Введение к работе
Актуальность темы. Микоплазмы являются уникальными микроорганизмами, занимающими особое положение среди бактерий (Razin, 1998). Для птицеводства наибольший интерес среди рода Mycoplasma представляют Mycoplasma gallisepticum (MG) и Mycoplasma synoviae (MS), которые наряду с метапневмовирусом птиц (МПВП), вирусом инфекционного бронхита кур (ИБК), ларинготрахеита (ИЛТ) и реовирусом вызывают респираторный синдром и теносиновит (Kleven, 1997; Bagust et al., 1997; Cavanagh et al., 1997; Ley et al., 1997, Sahu et al., 1975). MG и MS наносят значительный экономический ущерб промышленному птицеводству, снижая яйценоскость у птиц и осложняя течение ассоциированных вирусных и бактериальных заболеваний (Chu et al., 1987; Ley et al., 1997, Bradbury et al., 1978, 1984; Al-Afaleq et al., 1989).
Эффективность мероприятий по борьбе с инфекционными заболеваниями во многом зависит от своевременного выявления возбудителя. Диагноз основывается на данных клинического наблюдения и на результатах лабораторных исследований, которые должны быть получены в максимально короткие сроки. Дифференциация микоплазмозов от смешанных вирусных инфекций на ранних стадиях заболевания позволяет вовремя принять необходимые меры и сократить экономические потери.
В настоящее время для выявления MG и MS используют несколько методов. Выделение культуры микроорганизма является надежным, но весьма трудоемким методом, так как это требует значительного времени и специальных селективных сред. К тому же процесс культивирования может осложняться ростом вторичной микрофлоры (Kleven, 1975).
Серологические методы являются быстрыми и высокопроизводительными, но для выработки достаточного количества антител в крови, которые могут быть выявлены серологическими методами, требуется от 1-й до 3-х недель с момента начала инфекции (Kempf, 1998), что затрудняет выявление инфекции на ранней стадии.
Лабораторные методы, основанные на выявлении генетического материала MG и MS, обладают более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с культуральными и серологическими методами и сокращают время постановки диагноза до 4-5 часов с момента отбора проб. В последнее время появились методы ПЦР для выявления MG (Slavi et al., 1993; Toma et al., 1999) и MS (Ramirez et al., 2006), а также запатентованные диагностикумы для MG (IDEXX, США; ИнтерЛабСервис, г. Москва). Сейчас также применяют методы ПЦР, с помощью которых можно идентифицировать MG и MS одновременно (Mardassi et al., 2005; Wang et al., 1997). Сравнительно недавно для выявления MG развитие получил такой метод, как ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) (Carli et al., 2003; Callison et al., 2006). Однако выявление MS с помощью ПЦР-РВ еще не описано. Метод ПЦР-РВ более чувствителен и позволяет проводить количественный анализ. Одним из общих недостатков метода ПЦР является возможность ингибирования реакции при исследовании суспензий тканей и органов, таких, как мозг, печень и т.п., содержащих большое количество липидов и ферментов. Для исключения ингибирования и контроля процесса выделения используется внутренний контрольный образец (ВКО), т.е гетерологичная ДНК, которая добавляется в пробу перед выделением. К тому же существует риск перекрёстной контаминации, ввиду необходимости проведения электрофореза для анализа продуктов реакции.
Существующие штаммы MG, включая референтные, могут значительно отличаться по антигенным и биологическим свойствам (Rosengarten et al., 1996; Akhtar et al., 1991), поэтому необходимо не только выявлять изоляты, но также изучать их свойства. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей вариабельных генов даст возможность устанавливать пути распространения инфекции (Ley et al., 2003). Более того, использование живых вакцин против MG делает актуальной задачу дифференциации полевых изолятов. К тому же генетическое разнообразие изолятов MG, встречающееся на территории РФ, остаётся в настоящее время неизученным.
Исходя из вышеизложенного, разработка надежных методов выявления MG и MSв пробах патологического материала, а также изучения выявленных изолятов MG является актуальной задачей.
