МА к антигенам вируса КЧС исследования выполняли по следующим этапам: - гипериммунизация мышей линии BALB/c препаратами полученных антигенов очищенного вируса КЧС, экстрактами лизатов клеток РК-15, инфицированных вирусом КЧС (штаммы «Ши-Мынь», «Alfort-187») и рекомбинантным вирусом осповакцины, экспресирующим белки вируса КЧС (Рек-КЧС); - отбор мышей, содержащих в сыворотке крови антитела к антигенам вируса КЧС в наиболее высоком титре; - гибридизация спленоцитов гипериммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы; - скрининг гибридом, секретирующих специфические МА к вирусу КЧС непрямым методом ТФ ИФА, реакцией непрямой иммунофлуоресценции и непрямым методом ГХ ИФА; - клонирование гибридом в полужидком агаре; - получение препаративных количеств МА в виде асцитических жидкостей путём внутрибрюшинного введения полученных гибридом мышам сингенной линии BALB/c, с последующим отбором иммуноасцитических жидкостей; - определение титра моноклональных антител в серологических реакциях.
