Конструирование продуцентов рекомбинантных белков Р72, Р30 и Р54 вируса африканской чумы свиней Казакова, Анна Сергеевна

Введение к работе

1.1 Актуальность работы. Африканская чума свиней (АЧС) - вирусная инфекционная болезнь диких и домашних свиней различных пород, характеризующаяся высокой летальностью и контагиозностью, сверхострым, подострым, острым и хроническим течением, передающаяся от больных животных и вирусоносителей контактным, алиментарным путём, а также трансплацентарно, вызывая аборты и гибель плодов у супоросных свиноматок.

В Российской Федерации (РФ) АЧС регистрируется с 2007 года и на протяжении последних лет страна является зоной стационарного неблагополучия по данному заболеванию [1, 2].

Отсутствие надежных профилактических средств против АЧС обусловлено уникальностью структуры вируса и свойств его белков.

Для вируса характерно наличие как иммуносупрессирующих белков, так и белков - модуляторов морфогенеза. Кроме того, его геном содержит гены, отвечающие за своеобразную «мимикрию» вируса, а его CD2v белок, по данным P.C. Kay-Jackson и соавт. (2004), ответственен за повышение инвазивности макрофагов в отношении вируса [3].

Белок р72 является основным структурным компонентом капсида вириона и мажорным белком вируса АЧС, который продуцируется на поздних стадиях инфекции [4]. Исследованиями ультраструктуры вириона, проведенными R.G. Escudero и соавт. (1998), установлено, что p72 - основной капсидный белок, локализирующийся между двумя слоями липопротеидной оболочки во внеклеточных вирусных частицах [5].

Белок p30 также входит в состав внутренней мембраны вирусной частицы и по структуре представляет собой фосфопротеин [6]. По данным P. Gomez-Puertas и соавт. (1998), совместное введение белков р30 и р54 вызывает образование протективных антител у животных. При экспериментальном заражении свиней, иммунизированных рекомбинантными белками, вирулентным вирусом (штамм E75) наблюдались либо задержка течения инфекционного процесса, либо полное прекращение развития инфекции и выздоровление животных [7].

Структурный белок p54 -трансмембранный гликопротеин. Он является одним из поверхностных белков, и выявляется на позднем этапе репродукции вируса. Этот белок обеспечивает прикрепление вируса АЧС к клетке хозяина. Его молекулярная масса у различных изолятов варьирует от 24 до 28 кДа [8].

Во ВНИИВВиМ проведены значительные исследования по изучению биологии возбудителя. Н.И. Митиным, В.А. Бурлаковым, В.М. Балышевым и др. разработаны живые вакцины на основе аттенуированных штаммов против I-IV сероиммунотипов вируса АЧС. В.М. Колосовым, А.В. Киселевым и др. установлено, что вирус АЧС гетерогенен по составу генома, физико-химическим свойствам, патогенности, антигенности и способности индуцировать гемадсорбцию. И.В. Федорищевым, Ю.О. Селяниновым, С.Ж. Цыбановым разработаны методы классификации штаммов, основанные на генетических и фенотипических свойствах вируса.

Поскольку использование живых вакцин против АЧС может привести к длительной персистенции вируса среди свиней, основными мерами борьбы с распространением болезни являются ранняя диагностика, ликвидация очагов, вынужденный убой животных и строгие карантинные мероприятия. При данном подходе к иррадикации АЧС разработка и совершенствование высокочувствительных методов ранней диагностики с использованием рекомбинантных белков являются первоочередными задачами.

1.2 Степень разработанности проблемы. Для диагностики АЧС методом ТФ ИФА во ВНИИВВиМ Л.Я. Цыбановой (1985) и В.О. Копытовым (2004) разработаны наборы на основе культуральных антигенов вируса АЧС («Набор диагностикумов для твердофазного иммуноферментного анализа при болезни свиней») и экспериментальный образец набора на основе рекомбинантного белка p30 («Набор диагностических препаратов на основе рекомбинантного антигена вируса африканской чумы свиней для ТФ ИФА») соответственно.

Использование рекомбинантных антигенов для диагностики - перспективное направление, преимуществом которого является биологическая и экологическая безопасность, относительная дешевизна, высокая воспроизводимость результатов и приближающаяся к 100% точность анализа. Возможность применения рекомбинантных белков для диагностики АЧС продемонстрировано J.M.P. Freije и соавт. (1993): вариант ТФ ИФА на основе рекомбинантного р72 позволил с 95% достоверностью дифференцировать положительные сыворотки от негативных [9].

