Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 15
1.1. Историческая справка 15
1.2. Эпизоотическая ситуация по болезни Марека 17
1.3. Характеристика вируса болезни Марека 18
1.4. Классификация и биологические свойства ВБМ 22
1.5. Классификация вируса болезни Марека серотипа 1 в соответствии с принципами патотипирования 24
1.6. Патотипирование методом «Best Fit» ADOL 28
1.7. Вирусы БМ серотипа 2 30
1.8. Вирусы БМ серотипа 3 31
1.9. Эпизоотологические особенности 33
1.10. Клинические признаки 35
1.11. Патологоанатомические и гистологические изменения 37
1.12. Диагностика 39
1.12.1. Иммунодиагностика ВБМ 40
1.13. Иммунитет 44
1.14. Контроль и специфическая профилактика 47
1.15. Заключение по обзору литературы 50
2. Собственные исследования 52
2.1. Материалы и методы 52
2.1.1. Вирусы 52
2.1.2. Изоляты ВБМ 52
2.1.3. Культуры клеток 52
2.1.4. Испытуемые сыворотки для непрямого ИФА 53
2.1.5. Лабораторные животные 53
2. Ь6. Специфические компоненты .- 53
2.1.7. Диагностические наборы 53
2.2. Оборудование 53
2.3. Методы 54
2.3.1. Изоляция ВБМ из крови кур 54
2.3.2. Трипсинизация куриных эмбрионов 55
2.3.3. Серотипирование изолятов ВБМ 55
2.3.4. Выявление Аг ВЛП р27 в сыворотке крови кур иммуноферментным анализом 55
2.3.5. Выявление вируса ретикулоэндотелиоза (ВРЭ) в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) 56
2.3.6. Выявление ВИАЦ методом ПЦР в реальном времени 56
2.3.7. Выращивание и пассирование ВБМ 59
2.3.8. Замораживание клеток 59
2.3.9. Сбор единичных колоний ВБМ-1 60
2.3.10. Титрование вируса болезни Марека 60
2.3.11. Выявление Ат к ВБМ в сыворотке крови кур реакцией диффузионной преципитации 61
2.3.12. Получение вирусного Аг для проведения непрямого ИФА 61
2.3.13. Непрямой вариант ИФА 61
2.3.14. Электрофорез в ПААГ-ДСН 62
2.3.15. Иммуноблоттинг 63
2.3.16. Статистическая обработка результатов 64
3. Результаты 65
3.1. Определение вирулентности полевых изолятов ВБМ-1 65
3.1.1. Чувствительность СПФ-цыплят линии Щелково 65
3.1.2. Выявление контаминации изолятов ВБМ-1 чужеродными вирусами 69
3.1.3. Определение вирулентности изолятов вируса БМ первого серотипа... „ „ 71
3.1.4. Первичная оценка вирулентности полевых изолятов вируса БМ первого серотипа на СПФ-цыплятах линии Щелково 72
3.1.5. Определение патотипа полевых изолятов вируса БМ первого серотипа модифицированным методом «Best Fit» 74
3.1.6. Географическое распределение изолятов вируса БМ первого серотипа 80
3.2. Разработка непрямого варианта твердофазного ИФА для определения поствакцинальных антител в сыворотке крови кур к вирусу БМ первого серотипа 87
3.2.1. Получение антигена 87
3.2.2. Определение концентрации белка в полученном лизате... 88
3.2.3. Определение структурного состава и антигенной активности вирусного препарата 89
3.2.4. Разработка имму но ферментной тест-системы для выявления антител к вирусу БМ 91
3.2.5. Приготовление высокоположительного и положительного контролей 95
3.2.6. Определение параметров внутренних контролей качества 96
3.2.7. Оценка диагностических параметров разработанной иммуноферментной тест-системы
4. Обсуждение 104
Выводы 113
Библиографический список
- Классификация вируса болезни Марека серотипа 1 в соответствии с принципами патотипирования
- Патологоанатомические и гистологические изменения
- Испытуемые сыворотки для непрямого ИФА
- Определение патотипа полевых изолятов вируса БМ первого серотипа модифицированным методом «Best Fit»
Введение к работе
Актуальность темы Болезнь Марека (БМ) является наиболее распространенным лимфопролиферативным заболеванием кур, которое характеризуется развитием злокачественных лимфом в висцеральных органах (острая форма) и поражением нервов (классическая форма). Заболеванию подвержены куры всех возрастов. Однако наиболее чувствительными являются суточные цыплята мясных и яичных пород. Смертность поголовья при острой форме болезни может достигать 60-80% [5, 75].
