Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Ботаническая характеристика семейства Boraginaceae (бурачниковые) 10
1.2. Фитохимическая характеристика семейства Boraginaceae 10
1.3. Фармакологические свойства метаболитов кофейной кислоты 13
1.4. Биосинтез розмариновой кислоты и ее производных 16
1.5. Цитохром Р450-зависимые монооксигеназы растений 23
1.6. Влияние гена rolC на трансформированные клетки растений 26
1.7. Влияние элиситоров на продукцию вторичных метаболитов в клетках растений 30
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 32
2.1. Объект исследования 32
2.2. Бактерии и плазмиды 32
2.3. Культивирование бактериальных штаммов 33
2.4. Питательные среды 34
2.5. Получение клеточных культур Е. sericeum 35
2.5.1. Получение контрольных и го/С-трансгенных культур Е. sericeum 35
2.5.2. Получение культуры трансгенных корней Е. sericeum 36
2.5.3. Получение клеточной линии Е-4 36
2.5.4. Динамика роста каллусных культур Е. sericeum и накопления ими полифенолов 36
2.6. Эксперименты с активаторами биосинтеза полифенолов. 37
2.7. Выделение плазмидной ДНК 37
2.8. Доказательство трансгенности и экспрессия генов 38
2.8.1. Выделение растительной ДНК 38
2.8.2. Полимеразная цепная реакция на препаратах ДНК 39
2.8.3. Выделение тотальной растительной РНК 39
2.8.4. Реакция обратной транскрипции 40
2.8.5. Полимеразная цепная реакция на препаратах кДНК 41
2.8.6. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (Real-time PCR) 43
2.9. Секвенирование ДНК и кДНК 44
2.10. Определение содержания полифенолов в культурах клеток Е. sericeum 45
2.11. Исследование фармакологической активности метаболитов кофейной кислоты из каллусной культуры Е. sericeum 46
2.11.1. Влияние препаратов из клеточной культуры Е. sericeum на функцию почек у крыс 47
2.11.2. Влияние препаратов из клеточной культуры Е. sericeum на течение экспериментального острого воспаления 47
2.11.3. Влияние препаратов из клеточной культуры Е. sericeum на процессы свободно-радикального окисления 48
2.12 Статистическая обработка результатов 49
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 50
3.1. Характеристика клеточных культур Е. sericeum 50
3.1.1. Клеточные культуры Е. sericeum 50
3.1.2. Доказательство трансгенности культур Е. sericeum 52
3.1.3. Доказательство экспрессии гена rolC в го/С-трансгенных культурах Е. sericeum 53
3.2. Накопление полифенолов в культуре клеток Е. sericeum 55
3.2.1. Содержание метаболитов кофейной кислоты в культурах корней и каллусов Е. sericeum 55
3.2.2. Получение высокопродуктивной каллусной культуры Е. sericeum методом селекции 58
3.2.3. Влияние метилжасмоната и глицерата меди на продукцию метаболитов кофейной кислоты в культуре клеток Е. sericeum 62
3.3. Изменение содержания метаболитов кофейной кислоты при длительном культивировании каллусов 64
3.4. Дифференциальная активация транскрипции специфических изоформ генов вторичного метаболизма под действием гена rolC 66
3.4.1. Экспрессия генов PAL 66
3.4.2. Экспрессия генов CYP 68
3.5. Фармакологические свойства препарата из клеточной культуры Е. sericeum и возможность ее применения в медицине 74
3.5.1. Стабильность рабдозина и розмариновой кислоты в процессе сушки каллусов 74
3.5.2. Влияние препарата из клеточной культуры Е. sericeum на функцию почек у крыс 76
3.5.3. Влияние метаболитов кофейной кислоты из клеточной культуры Е. sericeum на течение экспериментального острого воспаления 79
3.5.4. Влияние препарата из клеточной культуры Е. sericeum на процессы свободно-радикального окисления 81
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 86
ВЫВОДЫ 89
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 90
- Фитохимическая характеристика семейства Boraginaceae
- Бактерии и плазмиды
- Клеточные культуры Е. sericeum
Введение к работе
Одним из перспективных направлений биотехнологии растительной клетки является получение вторичных метаболитов для фармацевтической промышленности. Это подход получает распространение в нашей стране и мире, поскольку создает воспроизводимый источник сырья для получения биологически активных веществ. Биотехнологическое получение вторичных метаболитов основано на том, что клеточные культуры растений сохраняют свойство целого растения синтезировать и накапливать эти вещества. Клетки растений можно выращивать неопределенно долго (каллусы женьшеня растут в культуре in vitro уже более 50 лет), состав сред для них относительно прост, путем различных манипуляций часто удается повысить содержание вторичных метаболитов. Кроме того, система растительной клетки in vitro - это удобная модель для изучения вторичного метаболизма клетки, поскольку исследователь может управлять ее функционированием через изменение условий культивирования или экспрессии генов.
