Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Токсины энтеробактерий 12
1.1.1. Энтеротоксины 15
1.1.1.1. ST-энтеротоксины 16
1.1.1.2. Термолабильный энтеротоксин 16
1.2. Распространение способности токсинообразования среди различных групп микроорганизмов 18
1.3. Методы культивирования токсигенных эшерихий 21
1.4. Методы выделение и очистки термолабильного энтеротоксина 23
1.5. Методы обнаружения термолабильного энтеротоксина 25
1.5.1. Методы биологического обнаружения термолабильного энтеротоксина 26
1.5.2. Иммунохимические методы диагностики термолабильного энтеротоксина 28
1.5.3. Другие методы детекции термолабильного энтеротоксина... 32
1.6. Моноклональные антитела 33
Глава 2. Собственные исследования 36
2.1. Материалы и методы 36
2.1.1. Штаммы бактерий 36
2.1.2. Лабораторные животные 36
2.1.3. Среды для культивирования микроорганизмов и клеточных культур 36
2.1.4. Буферные растворы 37
2.2. Методы исследования 38
2.2.1. Получение биомассы штамма продуцента термолабильного энтеротоксина 38
2.2.2.1. Получение препаратов термолабильного энтеротоксина ультразвуком 38
2.2.1.2. Экстракция термолабильного энтеротоксина из клеток продуцентов 8М мочевиной 39
2.2.1.3. Выделение термолабильного энтеротоксина с использованием лизоцима 39
2.2.2. Осаждение термолабильного энтеротоксина сульфатом аммония 39
2.2.3. Гель-фильтрация 40
2.2.4. Аффинная хроматография 40
2.2.5. Определение концентрации белка 40
2.2.6. Электрофорез в ПААГе 41
2.2.7. Иммуноблотинг 42
2.2.8. Определение антигенной активности 43
2.2.9. Реакция радиальной иммунодифузии по
Ухтерлони 43
2.2.10. Тест на биологическую активность термолабильного энтеротоксина 43
2.2.11. Получение поликлональных антител 44
2.3. Методы работы с культурами клеток 45
2.3.1. Клонирование гибридом 45
2.3.2. Хранение клеток 45
2.3.3. Размораживание клеток 46
2.3.4. Получение препаративного количества мкАт 46
2.3.5. Очистка мкАт с помощью ионообменной хроматографии... 46
2.4. Иммуноферментный анализ 47
2.4.1. Приготовление конъюгата мкАт и поликлональных антител
с пероксидазой хрена 47
2.4.2. Приготовление проявляющего раствора 48
2.4.3. Непрямой метод иммуноферментного анализа 48
2.4.4. Двухцентровой метод иммуноферментного анализа 49
2.4.5. Определение токсигенности бактериальных штаммов 49
2.5. Иммунохроматографический анализ 50
Глава 3. Результаты исследований 51
3.1. Выделение и очистка термолабильного энтеротоксина эшерихии. . 51
3.1.1. Получение биомассы штамма продуцента 51
3.1.2. Получение грубых-экстрактов штамма продуцентов 51
3.1.3. Фракционирование грубого экстракта сульфатом аммония ... 51
3.1.4. Очистка препарата энтеротоксина посредство гель -фильтрации 52
3.1.5. Аффинная хроматография на голубой агарозе 54
3.1.6 Определение чистоты полученных препаратов
термолабильного энтеротоксина 55
3.1.7. Определение антигенной активности термолабильного энтеротоксина 57
3.1.8. Определение биологической активности термолабильного энтеротоксина 57
3.1.9. Определение специфичности мкАт с использованием иммуноблотинга 58
3.2. Получение поликлональной антисыворотки против
термолабильного энтеротоксина 60
3.2.1. Выделение и очистка поликлональных антител из антитоксической сыворотки 61
3.2.2. Хроматография поликлональной сыворотки на DEAE Toyopearl 650М 62
3.2.3. Определение специфичности препаратов поликлональных антител 63
3.2.4. Получение конъюгатов поликлональных антител с пероксидазой хрена 64
3.2.5. Подбор оптимальных условий для сорбции поликлональных антител на пластик 66
3.3. Получение и очистка препаративных количеств мкАт 67