Возбудителем БМ является ДНК-содержащий вирус (ВБМ), относящийся к роду Mardivirus семейства Нефе8У1пс1ае. Согласно биологическим свойствам ВБМ разделены на три вирусные группы. К первому серотипу относятся патогенные (онкогенные) штаммы ВБМ и их аттенуированные формы, ко 2-му серотипу относится' неонкогенный вирус герпеса кур, к 3-му серотипу условно относят природноапатогенный герпес вирус индеек (ГВИ), антигенно-родственный вирусу БМ. Болезнь широко распространена во всех странах мира с развитым птицеводством и причиняет большой экономический ущерб. Потери от БМ в птицеводческой промышленности всего мира ежегодно оцениваются в 1-2 млрд. долларов (С. MOITOW и F. Fehler, 2004).
Массовую специфическую профилактику болезни Марека в СССР начали проводить в 1974 г. с использованием вакцин отечественного производства из штамма FC-126 (ГВИ). Это дало положительные результаты и в течение 25 лет эпизоотическая ситуация по БМ находилась под контролем. Однако, в начале 90-х гг. среди привитого поголовья птиц снова начали отмечать учащение случаев возникновения данного заболевания.
Аналогичную динамику наблюдали и в других странах мира с развитой птицеводческой промышленностью. Ситуацию, выходящую из-под контроля, исследователи, объясняли появлением-в природе-новых-более вирулентных форм вируса БМ, в связи с его изменчивостью и, как следствие, недостаточной протективной способности вакцин на основе ГВИ. Для совершенствования контроля БМ в ветеринарной практике России стали применять би- и поливалентные вакцины на основе первого, второго и третьего серотипов ВБМ. В целом это позволило стабилизировать обстановку по БМ в стране. Однако ситуация, связанная с изменчивостью ВБМ в сторону повышения вирулентности, оставалась актуальной как в России, так и во всем мире, где было развито промышленное птицеводство (В.И. Смоленский, 2000, неопубликованные данные).
В работах R. L. Witter [171] указывается, что за последние 30 лет отмечено повышение патогенности вируса БМ: от умеренновирулентных (ш ВБМ) до сверхвирулентных (vv+ ВБМ) штаммов. При этом антигенное различие между этими штаммами не обнаруживали, все они относились к первому серотипу.
Лабораторией Онкологических Болезней Птиц (ADOL, США) был разработан стандартный метод оценки степени вирулентности полевых изолятов, который обозначили как «золотой стандарт» [173]. Однако, им трудно руководствоваться в других лабораториях, поскольку авторы, для оценки вирулентности полевых изолятов ВБМ-1 в экспериментальных условиях используют чувствительных к ВБМ линию СПФ-кур «15x7 аЬ+», доступную в основном только в США. Для устранения этого препятствия Witter предложил провести сравнение патологоанатомических изменений, вызываемых референтными и полевыми штаммами вируса БМ, с использованием других чувствительных к ВБМ СПФ-линий кур. Этот метод был апробирован с положительными результатами на двух американских СПФ-линиях кур и получил название «Best Fit» [173]. Однако сообш:ений о подтверждении достоверности данного метода в независимых лабораториях не поступало.
В нашей стране подобных исследований не производили. Из-за экономическош_кризиса,_которь1Й длился^ в. России -более-10 лет, научные исследования БМ, включая изучение полевых изолятов, также как и усовершенствование мер борьбы с заболеванием практически не проводились. Из-за отсутствия диагностических центров, вопрос о циркуляции в птицеводческих хозяйствах штаммов ВБМ-1 с различной степенью вирулентности (от авирулентных до сверхвирулентных) не изучали. Хотя стоит отметить, что в более ранних исследованиях по БМ отечественными авторами было опубликовано несколько сообщений по выделению различных изолятов ВБМ при вспышках болезни в хозяйствах (Коровин, 1971, 1979, Лавров, 1975, Мазуренко, 1974, Яковлева, 1973, 1975), однако, отсутствие стандартных методик не позволило в полной мере охарактеризовать вирулентность полученных изолятов.