В настоящее время растет спрос на лекарственные препараты природного происхождения (Dixon and Sumner, 2003). Экстракты лекарственных растений широко применяют в медицине, парфюмерии и пищевой промышленности (Ullah and Khan., 2008). Активно изучаются антиоксидантные и противовоспалительные свойства растительных полифенолов, в том числе метаболитов кофейной кислоты (Ivanauskas et al., 2008; Ueda et al., 2002). Известно, что полифенолы растений перспективны для профилактики и лечения заболеваний почек, связанных с нефритом. Так, при лечении диабетической нефропатии применяются метаболиты кофейной кислоты: розмариновая кислота и литоспермовая кислота Б (Makino et al., 2002), содержащиеся в растениях семейства Boraginaceae.
На Дальнем Востоке это семейство представлено несколькими видами, в том числе незабуд очником шелковистым {Eritrichium sericeum Lehm. DC.) и воробейником краснокорневым (Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc). Эти виды растений являются редкими и их промышленное использование невозможно. Поэтому разработка новых лекарственных средств на основе клеточных культур этих растений является перспективной задачей для биотехнологии.
Современная биотехнология растений широко использует методы генетической инженерии. Так, например, в последние годы выявлены гены,
7 оказывающие существенное влияние на продукцию вторичных метаболитов в культурах клеток растений, в том числе гены rol Agrobacterhim rhizogenes. В большинстве случаев эти гены активируют биосинтетическую способность культур, однако также известны случаи ингибирования (Bulgakov, 2008). К сожалению, информация о механизме действия продуктов этих генов на вторичный метаболизм очень ограничена. Влияние генов rol на биосинтез вторичных метаболитов фенилпропаноидного пути ранее не исследовалось. В настоящей работе приведена сравнительная характеристика продукции метаболитов кофейной кислоты в обычной и го/С-трансгенной культурах клеток Е. sericeum.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение биосинтеза метаболитов кофейной кислоты в культурах клеток незабудочника шелковистого и получение продуктивной клеточной линии.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
Получить контрольную и экспрессирующую ген rolC культуры клеток Е. sericeum.
Увеличить выход метаболитов кофейной кислоты в культуре клеток Е. sericeum посредством селекции и воздействия элиситоров.
Исследовать связь между экспрессией гена rolC и экспрессией некоторых ключевых генов биосинтеза метаболитов кофейной кислоты.
Исследовать фармакологическое действие полифенолов из культуры клеток Е. sericeum.
Основные положения, выносимые на защиту.
Высокопродуктивная культура клеток Е. sericeum (линия Е-4) накапливает метаболиты кофейной кислоты в количестве до 6% от сухой массы ткани.
Экспрессия гена rolC в клетках Е. sericeum приводит к активации биосинтеза метаболитов кофейной кислоты в длительно-пассируемых культурах и увеличению продуктивности культуры.
Ген rolC вызывает активацию экспрессии специфической формы гена CYP98 (CYP98A3), ответственной за биосинтез розмариновой кислоты.
Полифенолы культуры клеток Е. sericeum обладают выраженным антиоксидантным и противовоспалительным действием.
Научная новизна. Показано, что клеточные культуры незабудочника шелковистого синтезируют метаболиты кофейной кислоты в больших количествах, многократно превышающих содержание этих веществ в природных растениях. Установлена зависимость действия гена rolC на продукцию метаболитов кофейной кислоты от времени культивирования каллусов - с возрастанием числа пассажей ген проявляет активирующее действие на вторичный метаболизм. В культурах клеток незабудочника шелковистого обнаружен ген CYP98A3, кодирующий специфическую форму цитохром Р450-зависимой монооксигеназы, вовлеченную в биосинтез розмариновой кислоты. Установлена взаимосвязь экспрессии CYP98A3 с экспрессией гена rolC и повышением содержания метаболитов кофейной кислоты в rolC-трансгенной культуре клеток.
