Содержание к диссертации
Введение
1 Введение 5
1.1 Актуальность темы исследования 5
1.2 Степень разработанности проблемы 6
1.3 Цели и задачи исследования 7
1.4 Научная новизна результатов исследований 8
1.5 Теоретическая и практическая значимость работы 8
1.6 Методология и методы исследования 9
1.7 Положения, выносимые на защиту 10
1.8 Личный вклад соискателя 10
1.9 Степень достоверности и апробация результатов работы
1.10 Публикации 10
1.11 Объем и структура диссертации 11
2 Обзор литературы 12
2.1 Африканская чума свиней, эпизоотологическая ситуация 12
2.2 Разнообразие изолятов и штаммов вируса АЧС 15
2.3 Современная классификация изолятов и штаммов вируса АЧС 17
2.4 Структура вириона 21
2.5 Характеристика основных, структурных и диагностически значимых белков вируса АЧС 25
2.6 Характеристики изолятов и штаммов вируса АЧС 30
2.7 Основные направления разработки специфических средств профилактики АЧС 33
2.8 Клонотеки генов в изучении возбудителя АЧС 38
2.9 Заключение по обзору литературы 43
3 Собственные исследования 45
3.1 Материалы 45
3.2 Методы 49
4 Результаты собственных исследований з
4.1 Создание клонотеки генов вируса АЧС 55
4.1.1 Определение расположения и направления считывания ОРС генов B646L, CP204L, KP177R, 061R, EP402R, CP530R, CP2475L и E183L в полноразмерном геноме вируса АЧС штамма Грузия 2007/1 55
4.1.2 Подбор праймеров и оптимизация параметров ПЦР 56
4.1.3 Клонирование генов вируса АЧС 59
4.1.4 Клонотека генов вируса АЧС изолята Krasnodar06/12 60
4.2 Использование клонотеки генов для создания продуцентов 66
4.2.1 Клонирование копии гена K177R в экспрессирующей плазмиде рЕТ32Ь(+) 66
4.2.2 Анализ экспрессии р22 в клетках Е.coli 67
4.2.3 Анализ нуклеотидных последовательностей генов вируса АЧС 71
4.3 Изучение культурально-биологических свойств изолята Krasnodar 06/12 и
адаптация его к репродукции в перевиваемых культурах клеток 81
4.3.1 Выделение вируса АЧС из патологического материала и первичный анализ свойств изолята Krasnodar 06/12 81
4.3.2 Изучение биологических свойств изолята Krasnodar 06/12 4.3.3 Патологоанатомические изменения у свиней, зараженных изолятом Krasnodar 06/12 вируса АЧС 86
4.3.4 Сравнительный анализ молекулярно-биологических свойств изолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ в 2007-2013 гг 86
4.3.5 Адаптация изолята Krasnodar 06/12 к репродукции в перевиваемых культурах клеток 90
4.3.6 Изучение биологических свойств вируса АЧС, изолята Krasnodar 2/13, адаптированного к росту в перевиваемой культуре клеток РК-15 92
4.4 Получение аттенуированного варианта вируса АЧС 93
4.4.1 Аттенуация изолята Krasnodar 2/13, адаптированного к росту в перевиваемой культуре клеток РК-15 93
4.4.2 Изучение возможности использования адаптированного штамма для приготовления культурального антигена для постановки ТФ ИФА 97
4.4.3 Использование культурального антигена вируса АЧС для постановки РНИФ 101
4.5 Обсуждение результатов 103
5. Заключение 112
5.1 Выводы 112
5.2 Практические предложения 113
5.3 Перспективы дальнейшей разработки темы 1 6
Список сокращений 115
Список литературы 118
- Теоретическая и практическая значимость работы
- Современная классификация изолятов и штаммов вируса АЧС
- Определение расположения и направления считывания ОРС генов B646L, CP204L, KP177R, 061R, EP402R, CP530R, CP2475L и E183L в полноразмерном геноме вируса АЧС штамма Грузия 2007/1
- Выделение вируса АЧС из патологического материала и первичный анализ свойств изолята Krasnodar 06/12
Теоретическая и практическая значимость работы
Анализ структуры генов вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12, подобранных для создания клонотеки генов, позволил установить 100%-ю гомологию нуклеотидных последовательностей полноразмерных генов 061R, KP177R, CP204L, E183L и B646L, а также фрагментов генов CP530R, CP2475L и 98,2%-ю гомологию нуклеотидных последовательностей гена EP402R изолятов Krasnodar 06/12 и Грузия 2007/1.
