Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. Культуры клеток и тканей рыб
2.1.1.. Первичные культуры 10
2.1.2. Перевиваемые клеточные линии 15
2.2. Вирусные заболевания рыб
2.2.1. Инфекционный некроз поджелудочной железы лососевых lf.(IPN) 16
2.2.2. Весенняя виремия карпов (SVC) 32
Собственные исследования
3. Материалы и методы
3.1. Рыбы 37
3.2. Культуры клеток 37
3.3. Вирусы 41
4. Результаты исследований
4.1. Разработка методов получения первичных и субкультур из тканей лососевых рыб (Salmo irideus Gibbons) и их цитоморфологическая характеристика .~
4.1.1. Культура клеток из ткани сердца радужной форели 44
4.1.2. Культура клеток из ткани почек радужной форели 46
4.1.3. Культура клеток из ткани селезенки радужной форели 48
4.1.4. Культура клеток из ткани гонад радужной форели 50
4.2. Разработка методов получения первичных и субкультур из тканей гонад серебряного карася (Carassius carassius L.) и их -морфологические свойства
4.3. Разработка методов получения первичных и субкультур из тканей эмбрионов аквариумной рыбы-гуппи (Lebistes ^~ reticulates L.) и их морфологические свойства
4.4. Изучение чувствительности к вирусам первичных и субкультур из тканей рыб
4.4.1. Чувствительность первичных культур клеток из тканей внутренних органов и субкультуры из ткани гонад радужной форели к вирусу инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых IPN 62
4.4.2. Чувствительность первичных и субкультур из ткани гонад серебряного карася к вирусу весенней виремии карпов SVC fi.
4.4.3. Чувствительность субкультур из ткани эмбрионов аквариумной рыбы-гуппи к вирусам промышленноразводимых Л рыб
4.5. Изучение цитопатогенного действия штаммов вируса IPN и
SVC на перевиваемые культуры клеток лососевых и карповых
рыб
4.5.1. Размножение и титрование референтного и полевого штаммов вируса IPN в перевиваемых культурах клеток СНН-1 HCHSE-214
4.5.2. Морфологические изменения перевиваемых культур клеток СНН-1 и CHSE-214, инфицированных полевым и референтным штаммами вируса IPN
4.5.3. Размножение и титрование полевого штамма IPN в перевиваемой культуре клеток эпителиальной папилломы ~. карпа ЕРС
4.5.4. Сравнительное изучение цитопатогенного действия в перевиваемых культурах клеток сердца кеты СНН-1 и эпителиальной папилломы карпа ЕРС референтного и полевого штаммов вируса IPN и SVC 82
5. Обсуждение результатов исследований 85
6. Выводы 95
Практические предложения 97
Литература 98
Приложения 117
Введение к работе
Актуальность проблемы
Метод культивирования клеток вне организма является большим достижением биологической науки, так как позволяет получать наиболее объективные и надежные данные при диагностике вирусных инфекций, использовать их в биотехнологических процессах при производстве вакцин, для получения интерферона, а также при синтезе моноклональных антител. (Wolf К. et.al., 1980; Sasson А., 1987; Животная клетка в культуре, 2000).
Культуры клеток рыб также являются объектом биотехнологии и вирусологии. Наибольшую потенцию роста in vitro имеют клетки гонад неполовозрелых рыб и их эмбрионы (Dannevig В.Н. et.al., 1997), культуры, приготовленные из зрелых тканей, обладают слабой потенцией роста (Miller N.W. et.al., 1994а; Rode М. et. al., 1997; Wergeland H.I. et.al., 2001). В некоторых случаях перевиваемые культуры клеток получены из новообразований: саркомы, лимфосаркомы, гепатомы, нефробластомы и оспенной эпителиомы (Soustegard R.A. & Soustegard K.S., 1973; Fijan N., Sulimanovic D. et. al., 1983).
Благодаря получению однослойных культур клеток гонад карпа в нашей стране впервые в 1970 году был выделен вирус от больных карпов, а при изучении свойств и роли вируса в патологии рыб установили, что этот агент вызывает заболевание названное весенняя вирусная болезнь карпа (Рудиков Н.И., 1986). В 2001 году впервые в России от мальков семги, полученных из оплодотворенной икры, завезенной из Норвегии, в культуре клеток сердца кеты был выделен вирус инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых, представитель семейства Birnaviridae (Пичугина Т.Д. с соавт., 2005а).
Таким образом, с возникновением острых вирусных эпизоотии среди карповых и лососевых рыб, появилась необходимость в совершенствовании методов диагностики, основанных на использовании как первичных, так и перевиваемых культур клеток.
