Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ДНК- ГЕНОМНЫЕ ВИРУСЫ РАСТЕНИЙ: ТАКСОНОМИЯ, СВОЙСТВА, ДИАГНОСТИКА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 7
1.1. Общая характеристика вирусов рода Caulimovirus семейства Caulimoviridae
1.2. Вирус мозаики цветной капусты - типовой представитель рода Caulimovirus 8
1.3. Характеристика репликации и изменчивости вирусного генома 20
1.4. Модельные системы для изучения ВМЦК 27
1.5. Использование генома ВМЦК в генетической инженерии 29
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 33
2.1. ВМЦК и его изоляты 33
2.2. Способы передачи вируса 34
2.3. Световая и электронная микроскопия 34
23.1. Изучение внутриклеточных вирусных включений методом световой микроскопии 34
2.3.2. Негативное контрастирование частиц ВМЦК для электронномикроскопического исследования 34
2.3.3. Ультратонкие срезы 35
2.4. Получение каллусной ткани цветной капусты 35
2.5. Очистка ВМЦК 35
2.6. Получение поликлональных моноштаммовых антисывороток 36
2.7. Реакция двойной иммунодиффузии 37
2.8. Методы выделения ДНК 37
2.9. Электрофорез структурных белков в ПААГ 39
2.10. Анализ ДНК электрофорезом в акриламидном и агарозном гелях 40
2.11. Полимеразная цепная реакция 41
2.12. Рестрикционный анализ ДНК 41
2.13. Синтез нерадиоактивных ДНК-зондов 42
2.14. Блот-гибридизация ДНК 43
ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА ДАЛЬНЕВОСТОЧНОГО ШТАММА ВМЦКо 44
3.1. Цитологические и ультраструктурные особенности инфицированных ВМЦКо клеток 44
3.2. Физико-химическая характеристика ВМЦКо 47
3.2Л. Подбор методики получения препарата ВМЦК 47
3.2.2. Структурные полипептиды ВМЦКо 55
3.2.3. Характеристика нуклеиновой кислоты ВМЦКо 56
3.3. Антигенная характеристика капсидных белков ВМЦКо и выявление штаммо-, видо- и родоспецифических эпитопов ВМЦК и ВМГ 58
ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ВМЦК НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ЕГО ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ 60
4.1. Амплификация ГБЦВ дальневосточных изолятов ВМЦК 60
4.2. Анализ генетической изменчивости ВМЦК 64
4.3. ПЦР диагностика ВМЦК , 69
4.4. Диагностика ВМЦК с помощью ДНК-гибридизации 71
ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 74
ВЫВОДЫ 90
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .92
- Общая характеристика вирусов рода Caulimovirus семейства Caulimoviridae
- ВМЦК и его изоляты
- Цитологические и ультраструктурные особенности инфицированных ВМЦКо клеток
Введение к работе
Своеобразие гео-климатических условий юга Дальнего Востока России определяет повышенный инфекционный фон в агроценозах. Здесь циркулируют вирусы растений, поражающие важные в экономическом плане культуры: овощные, картофель, злаковые, бобовые, декоративные. К настоящему моменту в дальневосточном регионе выявлено около 50 фитовирусов из 16 родов и еще больше описано их штаммов (Гнутова, 2003). Результаты ежегодного фитосанитарного мониторинга поражаемости сельскохозяйственных культур вирусами свидетельствуют о наличии в биоценозах ранее не изученных вирусов и их штаммов. Так, оказалось, что овощные культуры, изучение вирусов которых интенсивно проводится в последние годы, поражаются не только РНК-, но и ДНК-геномными вирусами. Идентифицирован новый вид для дальневосточного региона - вирус мозаики цветной капусты - Cauliflower mosaic virus рода Caulimovirus семейства Caulimoviridae (Gnutova, Tolkach, 2000). Вид выделен из культурных растений сем. крестоцветные: капусты, редиса. Особый интерес представляет то, что в Приморском крае известно шесть изолятов вируса. При этом они отличаются как по биологическим, так и по физическим свойствам, что дает основание сделать предположение о высокой изменчивости ВМЦК в данном регионе.