3.3.1. Использование перитониальных макрофагов 67
3.3.2. Получение препаративных количеств мкАт 68
3.3.3. Хроматографическая очистка мкАт на сорбенте DEAE-Toyopearl 650М 68
3.3.4. Определение чистоты полученных препаратов мкАт 70
3.3.5. Исследования используемых мкАт методом ИФА 71
3.3.5.1. Получение конъюгатов мкАт с пероксидазой хрена ... 71
3.3.5.2. Подбор специфической пары мкАт для обнаружения термолабильного энтеротоксина 72
3.3.5.3. Определение оптимальных условий сорбции мкАт
на иммунологические планшеты 72
3.4. Создание иммуноферментной тест-системы для определения
термолабильного энтеротоксина 73
3.4.1. Аналитические параметры иммуноферментной тест-системы
для обнаружения термолабильного энтеротоксина 75
3.5. Определение термолабильного энтеротоксина при помощи иммунохроматографического анализа 77
3.6. Испытание иммуноферментной тест системы 79
3.6.1. Анализ бактериальных штаммов на токсинообразование 79
3.6.2. Определение термолабильного энтеротоксина в кормах 84
3.6.3. Определение термолабильного энтеротоксина
в биологических образцах 86
Глава 4. Обсуждение результатов 88
Выводы 95
Библиографический список 96
Приложения 118
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время во многих районах земного шара острые диарейные заболевания остаются нерешенной проблемой ветеринарии и медицины. Причинами роста распространенности кишечных инфекций является увеличение спектра микроорганизмов, которые вызывают развитие инфекционных процессов и целый ряд факторов, способствующих повышению вирулентных свойств условнопатогенной микрофлоры.
Установлено, что изменения патогенности у бактерий реализуются на генетическом уровне через мутации и генетические рекомбинации (В.М. Бондаренко, 1999).
Если раньше наиболее известными возбудителями острых кишечных инфекций были Vibrio cholerae, а также патогены из родов Shigella и Salmonella, то в настоящее время все большее этиологическое значение приобретают условнопатогенные энтеробактерии в том числе и Escherichia coli (А.Р. Мавсютов, СВ. Фиалкина, 2002).
Многочисленными исследованиями было установлено, что ведущую роль в патогенезе диарейных заболеваний играют так называемые цитотонические токсины: термолабильный (LT) и термостабильиый (STI, STII) энтеротоксины, синтез которых кодируется плазмидами (Ю.В. Вертиев 1996; В. Spangler 1992; Dallas et al., 1980).
В большинстве случаев от токсикоинфекции страдает молодняк сельскохозяйственных животных, а также пушных зверей. Поскольку токсикоинфекции, обусловленные различными представителями семейства энтеробактерии, наносят серьезный ущерб сельскому хозяйству (Д.Д. Новак, Т.А. Гришина, И.И. Сидорчук и др., 1995), актуальной задачей является борьба с ними.
Серьезная роль в борьбе с токсикоинфекциями отводится их ранней диагностике. Поскольку нет четкой корреляции между принадлежностью энтеробактерии к той или иной серогруппе и типом продуцируемых ими
токсинов (О.А. Полякова, 1986), возникает необходимость определения энтеротоксина.
Большинство соответствующих биологических тестов трудоемки, характеризуются низкой чувствительностью, неудовлетворительной воспроизводимостью результатов. В случае энтеротоксинов эшерихий это биопроба на мышах-сосунках (Dean et al., 1972), тест отека лап у мышей (R.A. Finkelsein, 1976; Вартанян и др., 1978), тест на изолированной петле кишечника кролика (Evans et al., 1973; Holmgren et al., 1982), результат которых зависит от многих факторов и не всегда объективен. Применяемые для определения LT тесты на культурах клеток (C.N. Kwan 1974; S.T. Donta, 1976; Nozawa et al., 1978) так же мало специфичны.