В практической вирусологической работе наиболее важным является изучение спектра чувствительности культур клеток к различным вирусам (Kelly R.K. et.al., 1978; Kielian М. et.al., 1990). Не все линии клеток изучены достаточно полно в этом отношении. Так, в культуре клеток FHM реплицируются, по крайней мере, четыре вируса рыб - IPNV, SVCV, VHSV, IHN и два вируса теплокровных животных (Gravell М. et.al., 1965). Культура клеток CHSE - 214, из эмбрионов чавычи, чувствительна к вирусам герпеса лососевых, IHN, IPN и VHS (Kibenge F.S.B. et.al., 2000). Культура клеток из оспенных поражений карпа ЕРС также имеет широкий спектр чувствительности и в ней реплицируются вирусы SVC, VHS, а также вирусы европейского угря. Особый интерес представляет линия клеток радужной форели RTG-2, чувствительная к шести вирусам рыб, а также к вирусам венесуэльского и восточного энцефаломиелитов лошадей, и отека головастиков (Hjalmarsson A. et.al., 1999).
Однако, несмотря на существование большого количества перевиваемых клеточных линий рыб не все из них могут быть использованы в диагностике. Для областных и районных диагностических лабораторий зачастую не представляется возможным и экономически оправданным приобретение из-за рубежа или исследовательских институтов необходимых линий клеток. Более того, работа с зарубежными культурами клеток рыб сопряжена с определенными трудностями при культивировании. В качестве альтернативы при диагностических исследованиях для выделения и накопления вируса возможно использование первичных культур и субкультур клеток, полученных из тканей восприимчивых к данному вирусу рыб (Office International des Epizooties, 2000). Таким образом, расширение исследований по получению первичных культур клеток и субкультур, чувствительных к определенным вирусам рыб, и создание в дальнейшем отечественных постоянных линий является актуальной научной проблемой.
Цель работы: изучить культурально-морфологические свойства первичных культур клеток, субкультур и клеток перевиваемых линий из тканей различных видов рыб и определить чувствительность к вирусам-возбудителям инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых (IPN) и весенней виремии карпов (SVC). Основные задачи исследований:
• Получить первичные культуры и субкультуры клеток из тканей внутренних органов и гонад лососевых, карповых и аквариумных рыб и дать цитоморфологическую характеристику.
• Изучить чувствительность культур клеток из тканей лососевых рыб к вирусу инфекционного некроза поджелудочной железы (IPN) лососевых и культур клеток из гонад карася к вирусу весенней виремии карпов (SVC).
• Определить чувствительность и возможность адаптации культуры клеток из эмбрионов аквариумных рыб к вирусам рыб, разводимых в аквакультуре.
• Изучить морфологические изменения в клетках перевиваемых линий СНН-1 и CHSE-214, инфицированных полевым и референтным штаммами вируса IPN.
• Разработать схему преодоления непермиссивности клеток перевиваемой линии эпителиальной папилломы карпа (ЕРС) к вирусу инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых (IPN).
• Изучить в сравнительном аспекте цитопатогенное действие полевого штамма ВС-1, референтных штаммов вируса IPN и SVC на перевиваемые культуры клеток сердца кеты СНН-1 и эпителиальной папилломы карпа ЕРС.
Научная новизна
Получены субкультуры клеток из первичных культур клеток гонад радужной форели и серебряного карася, дана их цитоморфологическая характеристика и определена чувствительность к вирусам инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых (IPN) и весенней виремии карпов (SVC) соответственно.
Получена и адаптирована для размножения вируса весенней виремии карпов (SVC) субкультура из клеток эмбрионов аквариумной рыбы-гуппи.
Отработана схема перевода непермиссивных клеток эпителиальной паппиломы карпа в состояние пермиссивности по отношению к вирусу инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых (IPN).
Практическая ценность работы заключается в том, что в результате проведенных исследований отработаны методы получения первичных культур и субкультур из внутренних органов и гонад радужной форели, гонад карася и эмбрионов гуппи, чувствительных к вирусам лососевых и карповых рыб и показана возможность использования их в вирусологических исследованиях.
Апробация
Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на:
? Заседании научно-консультативного Совета по болезням рыб Межведомственной Ихтиологической комиссии и Секции патологии рыб и охраны гидробионтов Отделения ветеринарной медицины РАСХН (Москва, 2003г.);
? Конференции «Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине» (ВИЭВ, 2003г.);
Second Bilateral Conference «Aquatic & marine animal health» (USA, 2003);
Совещании, посвященном научно-практическим проблемам инфекционной патологии и охраны здоровья рыб, (ВИЭВ, 2004г.);
? Международной конференции «Сохранение генетических ресурсов». (Санкт-Петербург, 2004г.);
? Конференции «30 лет развития современных направлений клеточной биотехнологии» (ВИЭВ, 2005г.);
? Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина 2005: современное состояние и актуальные проблемы обеспечения ветеринарного благополучия животноводства» (Ялта, 2005г.);
? Межлабораторном совещании научных сотрудников ВИЭВ (2006г.)