Плазмидные конструкции, входящие в состав клонотеки генов вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12, были использованы для определения структуры отдельных генов и являются основой для создания альтернативных источников генетического материала, положительного контроля в ПЦР-диагностике, а также получения рекомбинантных вирусов и ДНК-вакцин.
Получен клон pET32b(+)/ASFVp22 в клетках Е. coli штамма BL21(DE3) pLysS, который является альтернативным продуцентом антигена вируса АЧС.
Полученный аттенуированный вариант вируса АЧС штамм Krasnodar 2/13, адаптированный к репродукции в перививаемых культурах клеток, используется в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для получения специфического антигена и постановки непрямой реакции ТФ ИФА и РНИФ с целью выявления антител к вирусу АЧС.
Разработаны «Методические указания по выявлению вируса африканской чумы свиней в пробах крови и патологических материалов, отобранных от павших или вынужденно убитых свиней, в реакции прямой иммунофлюоресценции (РПИФ)» и «Методические указания по изоляции вируса африканской чумы свиней в культуре клеток альвеолярных макрофагов свиней», «Методические рекомендации по выделению и титрованию вируса африканской чумы свиней в культуре клеток лейкоцитов свиней» «Методические рекомендации по выделению и титрованию вируса африканской чумы свиней в культуре клеток костного мозга свиней», утвержденные в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 18 ноября 2013 г., 20 декабря 2013 г. 24 июня 2014 г. и 24 июня 2014 г. соответственно (приложения А, Б, В, Г). 1.6 Методология и методы исследования
Методология проведенных исследований включает стандартные процедуры с использованием различных материалов и естественно восприимчивых животных. В работе использовали молекулярно биологические (ПЦР, секвенирование, анализ нуклеотидных последовательностей, создание рекомбинантных конструкций), вирусологические (вирусовыделение, культивирование вируса, постановка биопроб) и серологические (ТФ ИФА, РПИФ, РНИФ) методы исследований. 1.7 Положения, выносимые на защиту
Личный вклад соискателя Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ГНУ ВНИИВВиМ н.с. А.С. Казаковой, вед.н.с. О.В. Капустиной и ФГБУ «ВНИИЗЖ»: к.в.н. А.С. Першину, к.б.н. Н.Г. Зинякову, вед. биологу И.В. Шевченко за помощь в проведении отдельных этапов работы; д.б.н. Н.С. Мудрак, д.б.н., проф. С.С. Рыбакову, д.б.н., проф. К.Н. Груздеву за консультативную помощь; д.б.н., проф. [Дрыгину В.В. за содействие в выполнении работы. Автор выражает признательность зав. реф. лаб. по АЧС, к.в.н. А.С. Иголкину.
Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (2010-2012 гг.) и на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» (2013-1014 гг.), на международной научно-практической конференции (УГСХА, Ульяновск, 2011 г.), на научно-практической конферецнии (Новый Свет, Украина, 2012 г.), на конференции молодых ученых (ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир, 2012 г.), на 7-м международном конгрессе по вакцинам (г. Ситжес, Испания, 2013 г.), на семинаре Северных и Балтийских стран (г. Гданьск, Польша, 2013 г.), на региональной молодёжной научной конференции (Владимирский филиал ФГОБУ ВПО Финансового университета при Правительстве РФ, г. Владимир, 2014 г.).
Достоверность результатов исследований подтверждена комиссионными испытаниями. По материалам диссертационной работы опубликовано девять научных работ, в том числе три статьи в зарубежных журналах и три статьи в изданиях по Перечню ВАК Министерства образования и науки РФ для докторских и кандидатских диссертаций.