Современный подход к изучению штаммов ВМЦК должен опираться не только на комплекс классических методов вирусологии, но и на методы молекулярной биологии, поскольку все фенотипические особенности изолятов генетически детерминированы (Chenault, Melcher, 1994). Поэтому для дополнения ранее полученных результатов по штаммовому разнообразию ВМЦК в дальневосточном регионе необходимо было продолжить дальнейшую идентификацию изолятов и получить данные по генетической изменчивости, которые подтверждали или отвергали их статус как самостоятельных штаммов. Кроме того, на георгине по биологическим свойствам был выявлен еще один вид рода Caulimovirus - вирус мозаики георгина — Dahlia mosaic virus (Tolkach, Gnutova, 2002), что позволило провести сравнительную характеристику эпитопов капсидных белков ВМЦК и ВМГ - как видов одного рода.
Знание особенностей генетической изменчивости ВМЦК важно не только при изучении штаммового состава вируса, но и позволяет разработать для него эффективные методы диагностики. По литературным данным до сих пор
пор еще не получен эффективный иммунодиагностикум против ВМЦК. В последние годы для этих целей используют молекулярные методы детекции вирусной ДНК, вследствие их высокой чувствительности и специфичности. Разработанный за рубежом радиоактивно-гибридизационный метод выявления ВМЦК довольно перспективен, однако в практике он не нашел применения, главным образом, из-за трудоемкости и необходимости соблюдения строгих мер безопасности (Maule et ah, 1983). Более доступным может стать его вариант с использованием нерадиоактивных зондов. Выявление промотора 35S РНК ВМЦК в трансгенных растениях с помощью ПЦР со специфическими праймерами - более быстрый и доступный способ (Melnychuk et aL, 2002), что свидетельствует о его перспективности. Необходимо отметить также, что изучение изменчивости ВМЦК - актуальная задача не только для вирусологии, но и для генной инженерии, которая успешно использует геном вируса и его фрагменты как модельные объекты для получения трансгенных растений.
При работе одновременно с несколькими изолятами ВМЦК особое значение имеет длительное содержание их в растениях и сохранение моноинфекции. Известно, что растения сем. крестоцветные, на которых поддерживается вирус, являются объектом питания для насекомых-переносчиков вирусов, что создает опасность для сохранении чистоты отдельного штамма. Мы решили показать перспективность длительного содержания ВМЦК in vitro - в культуре изолированных тканей растений.Такой подход позволил бы сократить дорогостоящие площади теплиц и исключить влияние насекомых-переносчиков и мало контролируемых факторов на рост растений.
Исходя из выше изложенного, цель настоящей работы состояла в характеристике структурных белков и изменчивости вирусного генома, изучении цитопатогеиных свойств для определения штаммового разнообразия ВМЦК, а также разработке молекулярных методов их диагностики. При выполнении работы были поставлены следующие задачи:
1. Подобрать методику получения препарата обычного штамма ВМЦК (ВМЦКо).
2. Оценить возможность поддержания и накопления вируса in vitro в культуре каллусной ткани системного хозяина Brassica cauliflora.
3. Определить морфологию и размер вирионов ВМЦКо.
4. Дать характеристику ВМЦК-индуцированным внутриклеточным включениям и определить места их локализации.
5. Изучить ультраструктурные изменения в клетках инфицированных растений.
6. Получить антисыворотку против ВМЦКо от различных животных-продуцентов специфических антител.
7. Выявить родо-, видо- и штаммоспецифические эпитопы капсидных белков ВМЦК и ВМГ.
8. Отработать методику выделения нуклеиновой кислоты вируса, определить ее тип и размер.
9. Подобрать структуру олигонуклеотидных праймеров для амплификации гена белка цитоплазматических включений ВМЦК на основе известных нуклеотидных последовательностей вируса.
10. Провести молекулярно-генетический анализ изменчивости дальневосточных изолятов ВМЦК.
11. Разработать вариант нерадиоактивной блот-гибридизации для детекции ВМЦК.
12. Разработать систему диагностики ВМЦК с помощью ПЦР.
Общая характеристика вирусов рода Caulimovirus семейства Caulimoviridae
Согласно последнему седьмому докладу МКТВ все двухцепочечные ДНК-содержащие вирусы растений объединяют в одно семейство -Caulimoviridae, в которое наряду с родом Caulimovirus включаются еще 5, общей численностью около 30 видов (табл. 1) (Van Regenmortel, 2000).
