Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 12
2.1. Характеристика вируса КЧС 12
2.1.1. Классификация, морфология и физико-химические свойства вируса КЧС 12
2.1.2. Организация генома вируса КЧС и антигенные свойства кодируемых структурных белков 12
2.1.3. Биологические свойства вируса КЧС 17
2.2. Характеристика возбудителя ГЭ КРС 21
2.2.1. Структура прионного белка 21
2.2.2. Свойства прионного белка 22
2.2.3. Диагностика прионных болезней 24
2.3. Получение пептидов и использование созданных на их основе синтетических антигенов в диагностике инфекционных заболеваний животных и человека 25
2.3.1. Методы теоретического поиска иммунодоминантных участков белков 25
2.3.2. Краткое описание методов синтеза пептидов 30
2.3.3. Получение искусственных антигенов на основе синтетических пептидов для диагностики инфекционных заболеваний животных и человека 32
2.4. Заключение по литературному обзору 51
3. Собственные исследования 52
3.1. Материалы и методы 52
3.1.1. Материалы, оборудование и реагенты 52
3.1.2. Методы исследования 53
3.2. Результаты собственных исследований 64
3.2.1. Компьютерный анализ аминокислотной последова тельности белка Е2 вируса КЧС штамма ЛК ВНИИВВиМ 64
3.2.2. Компьютерный анализ аминокислотной последовательности прионного белка КРС 67
3.2.3. Твердофазный синтез пептидов - фрагментов белка Е2 вируса КЧС и прионного белка КРС 68
3.2.3.1. Синтез пептидов Boc/Bzl методом 69
3.2.3.2. Синтез пептидов Fmoc/But методом 73
3.2.4. Результаты аминокислотного анализа синтетических фрагментов белка Е2 вируса КЧС и прионного белка КРС 75
3.2.5. Смеси, созданные на основе пептидов, и МАР-конструкция 77
3.2.6. Антигенные свойства свободных пептидов -фрагментов белка Е2 вируса КЧС и их смесей. Иммуногенные свойства конъюгатов пептидов с белками-носителями, смесей и МАР-конструкции 79
3.2.7. Изучение возможности использования синтетических пептидов и смесей, созданных на их основе, для выявления антител к вирусу КЧС 84
3.2.8. Изучение иммуногенных свойств пептидов -фрагментов прионного белка КРС и смесей, созданных на их основе 95
3.2.9. Изучение возможности использования антител против синтетических фрагментов прионного белка КРС для выявления возбудителя ГЭ КРС иммуногистохимичес-ким методом 98
4. Обсуждение результатов 102
5. Выводы 113
6. Практические предложения 114
7. Список использованной литературы 115
Приложения 140
- Организация генома вируса КЧС и антигенные свойства кодируемых структурных белков
- Получение пептидов и использование созданных на их основе синтетических антигенов в диагностике инфекционных заболеваний животных и человека
- Компьютерный анализ аминокислотной последова тельности белка Е2 вируса КЧС штамма ЛК ВНИИВВиМ
- Антигенные свойства свободных пептидов -фрагментов белка Е2 вируса КЧС и их смесей. Иммуногенные свойства конъюгатов пептидов с белками-носителями, смесей и МАР-конструкции
Введение к работе
Актуальность темы. Классическая (европейская) чума свиней (КЧС) является высоко контагиозным вирусным заболеванием свиней, наносящим большой экономический ущерб. Несмотря на предпринимаемые ветеринарно-санитарные меры, эта инфекция по-прежнему широко распространена во многих странах мира [1, 29, 46].
Следует отметить, что существует два направления в борьбе с КЧС. Первое из них реализуется в странах Западной Европы и США, где отказались от вакцинации животных и при подозрении на КЧС осуществляется убой всего стада ("stamping out") [39]. Второе направление применяется в ряде стран Восточной Европы, странах СНГ, в том числе и в России, где основной мерой борьбы является вакцинация и убой больных животных. Однако ни один из этих подходов не гарантирует надежной защиты животных. На это указывают периодически возникающие эпизоотии КЧС, регистрируемые на территории различных государств [О.I.E. Bulletin, 1990-2004 г.г.].