Разработанный M.I. Vidal и соавт. (1997) конкурентный метод ТФ ИФА на основе моноклональных антител к vр73 [10] дал возможность прижизненно выявлять персистентно инфицированных вирусом АЧС свиней по наличию антител в сыворотке крови. Его применение позволяет установить их присутствие даже в образцах с низким титром специфических антител.

Таким образом, конструирование продуцентов рекомбинантных белков: Rec р72, р72е и р30 в векторе pET23b(+); Rec р30, Rec р54 на основе плазмиды pET32b(+), анализ эффективности их применения для выявления антител к вирусу АЧС и изучения его морфогенеза является впервые разрабатываемым направлением.

1. Цели и задачи исследования. Основной целью данной работы являлось конструирование продуцентов рекомбинантных белков р72, р30 и р54 вируса африканской чумы свиней и изучение их характеристик.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. 1. сконструировать продуценты рекомбинантных белков р72, р30 и р54;

   2. получить рекомбинантные белки р72, р30 и р54;

   3. отработать параметры очистки полученных рекомбинантных белков;

   4. изучить возможность использования Rec р72 и р30 для определения антител в сыворотках и плазме крови и селезенке больных и инфицированных вирусом АЧС свиней в ТФ ИФА;

   5. получить моноспецифические сыворотки к Rec p30 и p54;

   6. определить применимость полученных моноспецифических сывороток к Rec р30 и р54 в реакциях непрямой иммунофлуоресценции и задержки гемадсорбции;

   7. провести филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих р30 и E183L (р54).

   Научная новизна результатов исследований. Впервые в РФ клонированы гены B646L (р72) вируса АЧС штамма Magadi, CP204L (р30) изолята Krasnodar 2008 и штамма Magadi, E183L (р54) штаммов Magadi, NVL-1, KK-262 и изолята Armenia 2007 и сконструированы продуценты рекомбинантных белков вируса АЧС: Rec р54 (штаммов Magadi и NVL-1) на основе плазмид pET23b(+) и pET32b(+); полноразмерного Rec р72 и р72е (штамма Magadi) в векторе pET23b(+); полноразмерного Rec р30 (изолята Krasnodar 2008 и штамма Magadi) в векторе pET32b(+).

   Впервые определены и депонированы в GeneBank нуклеотидные последовательности гена E183L (р54) штаммов и изолятов вируса АЧС: Armenia 2007 (JQ771681), Krasnodar 2008 (JQ771683), Elbrus 2008 (JQ771682), Stavropol 2008 (JQ771686), Orenburg 2009 (JQ771684) и Rostov 2009 (JQ771685), и проведен сравнительный анализ их гомологии с использованием программ BioEdit 6.0.7. и MEGA 5.05.

   При проведении филогенетического анализа установлено, что 102 исследуемых последовательностей гена, кодирующего р54 штаммов и изолятов вируса АЧС, группируются в субкластеры, соотвєтствєтствующиє сероиммунотиповой классификации, разработанной во ВНИИВВиМ.

   Получен клон клеток E. coli рТТ9/ASFVp30 для высокоэффективной экспрессии Rec р30е, пригодный для изготовления диагностических препаратов (патент на изобретение № 2463343, бюл. № 28 от 10.10.2012), депонированный в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (инв. № 2966).

   Данная работа является одним из этапов изучения структурных и функциональных особенностей белков вируса АЧС: выяснения их роли в патогенезе болезни и использования в качестве компонентов диагностических наборов.

   3. Теоретическая и практическая значимость работы. Получены продуценты рекомбинантных белков, позволяющие получить препаративные количества высокооочищенных Rec р72, р72е, р30, р30е и р54.

   Подобраны условия сенсибилизации Rec р30е и р72е, позволяющие выявлять антитела к вирусу АЧС в полевых сыворотках и сыворотках от экспериментально зараженных вирусом АЧС свиней в непрямом варианте ТФ ИФА, повысить специфичность реакции и увеличить ее чувствительность в 4-8 раз по сравнению с таковой «Набора диагностикумов для твердофазного иммуноферментного анализа при африканской чуме свиней».

   Разработана методика получения моноспецифической сыворотки к рекомбинантному белку р30 вируса АЧС.

   Получены моноспецифические сыворотки к Rec p30e и р30, пригодные для использования в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ).

   4. Апробация результатов работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (2008-2013 гг.), на Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (УГСХА, Ульяновск, 2009 г.), на конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, Покров, 2009 г.), на Международной конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (ВНИТИБП, Щелково, 2009 г.), на II-ой Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (УГСХА, Ульяновск, 2010 г.), на 4 Международном конгрессе по вакцинам (Австрия, Вена, 2010 г.), на Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (УГСХА, Ульяновск, 2011 г.), на заседании в рамках Международного курса по трансграничным болезням животных в Центре по болезням животных (США, остров Плам, 2011 г.), на конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику» (ФГБУ «ВНИИЗЖ», Владимир, 2012 г.).