Диссертация изложена на 140 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, приложения; иллюстрирована 12 таблицами и 20 рисунками. Список использованной литературы включает 134 источника, из них 96 иностранных. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную новизну и практическую значимость.
Современная классификация изолятов и штаммов вируса АЧС
Попытки создания средств специфической защиты против данного заболевания предпринимались с момента его открытия.
Исследование возможности использования инактивированных вакцин показало нецелесообразность их применения, так как это не избавляло от проблем типового плюралитета, вирусоносительства и технологических сложностей изготовления вакцины для обеспечения в ее составе достаточного количества антигенных детерминант, ответственных за формирование иммунитета при АЧС [29].
Одним из основных направлений в разработке специфических средств профилактики является получение аттенуированных штаммов возбудителя, адаптированных к репродукции в перевиваемых культурах клеток, для создания живых вакцин.
Недостатками созданных живых вакцин являлись не эффективность при заражении гетерологичным вирусом, носительство вакцинного вируса до двух месяцев, приживление вирулентного вируса без клинических проявлений болезни, а также развитие поствакцинальных осложнений у отдельных животных.
Испанскими исследователями в 1962-1963 годах получены аттенуированные штаммы вируса АЧС «1455» и «АЛ», иммунизация которыми в лабораторных условиях защищала свиней от заболевания при контрольном заражении полевым, высоковирулентным изолятом. Широкое применении в практике полученных аттенуированных вариантов возбудителя в качестве живой вакцины, в условиях высокой плотности чувствительных животных на эндемичной по данному заболеванию территории, привело к реверсии вирулентных свойств возбудителя. Появление новых вариантов вируса АЧС обусловлено его высокой мутабельностью и рекомбинационной активностью, что при коинфекцировании привело к повышению процента поствакцинальных осложнений с отдаленной гибелью от 10 до 50% [29].
Для разработки безопасных и эффективных живых и инактивированных вакцин отечественными учеными в ВНИИВВиМ получены аттенуированные штаммы и гипериммунные специфические сыворотки, благодаря которым были обстоятельно изучены и иммунологически дифференциированы исследуемые изоляты и штаммы, а также установлена сероиммунотиповая зависимость иммунитета к вирусу АЧС [27].
Такой основательный подход позволил получить экспериментальные вакцинные препараты на основе аттенуированных штаммов, защищающие до 100% свиней от контрольного заражения вирулентным вирусом соответствующего серотипа [29].
Отсутствие вакцинных препаратов против АЧС ставит первостепенной задачей изучение структуры и уникальных свойств ее возбудителя, на пути к решению которой широкое применение приобрели аттенуированные варианты вирулентного вируса.
Дальнейшие исследования по созданию аттенуированных вакцин К. King с соавторами в 2011 году установили, что иммунизация авирулентным штаммом OURT88/3 первого генотипа защищает европейских свиней при контрольном заражении вирулентными штаммом Benin 97/1 того же генотипа и изолятом Uganda 1965 десятого генотипа на 85,7% и 100%, соответственно, причем в течение опыта клинические признаки заболевания и виремия выявлены не были [111]. С.С. Abrams с соавторами в своей работе по разработке альтернативной вакцины используют аттенуированные штаммы вируса АЧС для создания делеционных по различным генам мутантов вируса, иммунизация которыми не вызовет проявление клинических признаков болезни, но обеспечит эффективную защиту. Поскольку ранее установлено, что аттенуированный штамм OURT88/3 защищает от заражения свиней вирулентным штаммом OURT88/1, в 2013 году группой ученых был получен делеционный мутант данного штамма вируса АЧС по генам DP71L и DP96R, обуславливающих устойчивость свиней к заболеванию. В результате проведенных исследований установлено, что делеция данных генов не влияет на репродукцию вируса в культуре клеток макрофагов свиньи, но при контрольном заражении гомологичным вирулентным штаммом вируса АЧС иммунизированных делеционным мутантом свиней установлено снижение устойчивости к вирусу свиней до 66%, по сравнению с исходным аттенуированным вариантом, защищающим 100% свиней [74].