Вышеперечисленных недостатков лишены иммунохимические методы
определения энтеротоксинов. Оптимальной, на наш взгляд, является
разработка иммуноферментных тест-систем (ИФА) и
радиоиммунологических тест-систем (РИА) для определения энтеротоксинов. ИФА, так же как и РИА, намного более специфичен и чувствителен, чем биологические методы или методы, основанные на преципитации, но не требует применения радиоактивных реагентов. Идеальным инструментом для создания подобных методов индикации энтеротоксинов эшерихий являются моноклональные антитела (мкАт).
В настоящее время за рубежом получены мкАт к LT и ST энтеротоксинам эшерихий (М. Thomson et.al, 1984). Разработаны также твердофазный метод ИФА для определения ST энтеротоксина на основе мкАт и РИА системы для определения LT и ST энтеротоксинов (Yolken et al., 1977).
Учитывая все вышеизложенное, целью нашего исследования является разработка иммунохимических методов для качественного определения термолабильного энтеротоксина в исследуемых образцах.
Оптимальным в данном случае является создание иммуноферментного диагностикума с использованием специфических моноклональных антител.
Цель исследования. Целью настоящего исследования является разработка на основе оригинальных мкАт иммуноферментной тест-системы для качественного определения термолабильного энтеротоксина в исследуемых образцах.
Задачи исследования.
Выделить и очистить препаративное количество термолабильного энтеротоксина эшерихий.
Получить и очистить мкАт к термолабильному энтеротоксину в препаративных количествах.
Изучить возможность создания иммунохроматографической тест-системы (ИХА) на основе мкАт.
Разработать на основе мкАт специфическую и высокочувстви гельную иммуноферментную тест-систему для качественного определения термолабильного энтеротоксина.
Провести лабораторные испытания разработанной иммуноферментной тест-системы.
Научная новизна исследования.
Новизна настоящего исследования состоит в следующем:
С целью увеличения выхода высокоочищенного термолабильного энтеротоксина эшерихий модифицирована схема его выделения и очистки.
Показана принципиальная возможность разработки на основе мкАт иммунохроматографического диагностикума для определения термолабильного энтеротоксина.
Впервые разработана с использованием оригинальных мкАт иммуноферментная тест-система для качественного определения термолабильного энтеротоксина.
Практическая значимость. На основе проведенных исследований разработан технологический регламент на иммуноферментную тест-систему для качественного определения термолабильного энтеротоксина (LT-ИФА-ТЕСТ). Разработанная тест-система может быть использована при исследованиях биологического материала в ветеринарной и медицинской практике на наличие LT-подобных токсинов.
Результаты исследований использованы при написании нормативно-технической документации по изготовлению и применению диагносгикума для определения термолабильного энтеротоксина (утвержден Секцией пушного звероводства РАСХН протокол №6 от 20 сентября 2005).
Основные положения, выносимые на защиту. Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:
-результаты модифицированной схемы по выделению и очистке термолабильного энтеротоксина эшерихий;
-результаты качественного определения LT-подобных токсинов иммуноферментной тест-системой, разработанной на основе оригинальных мкАт;
-результаты качественного определения термолабильного энтеротоксина с помощью иммунохроматографической тест-системы;
-результаты лабораторных исследований по обнаружению термолабильного энтеротоксина в образцах кормов и пробах фекалий с помощью иммуноферментной тест-системы.