С конца 90-х гг. прошлого века и вплоть до настоящего времени роль БМ в инфекционной патологии птиц стала возрастать. В этот период снова начала прослеживаться опасная тенденция по учащению случаев БМ и увеличению неблагополучных районов. Можно сказать, что возникла ситуация, когда БМ наблюдали почти в каждом птицехозяйстве страны.
Среднегодовой падеж птицы от БМ мог достигать 18% от всех инфекционных болезней (В.И. Смоленский, 2000, неопубликованные
данные). В очередной раз одной из основных причин ухудшения эпизоотической ситуации могла явиться циркуляция вновь появившихся в природе высоко- и сверхвирулентных форм ВБМ-1.
Все это обусловило необходимость разработки и использования метода патотипирования ВБМ-1, не только для оценки эпизоотической ситуации, но и изучения распространения и эволюционной изменчивости вируса.
Используя модификацию метода «Best Fit», мы пытались выявить новые высокопатогенные штаммы ВБМ-1 на территории РФ с целью усовершенствования стратегии вакцинации и применения соответствующих мер контроля.
Другой потенциальной причиной вспышек БМ среди вакцинированного поголовья кур (кроме циркуляции в хозяйствах высоко- и сверхвирулентных форм ВБМ-1) может быть не всегда удовлетворительное проведение мероприятий по специфической профилактике против БМ. В связи с этим необходим систематический контроль гуморального ответа птицы на введение вакцинного штамма ВБМ. В настоящее время для серологической диагностики БМ применяют РДП, реже РН и ИФ. Об использовании ИФА, обладающего гораздо более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с вышеуказанными методами, в литературных данных имеются весьма ограниченные сведения. Это может быть связано с рядом причин, таких как: перекрестная реактивность, высокий неспецифический фон реакции [46], а также неудовлетворительная чувствительность тест-системы [177].
Очевидно, что вышеуказанные проблемы были связаны с источником получения антигена ВБМ, полученного на клетках куриного происхождения (ФЭК, ПЦ). Для устранения этого недостатка необходимо было использовать культуру клеток другой природы, чувствительную к ВБМ. Такой культурой оказалась рекомбинантная линия клеток SOgE, полученная из фибросаркомы перепела [108, 141]. Наличие подобной клеточной системы позволяло получить вирусный антиген БМ, пригодный для разработки тест-системы на основе непрямого варианта ИФА с целью обнаружения антител к ВБМ. Данная тест-система могла служить ценным инструментом при проведении ретроспективной диагностики и оценки эффективности специфической профилактики против БМ. Цель работы и задачи исследования Целью исследований явилось изучение биологических свойств российских природных изолятов вируса болезни Марека первого серотипа (ВБМ-1) и разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к ВБМ-1 для оценки эффективности вакцин.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1) Адаптация и оценка модифицированного «Best Fit» метода с использованием СПФ-цыплят породы белый леггорн линии Щелково;
2) Выделение и изучение изолятов вируса болезни Марека, циркулирз^ощих на территории РФ, состоящее из следующих этапов: • очистка изолятов ВБМ 1-го серотипа от контаминации другими вирусами; • проведение первичной оценки степени вирулентности исследуемых изолятов на невакцинированных цыплятах; • определение патотипа исследуемых изолятов на вакцинированных цыплятах; • сравнение вирулентности современных российских, полевых изолятов ВБМ-1 с европейскими и американскими изолятами; • получение матричных расплодок отечественных изолятов ВБМ-1.
3) Разработка метода ИФА для выявления Ат к ВБМ-1: • получение и иммунохимимическая характеристика вирусного антигена пригодного для нИФА с последующей иммобилизацией его на микропанели; • определение оптимальных концентраций компонентов и условий проведения реакции; • выявление величины пороговых показателей специфической и неспецифической реакции; • сравнительный анализ нИФА и РДП, определение корреляции и относительной чувствительности этих тестов.
Научная новизна Представлены и впервые систематизированы данные о патогенности изолятов ВБМ-1, циркулирующих на территории РФ, их распространении, особенности клинических проявлений.БМ в.полевых условиях.^ - Показано, что использование модификации метода патотипирования является необходимым для стандартизации оценки вирулентности ВБМ первого серотипа и изучения состояния проблемы в разных странах.
Сравнительное изучение патотипов ВБМ-1, циркулирующих на территории РФ и американских референтных штаммов подтвердило предположение об изменчивости штаммов ВБМ-1 в сторону увеличения вирулентности.