Несмотря на то, что работами отечественных и зарубежных исследователей была доказана возможность создания 100% защиты против гомологичного изолята, оставался открытым вопрос о создании специфической защиты от заражения гетерогенными изолятами вируса АЧС.
Разработки по конструированию поливалентной вакцины против гетерогенных по иммунотиповой принадлежности возбудителя изолятов, проведенное сотрудниками ВНИИВВиМ, подтвердили эффективность комплексной иммунизации несколькими авирулентными клонами, против гетерогенного изолята Киравира, имеющего в своем составе варианты 3, 5 и 6 серотипов. В проведенных ими экспериментах достигнута 100% защита животных от контрольного заражения гетерогенным вирулентным изолятом [24].
Таким образом, была доказана возможность создания защиты и против заражения гетерогенным по сероиммунотиповому составу изолятом вируса АЧС. В работах, направленных на поиск белков, ответственных за иммуногенность вируса АЧС, не было получено однозначных результатов. М. Barderas с соавторами (2001 г.) установили, что защита против АЧС может быть получена с помощью химерного протеина р54/30. Для этого пятикратно иммунизировали свиней химерным белком р54/30 в дозе 100 мкг/гол. После пятой инъекции титры антител составляли 1:200. После контрольного заражения свиней штаммом Е75 внутримышечно в дозе 500 ЛДюо невакцинированные животные пали на шестые сутки с характерными при АЧС клиническими признаками, а у свиней, иммунизированных химерным белком р54/30, титры вируса в крови были в 50-100 раз ниже, чем в контрольной группе. Животные оставались клинически здоровыми в течение 55 суток, после чего были убиты, а отобранные от них пробы их крови, селезенки, лимфатических узлов и почек исследовали с помощью ПЦР. Во всех образцах ДНК вируса АЧС не обнаружили [59].
Определение расположения и направления считывания ОРС генов B646L, CP204L, KP177R, 061R, EP402R, CP530R, CP2475L и E183L в полноразмерном геноме вируса АЧС штамма Грузия 2007/1
Кроме того, филогенетический анализ по гену 061R показал, что российские изоляты, а также изоляты Georgia 2007/1 и Armenia 2007, относятся к одной и той же группе (субкластеру), но все российские изоляты имеют между собой отличия от семи до 15 нуклеотидов, причем данные отличия позволяют распределить изоляты на субкластеры, соответствующие их ближайшему родству (Метод «ближайших соседей») (Рисунок 13).
Изоляты Stavropol 2008, Orenburg 2009 и Armenia 2007 составляют одну группу, Georgia 2007/1, Elbrus 01/08 и Krasnodar 06/12 входят во вторую группу. Перечисленные изоляты относятся к одному субкластеру, в отличие от изолята Volgograd 2010, который расположился отдельно. Возможно, его отличие от остальных исследуемых изолятов связано с тем, что выделенный от дикого кабана вирус изолята Volgograd 2010 циркулировал в популяции кабанов и прошел на них неограниченное количество пассажей, минуя репродукцию в домашних свиньях.
Анализ профиля гидрофильности/гидрофобности vpl2 вируса АЧС на основе рассчитанной аминокислотной последовательности проводили с использованием алгоритма Норр & Woods, в программе BioEdit 6.0.7. (Рисунок 14). Норр & Woods 3 :ale Mean Hvdrophilicity Profile Scan-window size = 1 3 Примечания: Стрелкой указан сайт гликозилирования белка, пунктирной стрелкой указана область, ответственная за димеризацию, а двойной стрелкой обозначен участок с функцией заякоревания.
Рисунок 14 - Профиль гидрофильности vpl2 по алгоритму Норр и Woods Результаты проведенного анализа не установили изменений, поскольку выявленные точечные мутации не затронули ни сайты гликозилирования белка, ни сайты димеризации.
Таким образом, из восьми выбранных генов, именно анализ гена 061R с интергенным регионом позволяет выявить возможные пути заноса и распространения вируса АЧС на территории РФ. 4.3 Изучение культурально-биологических свойств изолята Krasnodar 06/12 и адаптация его к репродукции в перевиваемых культурах клеток
Поскольку анализ структуры генов изолята Krasnodar 06/12 вируса АЧС выявил изменение в последовательности гена EP402R, которое могло привести к снижению вирулентных свойств возбудителя, необходимо было изучить культурально-биологические свойства данного изолята.