Все вирусы сем. Caulimoviridae являются обратно транскрибирующими (Mesnard, Carriere, 1995). В основе их группирования, главным образом, лежит особенность структуры геномов (размер, расположение и количество ОРС) и их репликации (Hull, Covey, 1987). Из табл. 1 следует, что баднавирусы, а также выделенный в 1997 г. из их состава в отдельный род RTBV-like viruses, отличаются по морфологии частиц. Кроме того, они не формируют цитоплазматических включений.
Название рода Caulimovirus образовано от названия типового представителя Cauliflower mosaic virus. Род немногочислен и включает 9 видов и 4 возможных членов рода. Вирионы каулимовирусов - изометрические частицы с диаметром около 50 нм, без оболочки (Цит. по Краеву, 2000).
Симптомы растений, инфицированных каулимовирусами, чаще всего представляют собой мозаичную крапчатость, хлороз жилок. Нередко заболевание сопровождается задержкой роста растения, искривлением листовой пластинки (Pfeiffer, Mesnard, 1995).
В природе распространение каулимовирусов осуществляется преимущественно с помощью тлей, насекомых с колюще-сосущим ротовым аппаратом, полуперсистентно (Гиббс, Харрисон, 1978). Отдельные виды передаются прививкой (Lawson, Civerolo, 1978; Petrzik et al., 1998). В лабораторных условиях помимо насекомых-переносчиков передача осуществляется механической инокуляцией.
В клетках инфицированных растений вирусы рода Caulimovirus образуют округлые цитоплазматические включения, состоящие из белкового матрикса и массы вирионов (Гольдин, 1963).
Антигенное родство установлено лишь между некоторыми видами рода (Shephert, 1976).
В целом, большинство видов были описаны лишь в последние 10-15 лет. Отсутствие полных сведений о структуре геномов и белковом составе сдерживает работу по созданию таксономической структуры вирусов данного семейства.
Вирус мозаики цветной капусты — типовой представитель рода Caulimovirus
История открытия и изучения. В 1921 г. Т. Шульц сделал первое сообщение о мозаичной болезни китайской капусты, горчицы и турнепса (Schultz, 1921). Первые сообщения о массовом вирусном поражении разных видов капусты (цветная, кормовая, кочанная, кольраби) в СССР появились в 40-х гг XX в. Так, в 1949 г. вирусное заболевание широко распространилось на капустах в Азербайджане, в Средней Азии в 1958 г., в 1964 п-в Краснодарском крае (Власов и др., 1973), За пределами СССР вирусное поражение капуст известно с начала XX в.
ВМЦК первоначально имел несколько видовых названий: Brassica virus 3, Broccoli mosaic virus, Cabbage mosaic virus, Cabbage virus В (Shepherd, 1970).
На первых этапах работы при идентификации вируса, исследователи столкнулись с рядом затруднений, так как мозаичное заболевание растений сем. крестоцветные вызывалось не одним, а двумя передающимися тлями вирусами, один из которых был назван вирусом мозаики цветной капусты, а другой вирусом мозаики турнепса (Walker et ah, 1945). Первая обстоятельная публикация по биологическим свойствам ВМЦК (симптоматология, круг растений-хозяев, передача насекомыми, распространенность и др.) сделана L. Broadbent (1957). В 2001 г. вирус, вызывающий заболевание цветной капусты, был зарегистрирован в Приморском крае (Толкач, Гнутова, 2001). В соседних странах: в Китае - 1979 г. (Liang, 1998), в Японии - 1937 г. (Tomaru, 1998).
Круг растений-хозяев и симптоматика. В естественных условиях вирус поражает растения из сем. крестоцветные: капусту (брюссельскую, цветную, кольраби, кормовую, китайскую, кочанную) (Shukla, Schmelzer, 1972; Schoelz et al, 1986; Al-Kaff, Covey, 1995; Raybould et al., 1999), редис, турнепс, дайкон, рапс, а также несколько видов сорных и дикорастущих видов крестоцветных, например, сурепку обыкновенную (Barbarea vulgaris R.Br.) (Власов и др., 1973; Толкач и др., 2002).