Полученные данные служат обоснованием для усовершенствования контроля заболевания в условиях повышения вирулентности возбудителя и разработки новых подходов в идентификации и дифференциации ВБМ. Разработана тест-система на основе непрямого варианта ИФА для определения поствакцинальных антител к вирусу БМ первого серотипа с использованием антигена, из рекомбинантной перепелиной перевиваемой клеточной линии SOgE. Чувствительность разработанной тест-системы позволяет выявлять Ат у птицы на ранних сроках после вакцинации.
Изучена диагностическая ценность нИФА в сравнении с РДП и проведена оценка относительной чувствительности данных тестов.
Практическая значимость работы Получена коллекция российских изолятов ВБМ-1, которая может служить основой банка референтньис штаммов ВБМ первого серотипа, что является важным этапом для дальнейшего изучения болезни, дифференциации изолятов ВБМ-1 и разработки эффективных средств специфической профилактики, способствуюш;их повышению сохранности птицепоголовья в России и других странах.
Отработаны и усовершенствованы методы выделения и патотипирования отечественных природных изолятов ВБМ-1, что позволяет проводить мониторинг эпизоотической ситуации по БМ и является предпосылкой создания первого в России референтного центра по БМ. Изолированные и охарактеризованные вирулентные штаммы ВБМ-1, представляющие три патотипа, а именно, 14 Н (vv+), 19J/6 (w) и 22В/9 (v) депонированы в государственную коллекцию вирусов Российской Федерации (НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН).
Основные положения, выносимые на защиту
1) Чувствительность СПФ-птицы линии Щелково породы Белый леггорн к вирусу болезни Марека является достаточной для проведения экспериментов по оценке вирулентности полевых изолятов ВБМ-1.
2) Модифицированный метод «Best Fit» позволяет достоверно определять степень вирулентности российских полевых изолятов вируса БМ
1-го серотипа.
3) Подтверждена изменчивость полевого ВБМ-1 в сторону увеличения вирулентности. Степень вирулентности 19-ти отечественных изолятов ВБМ1 была схожа с американскими аналогами и являлась достаточной, чтобы вызывать БМ у вакцинированного поголовья.
4) Разработанная тест-система непрямого ИФА на основе специфического Аг ВБМ-1, полз^енного с использованием рекомбинантной перепелиной линии клеток SOgE, является высокочувствительной и высокоспецифичной для оценки уровня поствакцинальных Ат.
Классификация вируса болезни Марека серотипа 1 в соответствии с принципами патотипирования
Как известно вирулентность или онкогенность присуща только с ВБМ первого серотипа. Однако, в пределах этой группы вирулентность ВБМ-1 значительно различается от почти невирулентных до сверхвирулентных -[ПЗ]. Вирулентность ВБМ-1 измеряется по способности индуцировать лимфопролиферативные поражения у цыплят, обычно характеризуемые утолщением периферических нервов из-за лимфоидной инфильтрации и лимфомами в различных внутренних органах или тканях.
Вирулентность ВБМ важно знать по многим причинам, но особенно, потому что она непосредственно связана со способностью ВБМ-1 вызывать болезнь у вакцинированной птицы. К тому же за последние годы вирулентность штаммов ВБМ-1 увеличилась [171], эта тенденция продолжается до настоящего времени и представляет огромное препятствие долгосрочного контроля заболевания.
Патотипирование изолятов ВБМ-1 по их патогенности включает в себя использование тестов на патогенность у вакцинированных или невакцинированных кур [159]. До настоящего времени не разработано ни одного метода определения вирулентности in vitro.
Понятие патотипа вероятно датируется обнаружением более вирулентной формы вируса болезни Марека в конце 1950-х годов (Benton и Cover, 1957). Различия между штаммами ВБМ были, затем расширены с описанием «высоковирулентного патотипа» , (vv) в начале 1980-х и «сверхвирулентного патотипа» (vv+) в 1990-х гг. Однако, методы патотипирования, применяемые в различных лабораториях не были стандартизованы, препятствуя сравнению результатов и определению достоверности метода.
Первоначально метод был основан на критерии защиты ГВИ - изоляты, против которых ГВИ обеспечил 77 % защиты или меньше, рассматривались как высоковирулентные (vv) (Witter, 1983). Несмотря на вышеуказанный метод, разные лаборатории, исследуя ВБМ-1, присваивали патотип vv в произвольной форме относительно друг друга. Общей системы определения не было.