   5. Соответствие диссертации паспорту научной специальности, по которой она рекомендуется к защите. В соответствии с формулой специальности 03.02.02 Вирусология, охватывающей проблемы исследования вирусов, их химического состава, генетики, морфологии, морфогенеза, а также проблемы противовирусного иммунитета, разработку средств диагностики, вызываемых вирусами заболеваний, включая области исследований: изучение химического состава, структуры и строения вирусов, антигенных свойств вирусов; исследование морфологии и морфогенеза вирусов, особенностей репродукции вирусов и их взаимоотношений с восприимчивыми к вирусам клетками; проблемы генной инженерии; разработку диагностики и совершенствование лабораторных диагностических систем, в диссертационной работе приведены исследования по конструированию продуцентов E. coli, экспрессирующих рекомбинантные белки, пригодные для использования в диагностических реакциях, описан метод получения и свойства моноспецифических сывороток к рекомбинантным белкам p54 и p30, которые использованы для изучения особенностей репродукции вируса АЧС и диагностических исследований.

   Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности - 2, 3, 5, 10.

   6. Публикации. Основные результаты исследований опубликованы в семнадцати научных работах в открытой печати, в том числе три статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, и один патент на изобретение.

   7. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение собственных исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы, включающий 41 отечественный и 163 иностранных источников (в том числе 24 электронных ресурса), дополнена 7 приложениями. Диссертация иллюстрирована 19 таблицами и 34 рисунками.

   8. Основные положения, выносимые на защиту:

      1. рекомбинантные клоны E. coli, несущие гены, кодирующие р72е и р30е, экспрессируют белки, пригодны для выявления антител к вирусу АЧС;

      2. нуклеотидные последовательности гена, кодирующего р54, имеют максимальную гомологию 100% у штаммов и изолятов, имеющих происхождение с территории Российской Федерации и Республики Армения;

      3. моноспецифические сыворотки получены к Rec p54 и p30 и пригодны для изучения особенностей репродукции вируса АЧС.

      1.11 Личный вклад автора в выполнение работы. Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии в 2008-2012 гг. по плановым тематикам НИР и в рамках гранта РФФИ № 12-04-31378 «Рекомбинантные белки вируса АЧС для изучения основ его иммуногенности и патогенности» (Договор № 12-04-31378\12 от 22.10.2012), руководителем которого соискатель является. Отдельные этапы выполнены при практической и консультативной помощи к.в.н. О.В. Капустиной; к.б.н. Т.Э. Южук; сотрудников лабораторий Диагностики, Биотехнологии, Музейных штаммов, Биофизики и Научно-экспериментального отдела ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, а также сотрудников ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России: к.х.н. Т.А. Акопиан и к.б.н. Е.С. Кострюковой.

      Похожие диссертации на Конструирование продуцентов рекомбинантных белков Р72, Р30 и Р54 вируса африканской чумы свиней

      

      Получение рекомбинантных вирусов классической чумы свиней и респираторно-синцитиального вируса человека на основе инфекционных копий их геномов Забережный Алексей Дмитриевич

      

      Совершенствование методов индикации генома вируса африканской чумы свиней в объектах ветеринарного надзораГазаев, Исмаил Хизирович

      

      Анализ структуры генов изолятов вируса африканской чумы свиней, выделенных на территории Российской ФедерацииВаренцова Алиса Алексеевна

      

      Генотипирование изолятов вируса африканской чумы свинейЕлсукова, Александра Андреевна

      

      Клонирование и экспрессия генов структурных белков Р30 и Р72 вируса африканской чумы свиней Копытов Валерий Олегович

      

      Эпитопное картирование поверхностного гликопротеина Е2 вируса классической чумы свинейКостина Людмила Владимировна

      

      Разработка твердофазного иммуноферментного анализа для прямого обнаружения антигенов вируса классической чумы свинейВасильев Александр Павлович

      

      Разработка и совершенствование методов иммуноферментной диагностики классической чумы свинейБьядовская Ольга Петровна

      

      Создание синтетических антигенов для лабораторной диагностики губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота и классической чумы свиней Решетников Геннадий Геннадьевич

      

      Разработка экспресс-метода диагностики чумы плотоядных и индикации возбудителя болезни - вируса чумы собакНогина Ирина Викторовна