В виду того, что течение болезни, вызываемое вирусом КЧС, характеризуется многообразием форм, окончательный диагноз устанавливается на основе лабораторных методов исследований [38, 40, 50, 90, 185]. Лабораторная диагностика КЧС основана на выделении и идентификации вируса с использованием культур клеток, прямом обнаружении вирусного антигена и выявлении вирусспецифичных антител. При этом традиционными являются метод иммунофлюоресценции, иммунопероксидазный метод, реакция нейтрализации вируса, РИГА. За последние два десятилетия, в связи с бурным развитием молекулярной биологии, генетической и клеточной инженерии, появились новые методы, которые нашли свое применение в диагностике этого заболевания. Прежде всего, это ПЦР и ИФА с использованием рекомбинантных белков и антител, полученных к ним [34, 39, 50, 111, 112,175], а также мАт, обладающих высокой аффинностью к вирусу КЧС [117, 118, 158, 228].
Так как КЧС, наряду с ящуром, сибирской язвой, чумой КРС и другими болезнями, относится к списку особо опасных, получение синтетических пептидов позволяет исключить использование инфекционного вирусного материала в некоторых вышеуказанных методах. Кроме того, существует целый ряд трудностей, связанных с культивированием вируса КЧС [4, 39, 40, 50, 81, 100, 201] и химический синтез искусственных антигенов является в этом случае перспективным направлением.
Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота (ГЭ КРС) относится к прионным инфекциям. Возникновение этой болезни и ликвидация ее последствий приводит к большим экономическим потерям. Доказательством этого может служить вспышка ГЭ КРС в Великобритании. С ноября 1986 года, то есть с момента регистрации первого случая заболевания и до 1996 года, общее число пораженных животных составило более 180 тыс. голов КРС [33], а общие затраты составили 4 млрд. фунтов стерлингов [49].
Для диагностики ГЭ КРС разработано несколько лабораторных методов: гистологический, в основе которого лежит оценка изменений в препаратах срезов мозга больных животных, а также ИГХМ, иммуноблотт и ИФА, с использованием специфичных антител [17, 74, 153]. Метод постановки биопробы на естественно восприимчивых животных является чувствительным, но и самым дорогостоящим. Кроме того, он требует продолжительного времени из-за длительности инкубационного периода заболевания. Метод электронной микроскопии позволяет выявлять амилоидные стержни и скрепиассоциированные фибриллы (САФ) в предварительно обработанных пробах мозга или селезенки инфицированных животных [12, 17]. Однако некоторыми исследователями показана низкая чувствительность данного метода [74].
Высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей прионного белка у различных видов животных, а также полное совпадение аминокислотного состава нормальной и аномальной формы белка, затрудняют его использование в качестве иммуногена. Применение пептидных фрагментов прионного белка, полученных путем химического синтеза, предоставляет широкие возможности в получении специфичных противоприонных антител [5, 73]. Кроме того, известно, что возбудитель ГЭ КРС является опасным для человека. Поэтому использование синтетических антигенов в изучении прионных заболеваний исключает вероятность заражения.
Таким образом, химический синтез позволяет получать антигены, которые также как и нативные (природные), обладают антигенными и иммуногенными свойствами. Кроме того, они стабильны при хранении и являются безопасными; процесс их получения легко поддается стандартизации [63, 84, 85].
В отечественной и зарубежной практике имеется большое количество примеров эффективного использования синтетических пептидов в изучении антигенных и иммуногенных свойств белков различных вирусов животных и человека. В некоторых случаях это позволило создать на их основе диагностические тест-ситемы и коммерческие наборы.
Однако некоторые проблемы диагностики ГЭ КРС и КЧС до конца не решены. В связи с этим требуется проведение работы, направленной на получение синтетических антигенов и изучение возможности их применения в различных иммунологических методах исследований.
Цели и задачи исследований. Основная цель данной работы -получение синтетических антигенов и изучение возможности их использования в лабораторной диагностике КЧС и ГЭ КРС.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
- выявить наиболее вероятную локализацию потенциальных антигенных детерминант белка Е2 вируса КЧС, прионного белка КРС и синтезировать соответствующие им аминокислотные последовательности, получить на их основе смеси и конъюгаты с белками-носителями;
- изучить антигенные и иммуногенные свойства свободных фрагментов белка Е2 вируса КЧС, конъюгатов пептидов с белками-носителями, смесей и оценить возможность их применения в непрямом варианте ИФА и РИГА для выявления антивирусных антител в пробах сыворотки крови свиней;
- разработать методику использования пептидов - фрагментов белка Е2 вируса КЧС в непрямом варианте ИФА и РИГА для выявления вирусспецифичных антител в пробах сыворотки крови свиней;
- изучить иммуногенные свойства свободных пептидов - фрагментов прионного белка КРС и смесей, созданных на их основе;
разработать методические указания по применению смеси антипептидных антител, полученных к синтетическим фрагментам из центральной и С-концевой области прионного белка КРС, для выявления возбудителя ГЭ КРС иммуногистохимическим методом.