Круг экспериментально заражаемых растений включает также виды из сем. пасленовые: дурман обыкновенный (Datura stramonium L.), табаки {Nicotiana spp. L.) (Mevel, Kerlan, 1990).
На листьях растений, инфицированных вирусом, наблюдается вначале посветление жилок, а затем появление темно-зеленого окаймления вокруг них. Листья могут приобрести уродливую форму (Shukla, Schmelzer, 1972).
ВМЦК может в природе встречаться в виде штаммов. В зависимости от штамма круг восприимчивых растений, симптомы проявления инфекции и некоторые другие свойства могут значительно варьировать (табл. 2).
Изучая биологические свойства 18 изолятов ВМЦК на растениях сем. пасленовые, S. Mevel и С. Kerlan (1990) установили, что 9 изолятов способны поражать дурман обыкновенный, образуя на листьях хлоротические пятна, иногда переходящие в некрозы; французский и аргентинский изоляты заражали табак Биглова (N. bigelowii (Torr.) S. Wats.), вызывая точечные некрозы. Инфекция многих изолятов сопровождалась системной некротизацией на табаке кливлендском (N. clevelandii A. Gray). Для 6 изолятов системным хозяином явился N. benthamiana Domin, поскольку реагировал хлорозом и (или) посветвлением жилок листа. Табак Эдвардсона (N. edwarsonii L.), табак клейкий (JV. glutinosa L.), табак (N. tabacum L.) (cvs Turkish, Samsun, Xanthi) и махорка (N. rustica L.) реагировали лишь хлорозом. Только табак Дебнея (N. debneyi Domun) оказался невосприимчивым ко всем изолятам.
ВМЦК и его изоляты
В ходе мониторинга на присутствие фитопатогенных вирусов в посадах овощных культур в пригороде г. Артема Приморского края к.б.н. с.н.с. В.Ф.Толкач на цветной капусте выявлены растения с вирусоподобными симптомами (хлоротичная мозаика и линейный узор на листьях). Идентификация возбудителя заболевания, проведенная на основе изучения его биологических свойств и сравнительного анализа с литературными данными, показала наличие в пораженных растениях ВМЦК. Позже образцы, содержащие ВМЦК, были собраны в различных районах Приморского края, всего шесть изолятов (табл. 4).
Сравнительное изучение биологических и физических свойств показало, что изоляты имеют отличия в вызываемых ими симптомах инфекции, экспериментальным круге заражаемых растений, а также некоторые особенности физических свойств вирионов (Tolkach, Gnutova, 2002). Эти данные позволили сделать предположение, что изучаемые изоляты ВМЦК можно характеризовать как самостоятельные штаммы. Однако, делалась ссылка на то, что для более четкой идентификации выявленных изолятов как штамма, необходимо привлечение более современных методов диагностики, в том числе и методов характеризующих капсидные белки и вирусный геном.
Вирусный материал был передан для дальнейшей характеристики и решения вопроса о присвоении им статуса самостоятельных штаммов.
Методы выделения вируса, его нуклеиновой кислоты отрабатывали на изоляте ВМЦКо, который по биологическим свойствам более всего соответствовал обычному штамму ВМЦК, описанному за рубежом. К нему же получали антисыворотки. Родовую принадлежность ВМЦК устанавливали путем сравнения антигенных детерминант с другим каулимовирусом - ВМГ, также выявленном в Приморском крае (Gnutova, Tolkach, 2000).
При постановке РДД и ДНК-гибридизации использовали очищенные препараты вирусов из лабораторной коллекции: ВТМ (Tobamovirus), ВМА-1 (Potyvirus), BOM (Cucumovirus).
Способы передачи вируса
В течение всего эксперимента вирус поддерживали на растениях редиса посевного и цветной капусте. Передачу ВМЦК осуществляли 2-мя способами: механической инокуляции и с помощью персиковой тли по методу В.Ф.Толкач(1995).
.Изучение внутриклеточных вирусных включений методом световой микроскопии
Внутриклеточные включения ВМЦК исследовали по методу М. Гольдина (1963) с помощью светового микроскопа МБР-6. Окраску эпидермиса листьев осуществляли в течение 20 мин 1%-ным толуидиновым синим приготовленном на 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,5.