Практическая значимость. Получена клеточная культура незабудочника шелковистого, которая является воспроизводимым источником метаболитов кофейной кислоты. Максимальное содержание рабдозина в ней составляет 4.11% от сухого веса ткани, что является самым высоким содержанием этого вещества в природных и биотехнологических источниках. Показано, что полифенолы из культуры клеток незабудочника шелковистого обладают выраженным антиоксидантным действием, снижают симптомы при остром воспалении, что делает их перспективными для углубленного фармакологического изучения с целью создания в дальнейшем медицинских препаратов.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на конференции молодых ученых Биолого-почвенного института ДВО РАН (2006), II Международном конгрессе по молекулярному размножению растений (2nd International Conference on Plant Molecular Breeding) (КНР, Санья, 2007), 21-м Тихоокеанском научном конгрессе (21st Pacific Science Congress) (Япония, Окинава, 2007), Международной конференции по биоинформатике (International Multi-conference of Engineers and Computer Scientists) (Гонконг, 2008), 13-м Международном симпозиуме по биотехнологии "13th International Biotechnology Symposium (IBS-2008)" (КНР, Далянь, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 98 страницах, иллюстрирована 19 рисунками и содержит 12 таблиц. Список литературы содержит 90 наименований.
Работа выполнена в группе биоинженерии Биолого-почвенного института ДВО РАН. Химический анализ полифенолов Е. sericeum проводился совместно с сотрудниками лаборатории химии природных хиноидных соединений Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН. Фармакологические исследования биомассы клеток Е. sericeum выполнялись совместно с сотрудниками Алтайского государственного медицинского университета (Барнаул).
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" (2002-2006 гг), "Научные школы" НШ-6923.2006.4., Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология" и РФФИ/ДВО 06-04-96008.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю В.П. Булгакову за внимательное и конструктивное руководство, благодарность сотрудникам группы биоинженерии К.В. Киселеву за помощь в освоении методик молекулярной биологии и руководство при выполнении генетической части настоящей работы, Г.К. Чернодед за помощь в работе с культурами клеток, Ю.Н. Шкрыль за методическую помощь. Автор выражает благодарность сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН С.А. Федорееву и М.В. Веселовой за сотрудничество и помощь в определении качественного и количественного состава полифенолов культур клеток и корней Е. sericeum, а так же коллегам из Алтайского государственного медицинского университета под руководством проф. Зверева Я.Ф за выполнение фармакологических исследований.
Ботаническая характеристика семейства Boraginaceae (бурачниковые)
Являясь продуцентами вторичных метаболитов, растения семейства Boraginaceae синтезируют и накапливают ряд полезных химических веществ. Благодаря этой способности бурачниковые издавна находили широкое применение в медицине Китая, Японии, Кореи, а также русской народной медицине. Такие растения, как липучка ежевидная (Lappula echinata Gilib.), воробейник краснокорневой (L. erythrorhizori) и другие широко используются в восточной народной медицине для лечения ожогов, отморожений, мокнущей экземы, волдырей, язв, опухолей и ран (Ибрагимов и Ибрагимова, 1960). Препараты из корней L. erythrorhizon рекомендованы как противозачаточное, жаропонижающее, мочегонное, кровоочистительное, противогриппозное, слабительное средство; они также являются профилактическим средством при кори и противоядием (Федореев, 1980).
Широкое применение растений семейства бурачниковые в народной медицине послужило причиной для начала изучения их биохимического состава. На сегодняшний день известно, что растения данного семейства активно синтезируют и накапливают вещества хиноидной структуры, обладающие весьма широким спектром физиологического действия: антибиотическим, антикоагулянтным, регенерирующим и противоопухолевым (Driscoll et al., 1974). В Японии из растений семейства Boraginaceae изготавливают лекарство "шиунко", эффективно используемое для лечения различных кожных заболеваний. В настоящее время эфиры алканина и шиконина в составе различных мазей эффективно применяются при лечении варикозных ран и язв стопы человека (Федореев, 1980).
Хиноны также широко используют для крашения синтетических и натуральных волокон. Начало использования природных хинонов в качестве красителей относится к древним временам. В Европе для получения красителя использовалось растение алканна красильная {Alkanna tinctoria L. Tausch.), на Дальнем Востоке, в странах Азиатского региона - макротомия красящая (Arnebia euchroma (Royle.) Johnst) и L. erythrorhizon (Федореев, 1980).