Witter предложил отнести к патотипу vv (высоковирулентные) те изоляты ВБМ-1, которые выз ьюали )тэтологранатрмические изменения.. у_ большего числа восприимчивых цыплят, вакцинированных ГВИ, по сравнению с референтными вирулентными штаммами JM или GA (Witter, 1988).
Данная идея нашла распространение. Imai и сотрудники (Imai и др., 1992; Imai и Yuasa, 1988) обозначали изоляты, как высоковирулентные (w) по многим критериям, включая сравнение с референтными высоковирулентными (vv) штаммами Md5 и RB1B. Buscaglia и др. в Аргентине типировали изоляты на цыплятах Р2а по сравнению с контрольными штаммами, подобно испытаниям, проводимым в Соединенных Штатах (Buscaglia и др., 1995) или, позже, прямым сравнением вирулентности со штаммами JM и RB1B (Buscaglia и др., 2004). Liu и сотрудники (Liu и др., 1996) патотипировали высоковирулентные (vv) изоляты ВБМ-1 по сравнению с контрольным штаммом GA. Штамм С12/130 был идентифицирован, как имеющий особые вирулентные свойства по сравнению с референтным штаммом HPRS-16 (Nair и др., 1996), хотя обозначение патотипа не применялось в этой работе. Sung классифицировал изолят KOMD-IC, как высоковирулентный (vv) патотип на основании сравнения со штаммом JM (Sung, 2002). Все упомянутые авторы проводили работу по изучению новых изолятов ВБМ-1 и, в некоторых случаях, давали патотипные обозначения. Однако методы работ этих авторов широко варьировали.
Другая волна значительного падежа от БМ среди привитого поголовья птиц была отмечена в начале 1990-х годов, особенно в Соединенных Штатах. Некоторые полевые изоляты ВБМ-1, изолированные от такого поголовья, были причиной более высокой повторяемости БМ у цыплят, привитых бивалентной вакциной, в сравнении с частотой выявления БМ при экспериментальном заражении референтным штаммом Md5 (vv). Witter допустил, что эти штаммы могли представлять измененный патотип и предложил обозначение «сверхвирулентный» (vv+) [171]. Штамм, отнесе шыйк_новому_патотипу, был_связан с увеличениемзаболеваемости в- полевых условиях и неспособностью вакцин обеспечивать достаточную защиту.
Изоляты ВБМ-1, различающиеся по степени вирулентности также могут различаться и по другим биологическим свойствам. В большинстве случаев более вирулентные изоляты по сравнению с менее вирулентными, продуцируют большее количество висцеральных опухолей и частоты ранней смертности. Высоковирулентные изоляты, вызывающие заболевание у цыплят генетически устойчивых линий, служат причиной сильной иммунодепрессии, часто связываемой с серьезными литическими изменениям в лимфоидных органах, приводят к смерти без образования опухолей в первые дни болезни (синдром ранней смертности), индуцируют больше переходящих параличей. Вследствие этого некоторые признаки были предложены как дополнительные критерии для патотипирования.
Как правило, высоковирулентные штаммы ВБМ-1 реплицируются быстрее и индуцируют более выраженную виремию, чем штаммы более низкой вирулентности (Rosenberger, 1995). Таким образом, уровень вирусной репликации и виремии также могут рассматриваться как возможные критерии для патотипирования.
Патологоанатомические и гистологические изменения
Для постановки достоверного диагноза БМ важен учет комплекса данных, базирующихся на эпизоотологической ситуации, клинических и патологоанатомических проявлениях, гистологических изменениях, а также результатах вирусологических исследований [77]. Предварительный диагноз ставят исходя из признаков поражения нервной системы: паралич одной или двух конечностей (верхних и/или нижних), скрючивание пальцев, искривление шеи, сероглазие и отсутствие рефлекса зрачка адаптации к свету, утрата рефлекса насеста. У молодых птиц при острой форме БМ наступает быстрое распространение тяжелой депрессии, истощение и гибель [75, 77].
Выделение вируса. Вирус болезни Марека можно выделить, начиная со второго дня после инокуляции [122], либо через 5 дней после контактного заражения и в дальнейшем в течение всей жизни кур т.к. персистенция вируса в крови наблюдается пожизненно. Вероятно, наиболее часто применяющимся методом первичного выделения ВБМ является инокуляция чувствительных тканевых культур лейкоцитами крови или клеточными суспензиями из лимфоидных тканей, инфицированных кур. Предпочтительными субстратами для выделения ВБМ-1 являются культуры клеток ПЦ и ФЭУ. В то же время для выделения ВБМ-2 и ГВИ обычно используются ФЭК [75].
