Введение к работе
з Актуальность проблемы. Перспективным направлением разработки эффективных вакцин против инфекционных заболеваний является создание вирусных или бактериальных рекомбинантных векторов, осуществляющих доставку в организм протективных антигенов, с которыми связано формирование профилактического или лечебного эффекта вакцинации (Moorthy V S et al, 2003, RochaCD etal,2004)
С развитием методов обратной генетики появилась уникальная возможность использовать в качестве вектора модифицированную интраназальную гриппозную вакцину (Fodor Е et al, 1999, Neumann G et al, 1999) К преимуществам гриппозных векторов можно отнести 1) отсутствие ДНК стадии в репликативном цикле вируса, исключающей хромосомную интеграцию вирусного генома (Lamb RA and Krug RM, 2001), 2) формирование выраженного клеточного и гуморального иммунного ответа на системном уровне и во входных воротах инфекции (Alexandrova G I et al, 1984, Rudenko LG et al, 1993, Cox RJ et al, 2004), 3) существование множества антигенных подтипов вируса гриппа, что дает возможность проводить повторные иммунизации для достижения максимального профилактического или лечебного эффекта (стратегия инициация—^усиление, «prime-boost»), 4) доказанную безопасность живых гриппозных вакцин (Alexandrova G I et al, 1986, Romanova J et al, 2004)
Одной из перспективных для генетических манипуляций мишеней при конструировании гриппозных векторов является неструктурный NS1 белок вируса гриппа, который в ходе естественной гриппозной инфекции в больших количествах синтезируется в зараженных клетках и вызывает выраженный антительный и Т-клеточный иммунный ответ (Birch-Machin I et al, 1997) В работах последних лет бьша показана высокая толерантность NS гена вируса гриппа к вставкам протяженных чужеродных нуклеотидных последовательностей в рамке считывания NS1 белка (Ferko В et al, 2001) При этом за счет нарушения основной функции полноразмерного NS1 белка как антагониста системы интерферонов I типа, подобные штаммы теряют способность к полноценной репликации в организме хозяина, что обеспечивает безопасность их использования в качестве вакцинных препаратов (Egorov A et al, 1998) В то же время в зоне вирусной репликации происходит выработка большого количества цитокинов, которые способствуют поляризации иммунного ответа в сторону Тх-1 звена (Stasakova J et al, 2005)
Иммунологические свойства конструкций подобного типа, а также возможность их интраназального введения определяют перспективы использования гриппозных векторов для защиты от воздушно-капельных инфекций, в контроле которых решающую роль играет развитие полноценного Тх-1 иммунного ответа, например, при туберкулезе, который является одной из основных причин смерти от инфекционных заболеваний (Левашев ЮН и др , 2005) Необходимость разработки альтернативных подходов к профилактике и лечению туберкулеза связана с недостаточной эффективностью вакцины БЦЖ в контроле над детской заболеваемостью, реактивацией латентных очагов эндогенной инфекции и экзогенной реинфекции у взрослых, а также крайне высоким уровнем лекарственной устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам (Король О И, 2003, Медуницын Н В , 2005)
Значительный интерес с точки зрения разработки новых вакцинных кандидатов представляют белки культурального фильтрата микобактерий туберкулеза, в семейство которых входит ранний секреторный антиген ESAT-6 (Early Secreted Antigen Target, 6 кДа) (Andersen P et al, 1994) Данный белок кодируется RD1 геномной областью микобактерий, утраченной в процессе длительного культивирования в вакцинном штамме БЦЖ, и является иммунодоминантной мишенью для клеточного иммунного ответа как на ранней стадии туберкулезной инфекции у человека, так и в различных моделях экспериментального туберкулеза у животных (Brodin Р et al, 2004)
Результаты доклинических исследований протективных свойств ESAT-6 антигена М tuberculosis в виде пептидных и ДНК вакцин (Kamath AT et al, 1999, Brandt L et al, 2000), а также в составе бактериальных векторов на основе БЦЖ (Рут AS et al, 2003) и Salmonella typhimurmm (Mollenkopf H J et al, 2001) показали, что вследствие недостаточной иммуногенности ESAT-6 белка формирование защитного эффекта иммунизации определяется способом его введения и доставки в организм Использование в качестве вектора модифицированной интраназальной гриппозной вакцины является новым подходом к разработке противотуберкулезных вакцин