Негативное контрастирование частиц ВМЦК для электронномикроскопического исследования
Применяли метод негативного контрастирования частиц вируса (Уикли, 1975) для просмотра в трансмиссионном электронном микроскопе JEOL -JEM 100 В. Сеточки покрывали формваровой пленкой, опускали в каплю очищенного препарата вируса на 4 - 5 мин. После промывания в ДВ, сеточки погружали в 2%-ный водный раствор уранилацетата (Serva) на 30 с, после чего сеточки сушили и просматривали в микроскопе.
Ультратонкие срезы
Ультратонкие срезы получали совместно с к.б.н. А.М.Поляковой. Для исследования ультраструктуры клеток, инфицированных ВМЦК, использовали традиционную методику (Уикли, 1975). После появления симптомов инфекции листья нарезали на полоски шириной 1 мм и фиксировали в 4%-ном растворе глутарового альдегида (Sigma) в течение 4 ч, затем в 1%-ной четырехокиси осмия (Реахим) -2 ч. Фиксирующие растворы готовили на ОД М фосфатном буфере, рН 7,4. После промывания ткань обезвоживали в растворах этанола возрастающей концентрации (20, 50, 70, 96%) и безводном ацетоне. Затем ткань помещали в аралдит. На этапе обезвоживания между спиртами 70 и 96% образцы окрашивали 2%-ным уранилацетатом, приготовленном на 70%-ном этаноле. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB, контрастировали 2%-ным водным раствором уранилацетата- 1 ч и цитратом свинца- 10 мин.
Цитологические и ультраструктурные особенности инфицированных ВМЦКо клеток
В настояодей главе изложены результаты изучения морфологии, цитопатодогичееких, физико-химических и антигенных свойств ВМЦКо, необходимых для его идентификации как типичного представителя ВМЦК.
В течение всего времени исследования изояят поддерживали на цветной капусте сорта Снежный шар. Успешность передачи инфекции оценивали по наличию симптомов, появляющихся на 30-35-й день после инокуляции в виде хлоротической крапчатости листовой пластинки и (или) хлороза участков листа вдоль главной и средних жилок (рис. 1 Б, В), На листьях контрольных растений (неинокулированных) подобных изменений не наблюдали (рис, А. Лист здорового растения. Симптомы, вызванные ВМЦКо:
Б. Хлороз участков ткани листовой пластинки.. В, Хлоротнческая крадтатоеть,
Цитологические и уяьтраструкгурные особенности инфицированных ВМЦКо клеток
Как правило, репликация фмтовируеов сопровождается специфическими изменениями в тонкой структуре инфицированных клеток. Световой микроскопией в клетках растении пораженных ВМЦКо- обнаружены патоморфологические изменения, К концу второй недели с момента инфицирования Б клетках верхнего эпидермиса листьев редиса посевного отмечено появление цйтоплазматическйх образований - округлых внутриклеточных включений (Х-тея), не встречающихся в клетках контрольных растений (рис, 2 А, Б). Интенсивное связывание красителя свидетельствует о высоком содержании, в них белка, Пироплазмы имели размер около 2 мкм5 располагались ошлоадерио в количестве б - 9 и более еа клетку и встречались практически в каждой згщдермальном клетке.
Более детально изучить ультраструктуру инфицированных ВМЦКо клеток, а также структуру обнаруженных включений позволили методы электронной микроскопии. Так, на удьтратонких срезах клеток паренхимы листа редиса сорта Ил кз обнаружены единичные, диффузио рас- зЩЯі ШШНІ сеянные в гналоплазме вириоиы Я К размером 45-50 нм, а также их Ц мелкие скопления (рис, З А, Б), В противоположность этому, в гиадопдазме клеток цветной капусты сорта Снежный шар УР Я были выявлены преимущественно крупные компактные скопления вйриоков, размером показал, что к моменту развития ярких симптомов в клетках тест-растении появляются признаки начинающегося автолиза: вакуолизация цитоплазмы (появление скоплений пузырьков различного размера), повышенное содержание миелиноподобных тел (МТ) различной морфологии; в виде пузырьков, окруженных собственной мембраной (рис. 4 А), "сот" (рис, 4 В), а также МТ, в виде округлых мембранных структур с различным количеством концентрических завитков (рис, 4 В). МТ были обнаружены в гиалоплазме и вакуолях