Развитие ЦПД ВБМ (фокусов) в инокулированных клеточных культурах в течение 5—14 дней и отсутствие таких изменений в сравнении с контрольными неинфицированными культурами, свидетельствует о размножении ВБМ. Фокусы серотипов 1, 2 и 3 можно различить по морфологии [137]. В то же время иммунофлюоресцентное окрашивание типоспецифичными МкА обеспечивает более точную дифференциацию.
ВБМ был выделен с помощью культивирования почечных клеток от инфицированных кур [163]. Для доказательства наличия ВБМ особенно полезно использование лимфоцитарных культур в сочетании с реакцией флюоресцирующих Ат [61]. Антиген-положительные культуры лимфоцитов могут служить исходным материалом для инфицирования чувствительных культур клеток.
В настоящее время для диагностики ВБМ применяют следующие серологические тесты: РДП, ИФ, РН и ИФА [145], каждому их которых свойственны недостатки.
Для выявления специфических Ат к ВБМ наибольшее распространение в силу простоты своего выполнения получила реакция диффузионной преципитации (РДП). Лизаты из инфицированных клеточных культур, экстрактов кожи или перьевых фолликулов могут служить источником антигена ВБМ. (Haider и др., 1970; Adldinger и Calnek, 1973). Специфическая полоса преципитации образуется, как правило, в течение 24-72 часов.
В качестве метода обнаружения ВБМ-специфических Ат также может быть использована иммунофлюоресценция в прямом и непрямом вариантах. Для их обнаружения Ат кур, конъюгированные с флюоресцентной меткой или антивидовым (антикуриным) конъюгатом исследуют на наличие флюоресценции, используя фиксированный монослой культуры ФЭК, инфицированной ВБМ. Применение антивидового меченого конъюгата обеспечивает более высокую чувствительность и специфичность сигнала [77].
В реакции серонейтрализации используют клеточно-свободный вирус БМ, выделенный из эпителия кожи или перьевых фолликулов зараженных кур. Отсутствие развития ЦПД служит доказательством нейтрализации вируса, обусловленной наличием и активностью специфических ВНА в исследуемой пробе сыворотки [37].
Иммуноферментный анализ для выявления специфических антител к ВБМ был впервые применен в 1984 г. [46], но не нашел широкого применения в практике. Препятствием для практического применения ИФА с целью выявления Ат к ВБМ являлись низкая специфичность и чувствительность, связанные с источником получения Аг (ФЭК, ПЦ). Решение задачи было связано с выбором нового источника получения Аг ВБМ.
Преимущества ИФА в сравнении с другими серологическими методами заключаются в высокой чувствительности и специфичности, экспрессивности, производительности, возможности стандартизации условий реакции, а также автоматизации практически всех стадий выполнения анализа, включая регистрацию и обработку результатов [28].
В 1977 две группы исследователей под руководством Moscovici и Lai сообщили о получении перевиваемых клеточных линий серии QT (QT2-7, QT24, QT27, QT29, QT35, QT46, QT51, QT53-54), из фибросаркомы перепела (Cotumix_ cgturnix_japonica). Опухоль„индуцировали—внутримышечным- введением 20-метилхолантрена (20 MCA). Попытки получить подобным способом перевиваемые линии клеток от кур и фазанов не увенчались успехом [108].
Позже Antin и Ordahl из клеток QT6, путем серии пассажей при высокой клеточной плотности и субклонирования, получили семь миогенных перевиваемых клеточных линий QM (QM1—4, QM6—8) [39].
В 2002 году Schumacher с коллегами путем трансфекции интегрировал в клеточный геном линии QM7 ген gE вакцинного ВБМ-1 (ответственный за распространение инфекции in vitro). В результате чего была получена рекомбинантная! перевиваемая линия клеток SOgE. Экспрессия клетками гликопротеина Е была подтверждена непрямой ИФ. Чувствительность SOgE к заражению вирулентным ВБМ-1 (RB-1B), вакцинным (Rispens) и другим штаммами 2-го и 3-го серотипов, была сравнима или превосходила таковую ФЭК [141].