Выделение вируса АЧС из патологического материала и первичный анализ свойств изолята Krasnodar 06/12
В качестве источника вируса использовали пробы селезенки свиньи, павшей от АЧС, отобранные при вспышке в ФГУП «Кубанское» Краснодарского края в 2012 году.
Для выделения вируса приготовили 10%-ную суспензию селезенки, осветлили ее центрифугированием в течение 10 минут при 3000 об/мин. Затем добавляли 4%-ный раствор гентамицина сульфата и инкубировали три часа при температуре 37С. Отобранным супернатантом инфицировали первичную культуру клеток путем нанесения 1 мл суспензии на клетки АМС в матрас объемом 50см (адсорбция).
Длительность первого пассажа составляла семь суток. Поскольку на седьмые сутки появления гемадсорбции не наблюдали, дополнительно провели второй пассаж, инокулируя клетки АМС вируссодержащей суспензией предыдущего пассажа в соотношении объемов 1:10.
На втором пассаже на 3-4 сутки наблюдали появление плотной гемадсорбции с эффективностью поражения монослоя 1-2 клетки с прикрепленными эритроцитами в поле зрения. На 8-9 сутки собрали урожай вируса, титр накопления составил 3,5-5,0 lg ГАдЕ 5о/см .
Для накопления вируссодержащего материала изолята провели третий пассаж: появление ЦПД наблюдали на 5-6 сутки, титр накопления к седьмым суткам составил 5,5 lg ГАдЕ 5о/см .
Результаты вирусвыделения также были подтверждены в реакции прямой иммунофлуоресценции (РПИФ) и ПЦР при исследовании проб инфицированной культуры клеток на наличие антигена и генома вируса АЧС, соответственно.
Таким образом, в результате проведения трех последовательных пассажей был накоплен вируссодержащий материал изолята Krasnodar 06/12.
Для изучения стабильности свойств выделенного изолята провели еще два последовательных пассажа в культуре АМС. Исследование культурально-биологических свойств выделенного изолята вируса АЧС проводили на культуре клеток АМС путем инокуляции вируса в культуральную жидкость в соотношении объемов 1:10 без стадии адсорбции на клетках.
Накопление вируса определяли титрованием в культуре клеток АМС. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в lg ГАЕ5о/см .
Основными маркерными признаками при вирусвыделении являлись параметры репродукции в культуре клеток АМС, наличие и характер гемадсорбции, скорость репродукции и уровень накопления вируса.
Выделение вируса АЧС из патологического материала и первичный анализ свойств изолята Krasnodar 06/12
Создание клонотеки генов позволили J.M. Argilaguet с соавторами в 2012 году сконструировать плазмиду, включающую в себя копии генов, кодирующих два иммунодоминантных структурных антигена - р54 и рЗО и внеклеточный домен CD2v вируса АЧС (sHA), введение которой экспоненциально усиливало и гуморальный и клеточный иммунные ответы у свиней после ДНК иммунизации [77].
Так как было показано, что одним из применений клонотек генов является их использование в качестве альтернативного источника генетического материала, была создана клонотека генов вируса АЧС, изолята Krasnodar 06/12, которая представляет собой набор генов (B646L, CP204L, KP177R, 061R, EP402R, CP530R, CP2475L и E183L), кодирующих структурные и иммунологически значимые белки вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12, клонированных в составе векторной молекулы pJET 1.2/blunt.
Полученная клонотека генов подходит для создания экспрессирующих рекомбинантных конструкций с целью накопления белков, кодируемых данными генами, поскольку подобранные для каждого гена праймеры, содержат в своей нуклеотидной последовательности сайты рестрикции для дальнейшего клонирования в экспрессирующие плазмиды.