Помимо веществ хиноидной природы, в растениях семейства бурачниковые отмечено высокое содержание и других полифенолов. В настоящее время возрос интерес к представителям этого семейства как растениям-продуцентам веществ группы полифенолов (Petersen and Simmonds, 2003; Yamamoto et al., 2000a). Полифенолы проявляют противовоспалительную активность (Ueda et al., 2002), являются сильными антиоксидантами (Kapiszewska et al., 2005). Наибольший интерес представляют метаболиты кофейной кислоты (МКК), такие как розмариновая кислота (РК), содержащая два остатка кофейной кислоты, и тетрамеры кофейной кислоты: литоспермовая кислота, литоспермовая кислота Б, (-)-рабдозин, (+)-рабдозин (рис. 1). Недавно из культуры клеток Е. sericeum впервые было выделено и охарактеризовано новое вещество, тример кофейной кислоты, получившее название эритрихин, (2R)-3-(3,4-дигидроксифенил)-2- {[4-(3,4-дигидроксифенил)-6,7-дигидрокси-2-нафтоил]окси} пропановая кислота (С26Н21О10), однако содержание его в клетках очень невелико (Fedoreyev et al., 2005).
Бактерии и плазмиды
Для трансгенного переноса использовали бактерию Agrobacterium tumefaciens GV3101, несущую бинарную векторную систему, состоящую из двух плазмид (рис. 6):
1. Плазмида pPCV002 содержит в составе Т-ДНК ген устойчивости к канамицину - nptll (неомицин-фосфотрансфераза) под контролем промотора и терминатора генов опинового биосинтеза (pNos и pACos), полилинкер, в один из сайтов которого клонирован ген rolC под регуляцией 35S промотора вируса мозаики цветной капусты (CaMV) и нопалин-синтазного (Nos) терминатора. Т-ДНК фланкирована 25 п.н. повторами (BR и BL). Кроме того, плазмида содержит точку начала репликации (ori) и селективный маркер устойчивости к ампициллину.
2. Vir-хелперная плазмида pMP90RK, кодирует vir-белки (А, В, G, С, D, Е), осуществляющие перенос и интеграцию Т-ДНК в хромосому растительной клетки. Плазмида содержит маркер устойчивости к гентамицину и последовательность, обеспечивающую репликацию.
В работе были использованы бактериальные штаммы A. tumefaciens GV3101/pMP90RK с плазмидами: 1) pPCV002, которая представляет собой пустую (векторную) плазмиду, не содержащую целевой ген rolC, была использована для получения контрольной культуры Е, sericeum и 2) pPCV002-35S-ro/C, плазмида, содержащая ген rolC). Все плазмиды были любезно предоставлены профессором.
Клеточные культуры Е. sericeum
Первичные каллусы Es-vector (из которых нами в дальнейшем получена линия Е-4, глава 3.2.2) и Es-rolC были получены в 2003 году из проростков семян Е. sericeum (Bulgakov et al., 2005) методом трансформации. Для получения стабильных гомогенных культур первичные каллусы культивировали в течение продолжительного времени в присутствии канамицина, отбирали активно-растущие канамицин-устойчивые агрегаты. В итоге последовательных субкультивирований были получены гомогенные каллусные культуры: контрольная культура Es-vector (трансформированная векторной плазмидой pPCV002) и культура Es-rolC (трансформированная конструкцией pPCV002-35S-ro/C). Таким образом, ген rolC экспрессировался с сильного вирусного промотора 35S. Каллусная культура Es-vector характеризовалась активным ростом и представляла собой рыхлую, коричнево-серую каллусную ткань, окрашивающую питательную среду в коричневый цвет. Прирост ткани составлял в среднем 491 ±43 г/л. Трансгенная ткань Es-rolC характеризовалась замедленным ростом по сравнению с контрольной культурой и представляла собой более рыхлую, обводненную каллусную ткань коричнево-желтого цвета, прирост составлял 283 ± 53 г/л. В течение нескольких лет ro/C-трансгенная ткань была гетерогенной, проявляла нестабильность морфологических свойств и ростовых характеристик (рис. 7а).
Полученные культуры корней незабудочника шелковистого имели необычную темно-коричневую (Es-vector-корни) и коричневую (Es-ro/C-корни) окраску (рис. 76). Фенотипически го/С-трансгенная культура корней не проявляла характерные черты бородатых корней, таких как быстрый рост, увеличение бокового ветвления и плагиотропный рост, напротив, она походила на корни природного растения незабудочника шелковистого и культуру корней Es-vector. Однако корни Es-rolC характеризовались более активным ростом в сравнении с культурой корней Es-vector. Прирост сырой биомассы для культуры Es-vector составил 169 ± 19 г/л, в то время как прирост Es-rolC - 211 ± 17 г/л. Корни Es-vector и Es-rolC окрашивали культуральную среду в коричнево-бордовый и коричневый цвет, соответственно.