Публикации По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ.
Объем и структура работы
Диссертационная работа изложена на 131 страницах и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Материалы диссертации иллюстрированы 14 таблицами, 25 рисунками. Список литературы включает 178 публикаций, в том числе 147 иностранных.
Первичные культуры
Внедрение в вирусологическую практику метода культуры клеток расширило наши представления о возбудителях вирусных инфекций, характере инфекционного процесса, происходящего в клетках, методах диагностики и изготовлении биологических препаратов.
Вполне понятно, что исследования связанные с ветеринарной медициной преобладали, а изучению низших позвоночных уделяли намного меньше внимания. Тем не менее, имеется значительный объем информации и богатый источник исследовательского материала среди холоднокровных позвоночных. Низшие животные составляют три четверти видов всех позвоночных, при этом рыбы насчитывают почти половину (Altman P.L. & Dittmer D.S., 1972). Рыбы являются пойкилотермными животными, то есть температура их тела зависит от температуры воды.
В настоящее время разными исследователями во всех странах мира выведены многочисленные линии перевиваемых клеток из необластических и нормальных тканей рыб. В мире существует более 300 клеточных линий рыбного происхождения. Первое применение тканевых культур рыб провела L.Grutsner в 1956 году для диагностики оспы карпов. Она готовила эксплантаты из ткани аквариумных рыб -гуппи (Lebistes reticulatus L.) и макропода (Macropodus opercularis L.) (Grutzner L., 1956). Одновременно К.Wolf и C.T.Dunbar (1957) разработали методику приготовления эксплантатов тканей радужной форели, кумжи и палии.
Первично трипсинизированные культуры клеток рыб появились позднее; в 1958 году Grutzner L. трипсинизировала ткани печени и почек линя (Tinea vulgaris L.). Некоторые исследователи готовили культуры из почек карпа Lj. Kunst (1962), В.В.Никольский и Е.Ф. Осадчая (1964), Е.Ф.Осадчая (1969, 1972), В. Kocylowski et.al. (1972). Однослойные культуры клеток почек леща готовили Г.Д.Гончаров с соавторами (1970), почек угря - N. Wakabayashi, S.Egusa (1969).
К.Wolf с коллегами (1960с) установили, что наибольшую потенцию роста in vitro имеют клетки гонад неполовозрелых рыб и эмбрионы, это было позднее подтверждено рядом работ других исследователей (Fryer J.L., 1965). Впоследствии культуры клеток из гонад разных видов рыб готовили многие зарубежные исследователи: Pfitzner I., Grutzner (1963) из гонад линя; Lj.Kunst, Fijan N. (1966) - из гонад карпа; L.L.Roberts (1966) - из гонад атлантической сельди; J.W.Rachlin с соавторами (1967) — гонад аквариумной рыбы данио-рерио (Brachydanio rerio). Для работы с клетками рыб использовали среды, разработанные для тканей и клеток теплокровных животных, при культивировании учитывалась оптимальная для клеток рыб температура.
В России метод культуры клеток рыб применили впервые более 40 лет назад в ГосНИОРХе В.И.Тец и Г.С.Яковлева (1962), они выращивали однослойные культуры клеток из гонад карпа. Позднее их работа была продолжена Рабкиным Е.М. и Куденцовой Р.А. (1969).
С 1969 года подобные исследования были начаты в центральной лаборатории по изучению болезней рыб ВИЭВ. Н.И.Рудиков изучал возможность приготовления однослойных культур клеток недифференцированных гонад, почек, сердца, селезенки, плавательного пузыря, жабр и плавников радужной форели (Oncorhynchus mykiss Walbaum); почек, селезенки и сердца карпа (Cyprinus carpio L.), гонад и эмбрионов вьюна (Рудиков Н.И., 1969). При разработке культур клеток были проведены многочисленные опыты, направленные на уточнение различных моментов процесса выращивания клеток, при этом применялись общепринятые в медицинской и ветеринарной вирусологии приемы и методики, а также растворы и питательные среды с учетом особенностей организма рыб.
Культуры клеток
В работе с культурами клеток использовали стандартные питательные среды и растворы: среды Игла MEM, Игла MEM с двойным набором аминокислот и витаминов, 0,02% раствор версена (натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты), 0,25% раствор трипсина на рабочем растворе Хенкса без Са и Mg"T (ФГУП предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиеомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова), телячья фетальная сыворотка (HyClone - Perbio, USA). Для предотвращения бактериальной контаминации культур использовали антибиотики: 300 ЕД/мл пенициллина, 50 мкг/мл канамицина и 300 мкг/мл стрептомицина. Первичные культуры клеток рыб.