Научная новизна. Впервые в нашей стране с использованием Boc/Bzl и Fmoc/But методов твердофазного синтеза получены пептиды, представляющие собой фрагменты белка Е2 вируса КЧС штамма ЛК ВНИИВВиМ, и пептиды, соответствующие аминокислотным
последовательностям 106-126 и 206-229 прионного белка КРС. Изучены физико-химические свойства синтетических антигенов, на их основе получены смеси и конъюгаты с белками-носителями.
Проведены исследования антигенных и иммуногенных свойств пептидов - фрагментов белка Е2 вируса КЧС, созданных на их основе смесей и конъюгатов.
Показана возможность использования смеси пептидов для обнаружения антител к вирусу КЧС в пробах сыворотки крови свиней методом непрямого варианта ИФА и РИГА.
Изучены иммуногенные свойства пептидов - фрагментов прионного белка КРС и смесей, созданных на их основе.
Показана возможность использования смеси антипептидных антител, полученных при иммунизации кроликов синтетическими фрагментами из центральной и С-концевой области прионного белка КРС, для выявления возбудителя ГЭ КРС иммуногистохимическим методом.
Практическая значимость. Разработаны и реализованы схемы синтеза индивидуальных пептидов - фрагментов белка Е2 вируса КЧС и прионного белка КРС с использованием Boc/Bzl и Fmoc/But методов.
Разработаны "Методические указания по использованию синтетических антигенов для обнаружения антител к вирусу классической чумы свиней методом непрямого иммуноферментного анализа", которые утверждены директором института 19.03.2003 г.
Разработаны "Методические указания по использованию синтетических антигенов для обнаружения антител к вирусу классической чумы свиней в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА)", которые утверждены директором института 07.02.2003 г.
С использованием вышеуказанных методик проведено исследование 138 проб сыворотки крови свиней из различных свиноводческих хозяйств Российской Федерации.
Разработаны "Методические указания по применению смеси антител к фрагментам прионного белка для лабораторной диагностики губкообразной энцефалопатии КРС иммуногистохимическим методом", которые утверждены директором института 24.03.2005 г. С использованием разработанной методики исследовано 56 препаратов, представляющих собой срезы головного мозга КРС.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.
Основные положения, выносимые на защиту:
• Синтетические фрагменты белка Е2 вируса КЧС штамма ЛК ВНИИВВиМ и
прионного белка КРС.
• Результаты изучения антигенных и иммуногенных свойств пептидов фрагментов белка Е2 вируса КЧС, созданных на их основе смесей и конъюгатов с белками-носителями.
• Результаты исследования проб сыворотки крови свиней согласно методическим указаниям по использованию синтетических антигенов для обнаружения антител к вирусу КЧС в непрямом варианте ИФА и РИГА.
• Иммуногенная активность пептидов - фрагментов прионного белка КРС и смесей, созданных на их основе.
Результаты испытаний «Методических указаний по применению смеси антител к фрагментам прионного белка для лабораторной диагностики губкообразной энцефалопатии КРС иммуногистохимическим методом».
Апробация результатов работы. Результаты исследований по теме диссертации представлены и обсуждены на заседаниях ученого совета ФГУ ВНИИЗЖ и на следующих научных конференциях в период 1997-2004 гг.: научной конференции, посвященной 100-летию открытия вируса ящура "Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных" (Владимир, 1997 г.), Всероссийской научно-практической конференции "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов" (Щелково, 2000 г.), конференции молодых ученых "Актуальные проблемы патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота" (Владимир, 2002 г.), Международной научной конференции "Актуальные проблемы инфекционной патологии животных" (Владимир, 2003 г.), Международной научной конференции молодых ученых "Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных" (Владимир, 2004 г.).
Объем и структура работы. Исследования по диссертационной работе выполнены в 1997-2005 г.г. в ФГУ "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГУ ВНИИЗЖ, г. Владимир). Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы, содержащего 237 источников, из них 142 - зарубежных авторов, и приложения. Работа иллюстрирована 20 рисунками и содержит 15 таблиц.
Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лабораторий «Малоизученных болезней», «Болезней свиней», «Диагностики особо опасных болезней животных» и «Диагностики болезней КРС и свиней» за оказанную помощь в проведении отдельных этапов работы и их обсуждение.
Организация генома вируса КЧС и антигенные свойства кодируемых структурных белков
Первоначально вирус КЧС был отнесен к сем. Togaviridae род. Pestivirus, так как он имел нукпеокапсид с икосаэдрическим типом симметрии, оболочку и однонитиевую РНК. Однако развитие молекулярно-биологических методов исследований позволило получить новые данные о стратегии репликации вируса КЧС в клетках и организации его генома. В 1990 году была предложена новая классификация согласно которой вирус КЧС, вместе с вирусом диареи КРС и вирусом пограничной болезни овец, стал относится к сем. Flaviviridae в рамках того же рода Pestivirus [129]. Вирионы пестивирусов представляют собой сферические частицы диаметром 40 - 45 нм с икосаэдрическим типом симметрии. Они состоят из нуклеокапсида размером 29 нм и оболочки, содержащей липиды [50, 81]. Коэффициент седиментации составляет 108±24 S, плавучая плотность -1,12-1,17 г/см3. Вирус чувствителен к температурному фактору: при температуре 56С инактивируется через 60 минут, при 100С - моментально, при температуре 35С теряет инфекционность в течение 2-х недель. Вирус, содержащийся в образцах сыворотки крови животных, сохранял свою активность в течение 6 месяцев при температуре 2 - 4С [31, 81, 91]. Ультрафиолетовый свет с длиной волны 254 нм инактивирует культуральный вирус через 5 - 10 минут. Дезинфецирующими веществами являются 2 - 3% раствор NaOH, формальдегид (2,5%), хлорная известь в соотношении с водой 1:20, 3 - 6% крезоловое мыло. Геном возбудителя КЧС представлен одноцепочечной РНК положительной полярности с коэффициентом седиментации 40 - 50 S и молекулярной массой 4x106Д. Геном составляют 12284 пар нуклеотидных оснований. Определена 1 рамка считывания, которая кодирует полипротеин размером 3898 а.о. В 5; и З концевых фрагментах РНК содержатся нетранслируемые участки генома [50, 198]. В составе вируса идентифицированы неструктурные белки (автопротеаза р23 (Npro) и р123) и четыре структурных: нуклеокапсидный р14 (С), Е0 (Erns или др44/48), Е1 (дрЗЗ) и Е2 (др55). Последние три белка являются гликопротеинами вирусной оболочки [11, 29, 34]. В некоторых работах авторы используют другую номенклатуру, обозначая белок др55 как Е1, др44/48 - Е2 и дрЗЗ - ЕЗ.
В данной работе мы будем придерживаться номенклатуры, которая имеет более широкое распространение, а именно: Е0 (Erns или др44/48), Е1 (дрЗЗ) и Е2 (др55). В 1990 году Stark R. et al. идентифицировали четыре гликопротеина оболочки вируса КЧС: дрЗЗ, др44, др48 и др55 [206]. Методом радиоиммунопреципитации установлено, что др44 и др48 связаны между собой. Авторы предложили следующее расположение белков: NH2 - gp44/48 -дрЗЗ - др55 - СООН. Результаты более поздних исследований [198, 199, 214, 225] подтвердили локализацию гликопротеинов вируса КЧС, предложенную ранее [206]. Идентификация сайтов расщепления гликопротеинов позволила определить точные границы их расположения в аминокислотной последовательности [173, 200]. Установлено, что Glu в положении 268 а.о. для белка Е0, Leu - 507 а.о. для Е1 и Arg - 690 а.о. для Е2 в направлении от N конца (рис. 1). нуклеотиды В 1989 году впервые была предложена модель иммунодоминантного сайта вируса КЧС, которая включала в себя 13 эпитопов, формирующих 4 антигенных домена: А, В, С и D [229]. Wensvoort G. et al. [227] установили, что белок Е2 содержит указанные основные антигенные детерминанты вируса КЧС. Авторы работы [138] подтвердили наличие консервативных эпитопов в составе гликопротеина др55 вируса КЧС. С использованием панели мАт были определены два консервативных домена. Рис. 2. Предполагаемая антигенная структура белка Е2 вируса КЧС Дальнейшее эпитопное картирование белка Е2 с помощью мАт, проведенное Van Rijn Р.А. et al. [220, 221], показало, что консервативные эпитопы домена А локализованы между 766-866 а.о. и только один, неконсервативный эпитоп этого домена расположен в районе 766-813 аминокислоты. Эпитопы домена В и один из эпитопов домена С картированы между 690-773 а.о., остальные эпитопы домена С - между 691-800 а.о. Домен D представлен эпитопами, локализованными в области 766-800 аминокислоты.