Испытуемые сыворотки для непрямого ИФА
Серотипирование осуществляли методом иммунофлюоресценции с применением моноклональных антител, специфичных для всех трех серотипов вируса (L. Lee и др, 1983).
Выращивали культуру ФЭК. Через 24 часа сформировавшийся монослой инфицировали вирусным материалом (ВБМ) рабочими разведениями. Инкубировали до проявления ЦПД (фокусы). Начало формирования фокусов для каждого серотипа различно (3-й серотип через 36 часов, 1-й серотип 120 часов). После появления ЦПД удаляли питательную среду и фиксировали инфицированную культуру раствором ацетон/этанол (6/4) 15 мин. Удаляли фиксирующий раствор, высушивали монослой и увлажняли его ФБР. После чего вносили МкА в рабочем разведении. Инкубировали 30 минут при +37С. Производили отмывку монослоя ФБР и диет, водой.
Вносили FITC-конъюгат в рабочем разведении. Инкубировали 30 минут при +37С. После отмывки подсушивали монослой и вели учет результатов, просматривая планшеты под инвертированным флюоресцентным микроскопом. Принадлежность к определенному серотипу определяли по наличию специфического свечения в лунках.
Выявление Аг ВЛП р27 в сыворотке крови кур иммуноферментным анализом. Отсутствие контаминации ВЛП подтверждали ИФА для выявления —группоспецифического антигена- р27-(Fadly, _А:М. и "Witter," RX "1998), согласно наставлению набора для выявления вируса лейкоза птиц (ВЛП) методом иммуноферментного анализа (ИФА) ООО «НЛП АВИВАК» ТУ 93-004-46262188-05. ,
Выявление вируса ретикулоэндотелиоза (ВРЭ) в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ). Присутствие ВРЭ выявляли методом непрямой иммунофлюоресценции со специфическими для ВРЭ моноклональными антителами (Cui и др., 1986).
В 6-ти луночные планшеты с заранее выращенной вторичной культурой ФЭК вносили исследуемый материал. Использовали два отрицательных (интактная культура ФЭК) и два положительных контроля с ВРЭ (штамм Т-Fisher (ADOL)). Инкубировали 7-10 дней. Удаляли среду, отмывали лунки ФБР. Планшеты высушивали и фиксировали монослой раствором ацетон/этанол (6/4).
На монослой наносили разведения исследуемых сывороток (0,1 мл/лунка), инкубировали 30 минут при +37С. Отмывали несвязавшиеся антитела ФБР и наносили на монослой антимышиные Ат, меченые ФИТЦ, в рабочем разведении. После инкубации (30 мин при +37С) и отмывки несвязавшегося конъюгата проводили учет результатов, просматривая планшеты под инвертированным флюоресцентным микроскопом. При обнаружении в клетках специфической флюоресценции и отсутствии таковой в интактной культуре клеток результат считали положительным.
Выявление ВИАЦ методом ПЦР в реальном времени. Контаминацию вирусом инфекционной анемии цыплят (ВИАЦ) определяли в количественной ПЦР в реальном времени с соответствующими праймерами [106]. 1. Выделение ДНК 1.1. К 600 мкл раствора-1 добавляли 200 мкл исследуемого материала. 1.2. Инкубировали 10-15 мин при комнатной температуре, -периодически-перемешивая-на-шуттеле. - — 1.3. Центрифугировали пробу 1 мин при 13000 g, затем переносили супернатант в новую пробирку. 1.4. Добавляли к супернатанту 40 мкл сорбента, предварительно перемешанного на шутеле, инкубировали 10 мин при комнатной температуре, периодически перемешивая на шутеле. 1.5. Центрифугировали пробу 30 сек при 13000 g, затем удаляли супернатант. 1.6. Производили промывку. 1.7. Добавляли к осадку 100 мкл раствора-2, ресуспендировали его и осаждали центрифугированием (30 сек при 13000 g). Надосадок удаляли, промывку повторяли дважды. 1.8. Добавляли к осадку 100 міси раствора-3, ресуспендировали его и осаждали центрифугированием (30 сек при 13000 g). Надосадок удаляли, промывку повторяли дважды. 1.9. Осадок сушили 5-10 мин при +56С с открытой крышкой. 1.10. Добавляли 30 мкл dd Н20 к осадку и инкубировали пробу 10-15 мин при +56С (с закрытой крышкой). 1.11. Центрифугировали пробу 30 сек при 13000 g. Надосадок использовали для постановки полимеразной цепной реакции.