Первичную культуру клеток получали из органов радужной форели (Salmo irideus Gibbons): сердца, головной и туловищной почки, селезенки. Субкультуру из гонад (И-Ш стадии зрелости).
Из гонад карася (Carassius carassius L.) (И - IV стадий зрелости) готовили первичные и субкультуры клеток.
На следующем этапе исследований готовили первичные и субкультуры из икры и эмбрионов гуппи (Lebistes reticulates L.). Концентрацию клеток в суспензии определяли путем подсчета в камере Горяева. Для окрашивания использовали 0,1%-ный растворкристаллвиолета на 0,1 м раствора лимонной кислоты. Ах 1000x2 0,9 , где х - число клеток в мл, а - среднее число клеток в четырех пробах, 1000 - числокубических миллиметров в 1 см3, 2 - коэффициент разведения суспензии раствором краски, 0,9 - объем камеры Горяева в мм3.
Жизнеспособность определяли с помощью 0,5% водного раствора трипановой сини, который окрашивает мертвые клетки в синий цвет. Процент жизнеспособности вычисляли по формуле: Общее число клеток - число мертвых клеток х 100 Общее число клеток Наблюдения за ростом клеток вели под микроскопом Carl Zeiss Jena Jenamed-2 (Германия) и Meopta (Чехословакия) (окуляр 10, объектив 10). Применяли методы, изложенные в руководстве по культурам клеток животных «Животная клетка в культуре» (2000) Для изучения биологических свойств вирусов использовали зарубежные перевиваемые культуры клеток рыб любезно предоставленные с.н.с. лаборатории ихтиопатологии ВНИПРХ И.С.Щелкуновым.
CHSE — 214 (Нормальный эмбрион чавычи, Oncorhynchus tshawytscha Walbaum), которая была приготовлена В.В. McCain в октябре 1964 года. Клетки выращивали в среде Игла MEM с солями Эрла, 90% с добавлением эмбриональной телячей сыворотки, 10% и L-глутамина. Температура инкубации между 4-27С, оптимум - 20 С. Для ресуспендирования клеток при пересеве использовали 0,25%-ный раствор трипсина с 0,02%-ным раствором версена (в соотношении 2:1). Коэффициент пересева составлял 1:2,1:3. Монослой клеток формировался через 48 часов при температуре 20 С, после образования плотного монослоя флаконы переносили в охлаждающий термостат при температуре 15 С. Частота пересева один раз в 10-14 дней. Выращивали клетки в культуральных флаконах 25,50,75 см2.
Культура клеток из ткани сердца радужной форели
Поставлено 4 опыта. В экспериментах использовали трипсин рН 7,4-7,5; версен и их смесь. В первом варианте измельчённые ткани заливали 0,25% раствором трипсина, во втором - 0,02% раствором версена, в третьем варианте смесью 0,02 %-ного раствора версена и 0,25 %-ного раствора трипсина в соотношении 1:1, в четвертом - в соотношении 2:5.
Далее дезагрегировали на магнитной мешалке в течение 40 мин., надосадок сливали. Осадок заливали свежей порцией рабочего раствора и экстрагировали дробно до полного истощения ткани в течение 1,5 -2,5 часов. Через каждые 30 минут отбирали пробу суспензии и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин., осадок ресуспендировали в среде культивирования, определяли концентрацию клеток и жизнеспособность с помощью раствора трипановой сини, путем подсчета в камере Горяева. Для окрашивания брали 1 мл клеточной суспензии и добавляли равный объем 0,5 %-ного раствора краски. Результаты опытов по дезагрегации ткани сердца форели представлены в таблице 1.
Из таблицы видно, что применение 0,25% раствора трипсина сильно травмирует клетки, жизнеспособность очень низкая (32,3 -22,3%). Применение 0,02% раствора версена дает небольшой выход клеток с низкой жизнеспособностью, возможно из-за длительности дезагрегации. Дезагрегация по третьему и четвертому варианту давала сопоставимые значения жизнеспособности (69,9% и 65,1%), но использование смеси версен+трипсин как 2:5 позволило получить больший выход клеток 317,0 тыс.кл/млПоэтому мы считали, что оптимальные результаты получены при дезагрегации пятью циклами по 30 минут и воздействии смеси 0,02% версена и 0,25% трипсина в соотношении 2:5.
Для культивирования использовали среду Игла MEM с двойным набором аминокислот и витаминов с 10% фетальной телячьей сыворотки и L-глютамином (300 мг/мл), посевная концентрация около 600 тыс. клеток в 1 мл среды. Анализ цитологических препаратов показал, что клетки сердца форели (СФ) образуют монослой в течение 3-4 месяцев. Клетки в основном эпителиоподобного типа, полигональной формы. В ядрах содержится 1-3 ядрышка (рис 1.)