Это позволило нам получить штамм клеток E.coli BL21(DE3) pLysS, несущих в себе рекомбинантную плазмиду, экспрессирующую р22 изолята Krasnodar 06/12 и проверить возможность его применения в качестве альтернативного источника антигена для выявления в опытных образцах антител к вирусу АЧС. Методом ТФ ИФА установлено, что полученный антиген специфически взаимодействует с антителами положительной референс-сыворотки и экспериментальными сыворотками крови свиней, инфицированных вирусом АЧС и, следовательно, полученный штамм клеток Е. coli штамма BL21(DE3) pLysS клон pET32b(+)/ASFVp22, может быть использован в качестве альтернативного продуцента антигена вируса АЧС.
В работах отечественных и зарубежных ученых показано, что филогенетический анализ позволяет распределить изоляты и штаммы вируса АЧС на группы, благодаря чему можно установить их родство, а, следовательно, и пути распространения. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена B646L позволил распределить изоляты и штаммы вируса АЧС на XXII геногруппы [84].
Для более тонкой оценки родства изолятов используют филогенетический анализ гена E183L, который позволяет проводить быструю предварительную оценку серотиповой принадлежности изолятов, так как распределяет изоляты и штаммы на группы, соответствующие их сероиммунотиповой принадлежности [15].
Но филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей и фрагмента гена B646L и гена E183L не позволяет разделить изоляты на подгруппы и установить их точное происхождение. Поэтому, в дополнение к филогенетическому анализу нуклеотидных последовательностей генов B646L и E183L требуется проводить сравнительный анализ межгенных регионов и тандемных повторов [63, 101].
В работах С. Gallardo с соавторами (2009 г.) в качестве генетических маркеров изменчивости подобраны гены (E183L, B602L, KP86R, I196L) и межгенные регионы (J286L, BtSj, I73R/I329R, I78R/I215L), филогенетический анализ которых рекомендован авторами для установления тонких родственных связей между изолятами и для распределения их в разные подгруппы [78].
Данный подход был использован Малоголовкиным А.С. с соавторами (2011 г.) для оценки изменчивости изолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ в период с 2007 по 2011 годы. В результате проведенного анализа не было выявлено различий между российскими изолятами, что позволило авторам сделать заключение об отсутствии изменений у возбудителя АЧС и единстве происхождения изолятов, выделенных на территории РФ [100].
Полученные нами результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей генов B646L и E183L коррелируют с результатами, полученными Малого ловкиным А. С. с соавторами, и позволили отнести изучаемые изоляты ко II генотипу, восьмой сероиммунотиповой группе.
Поскольку филогенетический анализ предложенных С. Gallardo генов и межгенных регионов не позволил выявить изменения в геномах изолятов, выделенных на территории РФ, для проведения более глубокого исследования были подобраны гены K177R, CP204L, EP402L, CP530R, 061R с прилегающим к нему интергенным регионом, и фрагмент гена CP2475L, изменения в которых (по данным литературы) могут привести к изменению биологических свойств возбудителя АЧС.
В проведенных исследованиях выявлены отличия в нуклеотидных последовательностях гена 061R и прилежащего к нему интергенного региона у различных изолятов и проведен сравнительный анализ изолята Krasnodar 06/12 и изолятов и штаммов, выделенных в разные годы и в разных географических зонах.
Установлено, что нуклеотидная последовательность гена 061R и интергенного региона, имеет две вариабельные области от 195 до 248 и от 296 до 320 нуклеотидов. Анализ полученных данных сиквенсов исследуемых нами изолятов и европейских и африканских изолятов (опубликованных в GenBank) показал, что в последовательности интергенного региона гена, кодирующего vpl2 изолятов Krasnodar 06/12, Volgograd 2010, Elbrus 2008, Stavropol 2008, Orenburg 2009 Georgia 2007/1 и Armenia 2007 была обнаружена встройка, состоящая из 28 нуклеотидов в области от 218 до 248 нуклеотидов, которая отсутствовала в геноме европейских изолятов (Lisbon 57, Espana 70 и OURT 88 3). Указанный ген африканских изолятов (Kiravira 69, Tengani 61 и Kenya 1950) содержит инсерции менее 28 нуклеотидов в том же регионе.