Токсины энтеробактерий
Под токсинами в настоящее время понимают любые регуляторные элементы, действующие в гетерологичных клеточных системах вне их контроля и сдвигающие равновесие протекающих в них физиологических процессов (Вертиев Ю.В., 1996). Попадающие под это определение биомолекулы бактериального происхождения дифференцируют на четыре группы (Finlay et al., 1997):
1) Токсины, действующие ни цитоплазматическую мембрану клетки-мишени. Это гетерогенные бактериальные белки, связывающиеся с поверхностными молекулами клетки-хозяина и/или формирующие поры в ее цитоплазматической мембране. К ним относятся термостабильные энтеротоксины и транзиентные пороформирующие токсины (RTX). RTX-токсины представлены белками, имеющими повторы (repeats in toxin). К ним относятся цитолизины, метал лопротеазы и липазы большинства грамотрицательных бактерий. В зависимости от клеток-мишеней RTX-токсины подразделяют на RTX-гемолизины, оказывающие токсическое действие как на эритроциты, так и на клетки других типов, и RTX-лейкоцитолизины, эффект которых видоспецифичен. RTX-токсины обнаружены у Escherichia, Proteus, Morganella. Их примером може г служить гемолизин Е. coli (а-Н1у), активация которого приводит к формированию нестабильных пор диаметром 2-3 нм, через которые осуществляется катионспецифичный транспорт и осмотический лизис клетки (Dickinson et al., 1995).
2) А/В-субъединичные токсины. Это белки, состоящие из функциональных субъединиц А и В. Токсический эффект оказывает ферментативно активная субъединица А. Ее трансмембранный транспорт осуществляется благодаря конформационным изменениям, инициируемым субъединицей В (Merrit et al., 1995). Среди токсинов этой іруппьі у представителей семейства Enterobacteriaceae обнаруживаются:
а) Шига-токсин у Shigella disenteriae и шига-подобные токсины у энтерогеморрагических Е. coli.
б) Термолабильные энтеротоксины энтеротоксигенных Е. coli.
в) Цитолетальные токсины Shigella flexneri и Е. coli. Эффект действия цитолетальных "вспенивающих" токсинов (cytolethal distending toxins - CDT) на культуру клеток проявляется вспениванием мембраны и фрагментацией ядерного материала клеток с последующим значительным увеличением в размере и гибелью пораженных клеток. Токсины данной группы блокируют фазу G2 клеточного цикла и нарушают клеточный пролиферативный процесс. Наиболее чувствительны к CDT энтеробактерий быстрообновляющиеся клетки кишечных крипт, которые в результате воздействия токсина утрачивают способность к созреванию и дифференцировке.
г) Цитотоксический некротизирующий фактор (CNF) Е. coli. Эффект токсического действия CNF заключается в активирующем модифицировании Rho-подсемейства небольших ГТФ-связывающих белков, регулирующих образование цитоскелета. В итоге их воздействие приводит к сокращению волокон актина и последующей складчатости цитоплазматической мембраны клетки-хозяина.
3) Инъекционные токсины, транспортируемые по типу секреции III типа. В настоящее время эти токсины описаны только у грамотрицательных бактерий. Среди них дифференцируют:
а) Токсины, индуцирующие процессы фосфорилирования/ дефосфо-рилирования. Токсины, влияющие на процесс фосфорилирования тирозина, представлены протеинкиназами YopH и YopO Y.enterocolitica и YpkA Y.pseudotuberculosis и Y.pestis. YopH осуществляет ингибирование процесса фагоцитоза у клеток хозяина, благодаря чему этот токсин рассматривают как наиболее важный фактор патогенности Y. sp. Клеточные мишени для YopO YpkA не известны, но мутантные по этим белкам бактерии непаюгенны (Endoetal., 1998).
б) Токсины, участвующие в активации/инактивации Rho ГТФаз. К этому разряду токсинов относятся SopE, SptP Salmonella sp. и YopE Yersinia sp. Эти белки через активацию Rho ГТФазы обуславливают перестройку актина и его фрагментацию, в результате чего мембрана клетки-хозяина теряет свою нормальную форму.
в) Токсины, транслоцирующие рецептор для интимина (Tir). К токсинам данного разряда относится Тіг-протеин энтеротоксигенных штаммов E.coli. Имея два потенциальных трансмембранных домена, этот белок в условиях внутренней среды организма человека интегрирует в мембрану энтероцита и выступает в дальнейшем в качестве рецептора для фактора прикрепления интимина E.coli. Фосфорилирование С-терминального участка Тіг-протеина, включенного в мембрану, вызывает гранулирование актина, конденсирование его под бактерией с формированием так называемого "пьедестала" (Бондаренко, 1999; Kenny et al., 1997).