Цель и задачи исследования. Целью исследований являлась разработка методов выявления MG и MS на основе дуплекс ПЦР (дПЦР) и дуплекс ПЦР-РВ (дПЦР-РВ), а также изучение патогенности выявленных изолятов MG.
Для достижения поставленной цели были определены основные задачи:
1. Разработать методы ПЦР для выявления MG и MS в пробах патологического материала от птиц с ассоциированными инфекциями.
2. Провести анализ частоты встречаемости MG и MS в ассоциации с вирусами ИБК, МПВП, ИЛТ и реовируса кур, соответственно, при исследовании проб патологического материала.
3. Изучить патогенность некоторых выявленных изолятов MG.
4. Провести анализ нуклеотидных последовательностей участков вариабельных генов выявленных изолятов MG.
Научная новизна:
- разработаны методы выявления MG и MS на основе дуплекс ПЦР и дуплекс ПЦР-РВ с внутренним контрольным образцом;
- показана возможность дифференциации MG и MS от вирусов ИБК, МПВП, ИЛТ и реовируса кур в пробах патологического материала от птиц;
- изучена патогенность 5 выявленных изолятов MG;
- впервые проведен анализ нуклеотидных последовательностей генов gapA, mgc2 и pvpA 26 российских изолятов MG;
- получены последовательности фрагментов генов gapA, mgc2 и pvpA 26 изолятов MG, депонированные в международной базе данных Genbank под номерами FJ965750-FJ965767, FJ965769-FJ965783, FJ965785-FJ965815, FJ965817-FJ965827 и FJ972630-FJ972632.
Практическая значимость. Разработанные молекулярно-биологические методы, прошедшие испытания в «ФГУ ВНИИЗЖ», изложены в следующих документах:
- «Методика индикации генома Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae с использованием полимеразной цепной реакции» (2006 г.);
- «Методика выявления и количественного анализа Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с внутренним контрольным образцом» (2007 г.).
Данные методики одобрены учёным советом, утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» и включены в сборник «Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц с использованием ПЦР» (2008 г.) и рекомендованы Россельхознадзором РФ в качестве пособия для работников ветеринарных диагностических лабораторий.
Основные положения, выносимые на защиту:
- Методы ПЦР для выявления MG и MS: одновременная детекция геномов MG и MS методом дуплекс ПЦР и дуплекс ПЦР-РВ с внутренним контрольным образцом.
- Результаты выявления MG и MS в пробах от птиц с респираторным комплексом, полученных из птицеводческих хозяйств различных регионов РФ и СНГ в период с 2005 по 2008 гг.
- Результаты изучения биологических свойств изолятов MG.
- Результаты анализа первичных нуклеотидтных последовательностей фрагментов генов gapA, mgc2 и pvpA изолятов MG, выявленных на территории РФ в 2005-2008 гг.
Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены, обсуждены и одобрены на заседаниях учёного совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2006-2008 гг., опубликованы в материалах Всемирного ветеринарного конгресса по птицеводству (Китай, 2007), международных ветеринарных конференциях по птицеводству (Украина, 2008), Международной конференции, посвященной генетике микроорганизмов и эволюции инфекционных заболеваний (США, 2008).
Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 2 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 3 работы – в материалах международных конференций, 3 работы – в материалах конгрессов за рубежом.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 144 листах и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, заключение по обзору литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения и приложения. Работа иллюстрирована 25 таблицами и 18 рисунками. Список использованной литературы включает 210 источников. В приложении представлены копии документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.
Благодарность. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю д.б.н., профессору Дрыгину В.В. за консультативную помощь в процессе выполнения данной работы. Автор также признателен к.б.н. Колосову С.Н., к.б.н. Руниной И.А. вет. врачу Колотилову А.Н., а также Овчинниковой Е.В, Хлебовец З.Б. Зинякову Н.Г. и Ерошиной Т.И. за методическую помощь в выполнении отдельных этапов работы.