Получение пептидов и использование созданных на их основе синтетических антигенов в диагностике инфекционных заболеваний животных и человека
Современная иммунология представляет двойную модель взаимодействия антигена и антитела. С одной стороны, реакция этих компонентов происходит в результате пространственной комплементарности. Антигенная детерминанта в этом случае должна находится на поверхности белковой глобулы и быть доступной для антитела.
С другой стороны, при образовании комплекса "антиген+антитело" происходят конформационные изменения в том участке полипептидной цепи, который содержит детерминанту, что предполагает ее подвижность [68]. Такое состояние полипептидной цепи, которое обеспечивает экспонирование антигенных детерминант, соответствует определенной вторичной и третичной структуре белка [21].
В водных растворах, где проявляется основная активность белков, скручивание полипептидных цепей ведет к маскировке гидрофобных остатков внутри молекулы белка, в то время как гидрофильные (полярные) группы экспонируются на поверхности.
Стабильное состояние и биологически активная структура поддерживается благодаря наличию водородных, ионных, дисульфидных связей, ван-дер-ваальсовых сил и гидрофобных взаимодействий. Необходимым условием для получения синтетических антигенов является информация о локализации антигенных детерминант в структуре исследуемого белка. Для определения первичной структуры белков широко и успешно используются методы генетической инженерии. Нахождение антигенных участков в аминокислотной последовательности осуществляется на основе компьютерного поиска. В основе программ лежат конкретные физико-химические свойства полипептидной цепи и связанные с ними параметры (гидрофобность, гидрофильность, амфипатичность и другие). Они могут быть представлены в виде профилей, охватывающих всю цепь [21].
Норр Т.Р. и Woods K.R. [148] предложили метод, в котором каждой аминокислоте в первичной последовательности присваивается индекс гидрофильности. Далее эта величина усредняется перемещением рамки сканирования (6 а.о.) вдоль всей полипептидной цепи. Среднее значение показывает склонность данного участка к экспонированию. По полученным результатам строятся профили гидрофильности, а по максимальным пикам выбираются потенциальные антигенные детерминанты.
Parker J. et al. [183] предложили построение профиля гидрофильности исходя из определения времени удерживания отдельных аминокислот модельных синтетических пептидов и исследуемых белков методом жидкостной хроматографии.
Гидрофобность также является важным показателем эпитопов. Спрятанные гидрофобные участки глобулы экспонируются при взаимодействии антигена с антителом, а Т-клеточные эпитопы встраиваются в гидрофобную мембрану антигенпрезентирующей клетки [68]. Kyte J. и Doolittle R.F. [161] предложили оценивать показатель гидрофобности аналогично методу Норр Т.Р. и Woods K.R. [148]. Рамка считывания при этом охватывает 9 а.о. Среднее значение показывает склонность данного сегмента к экспонированности или маскировке внутри молекулы белка. Eisenberg D. et al. [120] выявили периодичность в чередовании гидрофильных и гидрофобных остатков в зависимости от типа вторичной структуры. Фактор гидрофильности влияет на расположение гидрофильных и гидрофобных а.о. таким образом, что они располагаются на противоположных сторонах спиральных участков полипептидной цепи с определенной периодичностью.
Предположение о том, что Т-эпитопы имеют вид амфипатической спирали, легло в основу алгоритмов их поиска, разработанных De Lizi С, Berzofsky J. [113] и Rothbard I. [197]. На основе показателя гидрофобности построен метод Lim V., согласно которому гидрофобные остатки в составе ос-спиралей и р-складок распределены в определенных позициях [165].
Parker J. и Hodges R. показали возможность идентификации в белке полярных трипептидных сегментов, имеющих, по их мнению, склонность к локализации на поверхности молекулы белка. Было предложено локализовать антигенные детерминанты путем расчета индекса экспонированности участков полипептидной цепи [184, 215].