г) Инвазины. К этому разряду относят белки IpaA, IpaD и VirA Shigella sp. Экспрессия этих белков коррелирует со способностью этих бактерий к температурозависимой инвазии эпителиоцитов и межкле і очному распространению.
д) Токсины, индуцирующие метаболизм инозитола. Такие токсины этой найдены у S.dublin, Shigella flexneri и S.typhimurium. Они учасівуют в гидролизе нескольких фосфолипидов инозитола. Высвобождение фосфатидилинозитол- трифосфата обуславливает секрецию СГ и развитие диареи.
Материалы и методы
В работе использовались лабораторные штаммы E.coli С 600 и его производные, холерный токсин (Sigma, США), В-субъединица холерного токсина (Sigma, США), А-субъединица холерного токсина (CALBIOCI1EM, США), а так же коллекция штаммов энтеробактерий, изолированных от пушных зверей, сельскохозяйственных животных, человека и выделенных из объектов окружающей среды.
В работе использовали следующие антибиотики: ампицилин, тетрациклина гидрохлорид, стрептомицина сульфат, канамицина сульфат.
Лабораторные животные
В работе использовали беспородных лабораторных мышей и крыс, а так же инбредных мышей линии BALB/c. Для получений поликлональных антител использовались кролики породы советская шиншилла. При работе с экспериментальными животными руководствовались «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) Приказе МЗ РФ №267 от 19.06.2003, «Об утверждении правил лабораторной практики»
Среды для культивирования микроорганизмов и очных культур
Для культивирования микроорганизмов использовались среда Луриа-Бертани (LB) следующего состава:_1% бакто-триптон, 0,5% бакт-дрожжевой экстракт, 1% NaCl); агаризованая среда Луриа-Бертани (LA) содержала 1% бакто-триптон, 0,5% бакто-дрожжевой экстракт, 1% NaCl, 2% ai ар-агар.
Для культивирования клеток гибридом использовали среду RPMI-1640, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки іибридом
хранили в жидком азоте в среде следующего состава, 10% RPMI, 1% сыворотка 0,5% DMCO.
В работе были использованы следующие буферные растворы: 1-х PBS (Na2HP04 х 12 Н20, NaCl, КС1, КН2Р04), буфер для экстракции термолабильного энтеротоксина 0,05М TRIS-HCL, 0,15М NaCl, 12М мочевина, при проведении гель-фильтрации препаратов термолабильного токсина использовались буфера следующего состава: TNN буфер (1М 1RIS-HCL, 4М NaCl, ImM NaN3), TNM буфер 50mM TRIS-HCL, 0,15M NaCl, 8M мочевина. Для аффинной хроматографии LT использовали ТМ буфер (1М TRIS-HCL, ЇМ MgCl2), TMN буфер (ЮтМ TRIS-HCL, ЇМ MgCU,4M NaCl).
Для постановки иммуноферментного анализа исиольювачись следующие буфера: для посадки моноклональных антител на планшет буфер 0,05 М Na2HP04 х 12 Н20, 0,1 М цитрат Na рН 3,2 для посадки LT; буфер рН 9,6 (0,05 М Na2HP04 х 12 Н20, 0,1 М цитрат Na), для блокирования неспецифического связывания: 1% раствор БСА, ICN Biomedicals, Inc. Для промывки планшетов использовался промывочный буфер следующего состава: 0,05% TWEEN-20, 1% PBS, 0,02% NaN3. Для разведения термолабильного энтеротоксина применялся фосфатный буферный рас і вор, содержащий 0,05% желатин, 1-х PBS, 20% мертиолат, 1 мі 7пС12. Для проявления реакции в иммуноферментном анализе использовался тетраметилбензидин, а для выявления иммунореплики в имуноблотинге орто-фенилдиамин и диаминобензидин.