Цель исследования. Получение аттенуированных рекомбинантных штаммов вируса гриппа А, экспрессирующих ранний секреторный микобактериальный антиген ESAT-6, и оценка их профилактической и терапевтической эффективности при интраназальном введении на модели экспериментальной туберкулезной инфекции
Задачи исследования
1 С помощью методов обратной генетики получить рекомбинантные штаммы
вируса гриппа А различных антигенных подтипов, экспрессирующие
микобактериальный антиген ESAT-6 с открытой рамки считывания NS1 белка
-
Охарактеризовать свойства рекомбинантных гриппозных векторов по следующим параметрам экспрессия туберкулезного ESAT-6 белка, репродуктивность в клеточных культурах, генетическая стабильность и безвредность для животных
-
Определить иммуногенные свойства полученных векторов по индукции клеточного CD4+ Тх-1 иммунного ответа и выработке антител к туберкулезному антигену у мышей
-
Провести сравнительную оценку протективных свойств гриппозных векторов и вакцины БЦЖ для профилактики эксперименальной туберкулезной инфекции
-
Оценить терапевтическую эффективность гриппозных векторов в сочетании с этиотропной терапией у мышей с экспериментальной туберкулезной инфекцией
Научная новизна работы. С помощью методов обратной генетики сконструированы модифицированные по гену NS рекомбинантные аттенуированные штаммы вируса гриппа А, экспрессирующие микобактериальный антиген ESAT-6 Установлено, что полученные штаммы являются эффективными векторами для доставки туберкулезного антигена в организм иммунизируемых животных Проведено исследование протективных свойств гриппозных векторов на моделях экспериментальной туберкулезной инфекции Установлено, что двукратная интраназальная иммунизация животных гриппозными векторами различных антигенных подтипов обеспечивает защиту от инфекции, по ряду показателей превышающую профилактическое действие вакцины БЦЖ Показана возможность повышения эффективности этиотропной терапии туберкулеза у мышей при введении в схему лечения иммунизации рекомбинантными гриппозными векторами
Практическая значимость работы. Использование в качестве интраназальной вакцины векторной системы на основе рекомбинантного аттенуированного вируса гриппа, экспрессирующего ранний секреторный микобактериальный антиген ESAT-6, может служить перспективным подходом в решении задач
разработки нового поколения противотуберкулезных вакцин и повышения эффективности комплексной терапии туберкулеза
Основные положения, выносимые на защиту
-
Генетически стабильные гриппозные векторы трех антигенных подтипов способны обеспечивать экспрессию раннего секреторного антигена ESAT-6 М tuberculosis с открытой рамки считывания NS1 белка
-
Рекомбинантные штаммы вирусов гриппа с инсерцией гена ESAT-6 не утрачивают репродуктивной активности и обладают при этом аттенуированным фенотипом при интраназальном введении животным
-
Двукратная интраназальная иммунизация животных приводит к индукции системного CD4+ Тх-1 иммунного ответа к ESAT-6 белку и формированию протективного противотуберкулезного иммунитета у мышей и морских свинок
-
Комбинированное применение иммунизации рекомбинантными гриппозными векторами с этиотропной антибиотикотерапией повышает эффективность лечения туберкулезной инфекции у мышей
Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации доложены на VIII Всероссийском научном форуме с международным участием им акад В И Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2004), на I международной конференции "Influenza Vaccines for the World " (Лиссабон, 2004), на 14-м Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2004), на международной научно-практической конференции «International Workshop on Tuberculosis Vaccines» (Куба, 2005), на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностики и лечения туберкулеза» (Санкт-Петербург, 2005), на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы туберкулеза и болезней легких» (Москва, 2006), на международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней» (Минск, 2007), на юбилейной конференции с международным участием, посвященной 40-летию института гриппа РАМН (Санкт-Петербург, 2007) Получено положительное решение по заявке на получение патента (per № 2005129049) По результатам исследования опубликовано 11 научных работ
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах текста, включающего 8 таблиц и 30 рисунков, и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 3-х глав результатов
7 исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Список литературы содержит 178 источников на русском и английском языках