Антигенная детерминанта должна обладать определенной гибкостью и подвижностью сегмента, где располагается В-эпитоп. Karplus Р.А. и Schulz G.E. разработали метод предсказания таких участков [152]. Мера гибкости цепи зависит от температурного фактора Са-атома. Он определяется из кристаллографических данных ряда белков. В сочетании с несколькими альтернативными методами предсказание гибкости должно способствовать эффективному выбору антигенных детерминант. Была установлена зависимость параметра подвижности а.о. от частоты мутации при эволюции из белка предшественника. Рассчитанный коэффициент корреляции лег в основу метода Frommel G. [130].
Компьютерный анализ аминокислотной последова тельности белка Е2 вируса КЧС штамма ЛК ВНИИВВиМ
Обобщая результаты теоретического анализа первичной структуры белка Е2 вируса КЧС изучаемого штамма следует отметить, что самыми гидрофильными должны быть фрагменты 3-15 и 86-99 (табл. 4). Эти же участки обладают выраженной сегментной подвижностью (табл. 5). Меньший коэффициент гидрофильности показан для фрагментов 22-39, 56-76 и 266-271. Анализ гидрофобности по методу Eisenberg D. et al. [120] позволил сделать предположение о наибольшей вероятности образования амфипатичных спиралей двух участков, представленных 21 а.о. Это 117-137 и 342-362. Причем первый из них охарактеризован по своей пространственной структуре как трансмембранный, а второй - как глобулярный. На основе метода Rao M.J.К. и Argos Р. [196] были получены данные, подтверждающие наличие трансмембранной спирали в С-концевой (339-374 а.о.) и центральной (117-142 а.о.) частях молекулы белка Е2. Важным показателем при идентификации Т-эпитопов в первичной структуре белка является величина угла 100±20, указывающая на наличие а-спиральной структуры. Высокие коэффициенты амфипатичности были определены для фрагментов 55-64 и 84-99 (шкала Kyte J., Doolittle R.F. [161]). Использование шкалы консенсус [120] с окном сканирования 11 а.о. позволило идентифицировать два амфипатичных фрагмента: 78-88 и 148-158. В таблице 6 представлены участки аминокислотной последовательности белка Е2, потенциально обладающие свойствами В- клеточных эпитопов. Анализ антигенности с использованием двух шкал [155] и [226] не позволил более точно локализовать антигензначимые фрагменты.
Предсказание вторичной структуры исследуемого белка проводилось на основе метода Шестопалова Б.В. [87] и Garnier J. et al. [132], что позволило выявить участки а-спиральной структуры: 1-15, 103-110 и 350-357 (рис. 4). Таким образом, результаты теоретического анализа первичной структуры иммуногенного белка Е2 вируса КЧС штамма ЛК ВНИИВВиМ позволяют выделить в N-концевой области участки, обладающие свойствами потенциальных В- и Т- клеточных эпитопов. Полученные данные послужили основанием для синтеза пептидов из области домена А (76-176 а.о.) и домена В/С (1-110 а.о.). С целью выявления потенциальных антигенных детерминант прионного белка КРС Рыбаков С.С. и др. [69] провели компьютерный анализ первичной последовательности РгРс, представленной на рисунке 6. Согласно расчетам профилей антигенности [226], гидрофильности [148], подвижности [152] и амфипатичности [161] антигенными детерминантами являются участки 25-30, 110-120, 154-159 и 205-223 [69]. На основании полученных данных и результатах опубликованных в литературе исследований фрагмент 106-126 РгРс КРС был выбран в качестве кандидата для синтеза.