При постановке денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле использовались: готовый раствор акриламида, буферный рас і вор 1RIS-НС1 рН 8,8, 1,25 М TRIS-HC1 рН 6,8. 10%-ный раствор додецилсульфата натрия, 10 %-ный раствор персульфата аммония, 10 х злекіродньїй буфер содержащий; 14% глицина; 3% TRIS-HC1 рН 6,8 и 1% додецил сульфата натрия; буфер для нанесения проб 1,25 М TRIS-HC1 рН 6,8, 0,5% додецил сульфата натрия 5% 2-меркаптоэтанол, 10% глицеролл и 0,05% бромфенолово синего. Отмывочный раствор: 10% ледяная уксусная кислота, 5% изопропанол.
В иммуноблотинге использовались следующие буферные растворы: Буфер для переноса 20% этанол, 20mM TRIS, 150 тМ глицин, блокирующий буферный раствор 5% BSA, 25mM TRIS, 125 тМ NaCl, буфер для отмывки содержал 0,1 % TWEEN-20,25mM TRIS, 125 тМ NaCl.
Выделение и очистка термолабильного энтеротоксина эшерихии
Первым этапом нашей работы было получение препаративных количеств биомассы штамма-продуцента E.coli LT5, содержащего гибридную плазмиду pLT5 с полноразмерным elt-опероном. Ночную агаровую культуру штамма-продуцента инокулировали в пробирку, содержащую 2 мл среды LB с 50 мкг/мл тетрациклина для предотвращения элиминации гибридной плазмиды, и культивировали в течение 4,5 часов в термостатируемом шейкере при 37 С и 250 об/мин. Полученный инокулят вносили в двух литровые колбы, содержащие 500 мл той же среды, из расчета 10 микробных клеток на колбу. Культивирование проводили в течение 24 часов при 37 С и 180 об/мин, выросшую биомассу штамма-продуцента осаждали центрифугированием на центрифуге Becman JA-21 при 10000 об/мин в течение 30 минут. Супернатант удаляли, а полученную биомассу ресуспензировали в экстракционном буфере.
. Получение грубых экстрактов штамма-продуцента
Разрушение клеток штамма-продуцента проводили при помощи ультразвука на дезинтеграторе Sonic Desmembrator. Обработку клеток биомассы проводили дробно 25 раз по 30 секунд с 1,5 минутным интервалом, следя за тем, что бы температура не превышала 10 С. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 15000 об/мин в течение 40 минут на центрифуге Becman.
Фракционирование грубого экстракта сульфатом аммония
Согласно литературным данным (Давыдова Л.И. 1998 г), термолабильный энтеротоксин эшерихий осаждается в диапазоне концентрации сульфата аммония от 30 до 55%. Само фракционирование проводили следующим образом: к грубому экстракту добавляли сухой сульфат аммония до конечной концентрации 30% при постоянном помешивании, следя за поддержанием физиологических значений рН. В случае закислення среды значение рН доводили до физиологического значения 7,5 - 7,6 добавлением водного раствора аммиака. После растворения сульфата аммония препарат выдерживали при 4 С для образования осадка. Полученный осадок отделяли центриф іированием при 15000 об/мин в течение 40 минут и удаляли, а к надосадку добавляли сухой сульфат аммония до 55% насыщения, выдерживали при вышеуказанных условиях для образования осадка. Осадок, содержащий термолабильный токсин, отделяли центрифугированием и растворяли в минимальном количестве буфера TMN.
Очистка препарата токсина посредством гель-фильтрации
Растворенный сульфат аммонийный осадок наносили на колонку с Sepharose 6В (Pharmacia) объемом 295 см , предварительно уравновешенную TNM буфером. Хроматографию проводили при 4 С со скоростью 30 мл/час. Отбирали фракции по 10 мл, наличие энтеротоксина в аликвоге определяли в реакции двойной радиальной иммунодифузии по методу Ухтерлони (Рис. 2). Результаты исследований отражены в таблице №1.
