Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время в медико-биологических исследованиях широко используется метод лазерно-индуцированной флуоресценции (ЛИФ). В его основе лежит известное свойство белков и входящих в их состав аминокислот люминесцировать под воздействием ультрафиолетового (УФ) излучения, что позволяет определять их структуру, состав, состояние, динамические характеристики [Маслов Н.А., 2004]. Метод ЛИФ может быть применен в диагностике большого числа заболеваний. В частности, по изменению спектра люминесценции удается идентифицировать ткани, пораженные раком, отличить нормальную аорту от пораженной атеросклерозом [Huang Z., 2004; Majumder S.K., 2003; Hage R. et al., 2003]. Постепенно лазерные методы диагностики заменяют многие инвазивные методы, в том числе метод биопсии, достаточно дорогостоящий хроматографический метод, а также метод высоковольтного диэлектрофореза, с помощью которого не всегда получают адекватные результаты.
Для диагностики чаще используется ультрафиолетовое
излучение с длиной волны (к) более 300 нм. Однако использование
коротковолнового излучения, например Х=248 нм, позволяет получать
как более интенсивное возбуждение флуоресценции, так и спектры
флуоресценции, специфичные для каждого вида тканей. Показана
возможность применения метода ЛИФ, возбуждаемого KrF эксимерным
лазером (Х=24$нм) в диагностике остеопороза [Петренко П.П., 2004], в
определении жизнеспособности органов трансплантатов,
использующихся в кардиохирургии [Потапенко М.М., 2006], в оценке изменений структуры клапаносодержащего фрагмента аорты на этапах его подготовки для трансплантации [Субботин Д. В., 2006]. Между тем, эффективность и безопасность метода, перспективность его использования для диагностики других патологических состояний изучены недостаточно.
Известно, что воздействие УФ излучения небезопасно и может приводить к различным повреждениям на органном, тканевом и клеточном уровне [Ларионов П.М., 2000]. Результаты исследований последних лет свидетельствуют о том, что потомки клеток, подвергнутых воздействию УФ излучения, характеризуются нестабильностью генома [Пелевина И.И. и др., 1994; 1996]. Однако до сих пор эффекты воздействия коротковолнового (А.=248 нм) лазерного излучения на биологические объекты мало изучены.
Таким образом, интерес к анализу механизмов взаимодействия УФ излучения с биологическими объектами, оценке эффективности и безопасности применения метода ЛИФ для диагностики состояния тканей и органов продиктован запросами практической и теоретической медицины. Проведение исследований на культивируемых клетках млекопитающих, полученных из разных тканей и органов, выращиваемых in vitro, позволяет ускорить и удешевить исследования взаимодействия УФ излучения с биологическими объектами.
Цель работы - изучение эффективности и безопасности метода лазерно-индуцированной флуоресценции, возбуждаемой эксимерным лазером, на модельной системе культивируемых клеток.
Задачи исследования:
1. Создать биологические модельные системы in vitro пригодные
для изучения эффективности и безопасности метода ЛИФ: определить
оптимальные условия получения первичных культур клеток сердца
свиньи, получить суспензии перевиваемых культур клеток разного
уровня жизнеспособности.
2. Получить спектры ЛИФ первичных, диплоидных и
перевиваемых культур клеток, находящихся в разных состояниях
жизнеспособности.
3. Оценить диагностическую эффективность применения метода
ЛИФ с использованием излучения коротковолнового эксимерного лазера
для оценки состояния клеточных культур с разной жизнеспособностью.
4. Определить параметры коротковолнового лазерного
излучения, оптимальные для диагностики состояния клеточных культур
и вызывающие в них минимальные изменения.
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые получены спектры ЛИФ первичных, диплоидных и перевиваемых культур клеток. Показано, что спектры флуоресценции специфичны для каждого вида клеток, спектры ЛИФ клеток с различной жизнеспособности несут диагностическую информацию.
Впервые изучены эффекты воздействия УФ излучения, возбуждаемого KrF эксимерным лазером, на клеточные культуры. Установлено дозозависимое влияние излучения эксимерного KrF лазера на культуральные и морфологические, пролиферативные и цитогенетические свойства диплоидных фибробластов.
Впервые для метода лазерно-индуцированной флуоресценции, возбуждаемой KrF эксимерным лазером (^=248 нм), определен диапазон доз (0,05-0,10 Дж/см2), позволяющий проводить многократные измерения спектров ЛИФ с целью получения достоверной
диагностической информации, и не приводящий к необратимым изменениям морфологических, функциональных, репродуктивных свойств клеток.
Проведенные исследования доказали эффективность и перспективность применения метода лазерно-индуцированной флуоресценции, возбуждаемой эксимерными лазерами, для диагностики состояния биологических объектов. Определенные в работе безопасные дозы излучения KrF эксимерного лазера (А.=248 нм) делают возможным использование метода лазерно-индуцированной флуоресценции для оценки состояния биологических объектов.
Основные положения, выносимые на защиту:
Разработанные модельные системы in vitro культур клеток с различной жизнеспособностью пригодны для изучения эффективности и безопасности метода ЛИФ.
Спектры ЛИФ культур клеток позволяют идентифицировать первичные, диплоидные и перевиваемые культуры клеток с различной жизнеспособностью.
Лазерное излучение KrF эксимерного лазера в дозах выше 0,1 Дж/см2 не безопасно для культур клеток. Излучение влияет на культуральные, морфологические, пролиферативные, цитогенетические свойства клеток.
Влияние лазерного излучения носит дозозависимый характер - скорость спектральных изменений зависит от интенсивности излучения.
Излучение KrF эксимерного лазера в дозе 0,05-0,1 Дж/см2 не приводит к изменению спектров ЛИФ, не влияет на морфологические, культуральные и пролиферативные свойства клеток, не приводит к необратимым изменениям в клетках на ультраструктурном, биохимическом, цитогенетическом уровнях.
Внедрение результатов
Полученные результаты исследования используются в лаборатории экспериментальной хирургии и морфологии Новосибирского научно-исследовательского института патологии кровообращения, в Институте Теоретической и Прикладной механики Сибирского Отделения Российской Академии Наук, при чтении лекций по медицинской экологии в Новосибирском Государственном Медицинском Университете.
Апробация результатов исследования. Основные положения диссертации доложены на II Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), на
XII Международной конференции по методам аэрофизических исследований «ICMAR-2004» (Новосибирск, 2004), на XII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, 2004), на международной конференции по биохимии «International Conference on Chemical Biology» (Новосибирск, 2005), на Международном Междисциплинарном Симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, 2005), на научно-практической конференции «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий» (Новосибирск 2005), на ежегодном конкурсе-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна-2004», «Авиценна-2005», «Авиценна-2006» (Новосибирск, 2004; 2005; 2006). По теме диссертации опубликовано 10 тезисов и 3 статьи.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты исследований и их обсуждение», «Выводы». Работа изложена на 149 страницах, содержит 46 рисунков и 9 таблиц.