Антигенные свойства свободных пептидов -фрагментов белка Е2 вируса КЧС и их смесей. Иммуногенные свойства конъюгатов пептидов с белками-носителями, смесей и МАР-конструкции
Первоначально, в иммунологических исследованиях необходимо было определить антигенную активность синтетических пептидов, то есть их способность образовывать специфичные комплексы с антителами гипериммунной сыворотки, полученной в результате иммунизации серонегативных подсвинков вирусом КЧС штамма ЛК ВНИИВВиМ. С этой целью использовали метод н-ИФА. На полистироловый 96-луночный планшет наносили раствор антигена, начиная с разведения 1:5 и далее с шагом 2 (исходная концентрация - 1 мг/мл) в КББ, рН 9,5 - 9,6, при постоянном разведении вирусспецифичной сыворотки 1:100. Реакцию проводили, как описано в разделе 3.1. Материалы и методы. Антигенную активность выражали через десятичный логарифм (lg) величины обратного разведения раствора антигена, при котором оптическая плотность комплекса с антителами более чем в 2 раза превышала оптическую плотность неспецифичных комплексов. В качестве положительного контроля в реакции использовали культуральный вирус КЧС штамма ЛК ВНИИВВиМ. Представленные в таблице 9 данные показывают, что все свободные пептиды образуют специфичные комплексы с антителами гипериммунной сыворотки, выявляемые в реакции н-ИФА. Наибольшей антигенной активностью обладали пептиды 119-129, 155-168 - 3,9 lg, 139-151, 147-160 -3,4 lg. Изучение антигенной активности смесей показало, что все они, также как и пептиды, образуют специфичные комплексы с антителами гипериммунной сыворотки (табл. 9). Наибольшую антигенную активность проявили смеси VI, IX - 4,0 lg, V, X - 3,9 lg, I, VIII - 3,7 lg, III (3,6 lg), VII (3,5 lg). На следующем этапе исследований изучали иммуногенную активность синтезированных пептидов. Результат оценивали по способности искусственных антигенов индуцировать образование АПА.
Некоторыми авторами показано, что не всегда антитела, полученные в результате иммунизации животных синтетическими пептидами, реагировали с антигенными детерминантами в составе целого белка или вириона [75, 108]. При этом наибольший интерес представляют только те АПА, которые имеют высокую аффинность к вирусу, то есть обладают свойствами ABA [2,125]. Так как короткие пептиды в свободном виде имеют слабую иммуногенную активность, они были конъюгированы с природными белковыми носителями - KLH и BSA. С целью повышения иммуногенной активности фрагмента 148-164 белка Е2 вируса КЧС была получена МАР-конструкция, содержащая 8 копий указанного фрагмента и лизиновую матрицу. Иммуногенность пептидов 151-164 и 155-164 не изучали, поскольку они имели слабую антигенную активность (табл. 9) и низкий выход при синтезе. Иммуногенность конъюгатов синтетических пептидов с указанными белковыми носителями, смесей и МАР-конструкции проверяли на лабораторных животных. Кролики массой 2,0-2,5 кг были иммунизированы трижды искусственными антигенами. Доза для каждой иммунизации была равна 400 мкг на кролика. Материал вводили подкожно в 4 точки спины. Для первой иммунизации препарат готовили путем смешивания равных объемов ПАФ и раствора синтетического антигена в ФБР, рН 7,2-7,6.
Вторую и третью иммунизацию проводили на 28 и 56 день после первого введения по аналогичной методике с заменой ПАФ на НАФ. Общий объем инъекционного препарата составлял от 0,8 до 1 мл на животное. Отбор крови проводили через каждые две недели в течение 84 дней. В качестве примера на рисунке 10 приведена динамика накопления АПА, полученных в результате 3-х кратной иммунизации лабораторных животных синтетическими антигенами. Титр в lg Титр АПА, который определяли в н-ИФА, резко возрастал в течение первых 14 дней после первой иммунизации (рис. 10). Затем наблюдалось постепенное их накопление для смесей I и III. Незначительное снижение уровня АПА отмечено для смеси II на 14-42 день после первого введения антигена, однако проведение второй и третьей иммунизации стимулировало образование пептидспецифичных антител, титр которых к концу опыта достиг значения 3,9 lg. Анализ проб сыворотки крови кроликов методом н-ИФА показал, что практически все исследуемые антигены стимулировали образование антител (табл. 10). Значения титра АПА и ABA, приведенные в таблице 10, выражены через десятичный логарифм величины обратного разведения анализируемых проб сыворотки крови кроликов. Количество антигена было постоянным и составляло 5 мкг пептида или 1 мкг вируса на лунку. Результаты показали, что диапазон значений титра АПА соствлял 2,4 - 4,7 Ig. В группу наиболее активных иммуногенов вошли пептиды 139-151 (4,7 Ig), 129-139 (4,5 Ig), 89-102, 105-122, 119-129-4,2 Ig, 167-180 (4,0 Ig) и смеси IX (4,2 Ig), III (4,0 Ig), II и X- 3.9 Ig. Самыми слабыми иммуногенами оказались пептиды 78-91 и 155-168 - 09 3,3 Ig, а также смеси IV и VII - 2,4 Ig. МАР-конструкция, содержащая 8 копий фрагмента 148-164 белка Е2 вируса КЧС, оказалась слабоиммуногенной (3,0 Ig).