Определение патотипа полевых изолятов вируса БМ первого серотипа модифицированным методом «Best Fit»
Чувствительность СПФ-кур линии Щелково была несколько ни лее, чем у кур линии «15x7 ab+» (США). Однако, сравнение полученных нами результатов с данными опытов, проведенных в ADOL (Witter и др., 2005) с использованием двух коммерческих линий СПФ-птицы, показало, что чувствительность кур линии Щелково была такой же, как у линии SPAFAS и незначительно превосходила таковую у кур линии Ну-Vac ТК при заражении тремя референтными штаммами. По нашему мнению основным критерием при патотипировании является выраженность патологических изменений БМ _у „инфицированной, птицы, характерных--для различных - патотипов.
Результаты проведенных исследований показали, что птица линии Щелково и три другие породы кур (ADOL «15x7 ab+», SPAFAS и Ну Vac ТК) обладали достаточной чувствительностью для проведения патотипирования полевых изолятовВБМ-1 [171, 173].
Характерные клинические и патологоанатомические признаки БМ, используемые при патотипировании, могут варьировать в зависимости от нескольких факторов. Так, например, штаммы JM/102W и Md5 четко различали по общей частоте выявления БМ (%) у цыплят, вакцинированных штаммом FC-126, а также по выявлению БМ у павших птиц (%) и общей частоте выявления БМ (%) у невакцинированных птиц. Схожие различия наблюдались при заражении штаммами Md5 и 648А по общей частоте выявления БМ (%) как в группах, привитых бивалентной вакциной, так и вакцинированных штаммом FC-126, а также по средневзвешенному значению этих показателей. Данные наших экспериментов с применением модифицированного «Best Fit» метода аналогичны результатам, полученным ранее в США (Witter и др., 2005), за исключением того, что вместо штамма ВБМ второго серотипа SB-1 (компонента бивалентной вакцины) был использован штамм 301В/1. Иммуногенность штамма 301В/1 идентична иммуногенности штамма SB-1 [166], поэтому данная замена не повлияла на результаты опытов.
В нашем исследовании была усовершенствована математическая модель классификации полевых изолятов ВБМ-1 относительно референтных штаммов. Как упоминалось ранее, патотипы v и w наиболее показательно различались по общей частоте выявления БМ (%) и по выявлению БМ у павших птиц (%) в группах невакцинированных цыплят, а также по общей частоте выявления БМ (%) у цыплят, привитых штаммом FC-126 и бивалентной вакциной. Введение средневзвешенного значения для этих величин показывает, как единичный признак может служить основным критерием для различия патотипов w и vv+. Эмпирически было установлено, что необхрдимо использовать данные подгруппам птиц, привитых разными вакцинами, но результаты по цыплятам, привитым бивалентной вакциной, оказались наиболее важными и заслуживающими вычисления двойного средневзвешенного значения по методу Гаусса. Такое объединение данных для расчета степени вирулентности уже имело место в опытах с использованием двух линий птиц (Witter, 1997). Более того, расчет точки распределения исследуемого изолята на шкале вирулентности позволил математически обосновать простое визуальное сравнение патологических изменений БМ. В наших исследованиях, вычисление точки распределения основывалось на средневзвешенной величине и помогало обозначить патотип изолятов ВБМ-1, находившимися между референтными штаммами Md5 и 648А (рис. 3). Эти изменения позволили нам усовершенствовать определение эффективности модифицированного «Best Fit» метода.
Разработанная в ADOL процедура изоляции полевых ВБМ 1-го серотипа из образцов крови (выделение, накопление, серотипирование, очистка и создание коллекции) была адаптирована к условиям нашей лаборатории. По причине труднодоступности утиных СПФ-эмбрионов, вместо фибробластов эмбрионов уток (ФЭУ) изоляцию и размножение вирусов проводили, используя фибробласты эмбрионов кур (ФЭК).
Результаты проведенных нами исследований показывают, что модифицированный метод патотипирования «Best Fit» является объективным и практичным инструментом для классификации российских полевых изолятов ВБМ-1 по степени вирулентности.
Двадцать изолятов ВБМ-1, выделенных на 12-ти птицефабриках, описанные в данной работе, являются достаточно ограниченной выборкой всех полевых вирусов БМ, циркулирующих на территории Российской Федерации. Все изоляты были получены из хозяйств с явным проявлением комплекса клинических и патологоанатомических признаков БМ.
