Введение к работе
Актуальность темы. Норки (Mustela vison Shreb., американская норка) являются хозяевами для большого числа вирусов из-за их постоянного контакта с источниками и природными резервуарами возбудителей. При клеточном содержании на фермах наиболее часто их инфицируют два парвовируса: (алеутской болезни (ADV) и энтерита норок (MEV) (семейство Parvoviridae), морбилливирус чумы плотоядных (CDV) (семейство Paramyxoviridae) (Литвинов, Яременко, 1998). В конце 90-х гг. в трех пушных зверохозяйствах Приморского края были зарегистрированы случаи массового падежа норок (особенно щенков). Результаты вскрытия павших животных и эпидемиологические данные указывали на вирус алеутской болезни. К тому же, в сыворотке крови животных были обнаружены антитела к ADV (Минская и др., 2000), однако они могли являться поствакцинальными антителами. Было сделано предварительное заключение, что наиболее вероятным возбудителем является ADV. Требовалось провести видовую идентификацию вируса, определить его патогенность. Алеутская болезнь норок - контагиозное заболевание пушных зверей. Высокая восприимчивость животных и устойчивость вируса во внешней среде способствуют массовой смертности зверей, доходящей в некоторых случаях до 100% как за рубежом (Bloom et al., 1994), так и в России (Михеев, 2003), обуславливая значительный экономический ущерб пушному хозяйству. Для вируса характерна высокая скорость изменчивости (Gottschalck et al., 1991; Olofsson et a!., 1999). Показано, что единичные аминокислотные замены в его капсидных белках способны значительно влиять на патогенные свойства штаммов вируса (Oie et al., 1996; Stevenson et al., 2001). В связи с этим, отнесение впервые выявленного на юге Дальнего Востока изолята ADV к группе штаммов определенной патогенности - одна из важных задач при изучении вируса. Это позволит прогнозировать будущие вспышки, будет способствовать снижению экономического ущерба и разработке мероприятий по исправлению эпидемиологической ситуации на звероводческих фермах края.
Литературные данные свидетельствуют о достижении значительных успехов в изучении ADV. Однако, до сих пор не разработаны специфические средства защиты животных от инфицирования вирусом, что во многом обусловлено особенностями его биологии. Предложенные вакцины малоэффективны, так как вирионы не нейтрализуются антителами, а циркулируют в виде инфекционного иммунного комплекса. Поэтому, до настоящего времени, основным средством контроля заболевания, вызываемого ADV, остается выбраковка и изоляция пораженных животных. В ранней диагностике наиболее эффективны современные молекулярно-генетические методы, такие как радиоиммунный анализ, полимеразная цепная реакция, гибридизация нуклеиновых кислот, которые способны выявлять следовые количества вируса. Однако, учитывая, что ADV — не изученный вирус на Дальнем Востоке России, отсутствие данных об антигенных свойствах его капсидных белков и молекулярно-генетических характеристик не позволяет разработать эффективные диагностические тест-системы.
Необходимо отметить, что исследование парвовирусов отстает от аналогичных исследований других вирусов. Во многом это определяется их мелким размером, сложностью культивирования, сильной зависимостью репликации от клетки. Практически отсутствуют сведения об их антигеном родстве. Расшифрованы нукле-отидные последовательности геномов менее половины всех известных парвовирусов. Поэтому, о происхождении и эволюции этих видов известно очень мало. Учиты-
вая выше сказанное, а также то, что парвовирусы представляют угрозу для многих животных и, возможно, для человека, их изучение представляется актуальным и своевременным.
Цель работы состояла в изучении структурно-морфологических, иммуно-химичсских и молекулярно-генетических особенностей возбудителя алеутской болезни норок - ADV, циркулирующего в зверосовхозах Приморского края и разработке методов нового поколения для его диагностики.
Для этого необходимо бьио решить следующие задачи:
-
получить очищенный препарат вируса;
-
дать характеристику морфологии вирнонов дальневосточного изолята;
-
изучить основные физико-химические свойства (апсидных белков и нуклеиновой кислоты;
-
получить поликлональные антивирусные сыворотки от кроликов и норок и выявить антигенные особенности капсидных белков изолята;
-
определить нуклеотидную последовательность гена, кодирующего структурный белок Vp2;
-
установить филогенетические связи между изолятом и штаммами вируса, выявленными в других географических регионах ранее;
-
отработать методики радиоиммунных методов д.ія диагностики ADV;
9) разработать тест-системы диагностики ADV на основе ПЦР и гибридизации нуклеиновых кислот.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
В зверохозяйствах Приморского края снижение численности поголовья норки вызвано парвовирусом алеутской болезни, видом рода Parvovirus, семейства Parvoviridae.
-
Дальневосточный изолят вируса относится к группе сильнопатогенных штаммов вируса и является новым геновариантом американского штамма Utah I.
-
Предложенные условия мечения антигена ADV и ADV-специфических антител позволяют с помощью радиоиммунного анализа эффективно выявлять вирус и дифференцировать формы инфекционного процесса.
-
Отработана технология выявления ДНК ADV в сыворотке крови норок с помощью ПЦР.
-
Предложен способ получения ADV-специфического ДНК-зонда меченного перок-сидазон хрена и доказана его специфичность для детекции штаммов ADV.
Научная новизна. В работе впервые приводятся данные комплексной идентификации парвовируса, вызывающего массовую смертность живогных в зверохозяйствах Приморского края. Установлено, что на данной территории циркулирует один геновариант вируса, филогенетически близкий штаммам группы Utah. Показано, что выявленные мутации в гене капсидного белка Vp2, а также делеция аминокислоты в его гипервариабельном участке не влияют на вирулентность штамма. Предложена структура олигонуклеотидных праймеров для амплификации и секвенирова-ния полноразмерной копии гена Vp2. Впервые проведен анализ филогенетических групп штаммов ADV выделенных на основе полной нуклеотидной последовательности основного белка оболочки Vp2 и его фрагмента, длиной 231 н. о.
Праісгическая значимость работы. Установлена принадлежность дальневосточного изолята ADV к группе снльнопатогенньгх штаммов вируса, что позволяет прогнозировать экономический ущерб и проводить соответствующие противоэпи-
демиологические мероприятия. Впервые получена кроличья антисыворотка к изучаемому изоляту, которая может быть использована для детекции вируса иммунологическими методами. Использование меченных ш1 антигенных и антительных высокоспецифичных коньюгатов позволяет повысить точность и специфичность иммуно-химических методов диагностики заболевания на ранних стадиях инфекционного процесса. Предложены молекулярные методы диагностики ADV с доказанной специфичностью и высокой чувствительностью.
Апробация работы и внедрение в практику. Результаты работы докладывались иа региональных конференциях «Актуальные проблемы морской биологии и экологии» (2-3 октября, 1998 г., Владивосток) и «Проблемы экологии и рационального природопользования Дальнего Востока» (17-18 ноября, 1998 г., Владивосток), международной конференции по проблемам экологии и рационального природопользования стран АТР (16-17 ноября 1999 г., Владивосток), конференциях-конкурсах молодых ученых БПИ ДВО РАН (1999, 2001, 2004 гг.).
Нуклеотидная последовательность гена Vp2 дальневосточного изолята депонирована в международный банк генетических данных NCBI.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация общим объемом 97 страниц состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 2-х глав результатов исследования, обсуждения и выводов. Работа иллюстрирована 26 рисунками, на которых представлены 3 электронные микрофотографии, 8 электрофореграмм и бло-тов; содержит 8 таблиц. Список литературы насчитывает 264 наименования, из которых 213 на иностранных языках.
