Введение к работе
1. 1.1. Актуальность темы. Mycoplasma hyopneumoniae является этиологическим агентом энзоотической пневмонии (ЭП) свиней. Ей также принадлежит важная роль в развитии респираторного симптомокомплекса свиней (РСКС) - многокомпонентного заболевания, являющегося одной из наиболее актуальных проблем современного свиноводства [12,25].
В качестве инфекционного агента, вызывающего ЭП свиней, М. hyopneumoniae была определена Goodwin et al., Маге и Switzer в 1965 году [1, 11]. Заболевание распространено во всем мире [16]. Экономический ущерб от энзоотической пневмонии свиней составляет в странах с развитым свиноводством до одного миллиарда долларов в год [8, 20]. В некоторых странах проведенные исследования выявили поражения, типичные для хронической формы заболевания, у 80% поросят группы откорма [26].
Коинфицирование свиней микоплазмами и другими патогенами (прежде всего такими, как вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней, цирковирус свиней второго типа, вирус гриппа свиней, Pasteurella multocida, Haemophilus parasuis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Streptococcus suis) отягощает проявление основных симптомов пневмонии и приводит к формированию респираторного симптомокомплекса свиней. РСКС наносит значительный экономический ущерб свиноводству во всем мире. В различных хозяйствах заболеваемость поросят может достигать 30-70%, а летальность - 15% в зависимости от количества ассоциированных инфекционных агентов [13].
Эффективность мер по борьбе с респираторными заболеваниями, ассоциированными с М. hyopneumoniae, во многом зависит от своевременной их диагностики, которая основывается на
эпизоотологических данных, клинических признаках болезни, результатах патологоанатомического вскрытия и лабораторных исследований.
1.2. Степень разработанности проблемы. На настоящий момент
иностранными авторами разработано несколько тест-систем, основанных
на иммунофлюоресцентных, иммуногистохимических методах [14, 18, 22]
и на различных модификациях ПЦР, позволяющих выявлять М.
hyopneumoniae в носовых, трахеобронхиальных смывах, а также в
легочной ткани [7, 9, 10, 24, 27]. Также за рубежом осуществляют
серодиагностику микоплазменной инфекции с использованием реакций
агглютинации, связывания комплемента и ИФА в различных вариантах
[15,17,19,21].
В России до текущего времени не было разработано надёжных и достоверных диагностических методов по обнаружению М. hyopneumoniae. Слабоизученным оставался широкий круг проблем, связанных с этим видом микоплазм: масштабы распространения М. hyopneumoniae в свиноводческих хозяйствах и дикой фауне РФ, ее роль в развитии РСКС в российских свиноводческих хозяйствах, филогенетичекие особенности отечественных изолятов бактерии.
1.3. Цели и задачи исследования.
Цель данной работы состояла в разработке методов обнаружения М. hyopneumoniae и антител к ней, а также в применении разработанных методов для изучения распространения этого вида микоплазм на территории РФ и его роли в респираторных болезнях свиней в российских хозяйствах.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- разработать методы обнаружения ДНК М. hyopneumoniae, основанные на ПЦР;
- применить разработанные методы в диагностических исследованиях;
- провести филогенетический анализ полевых изолятов М.
hyopneumoniae;
получить рекомбинантный видоспецифичный белок М. hyopneumoniae и разработать на его основе непрямой вариант иммуноферментного анализа (н-ИФА) для выявления антител к данному инфекционному агенту в сыворотках крови свиней;
- провести с использованием разработанного иммуноферментного
метода серомониторинг микоплазменной инфекции и определить статус
российских свиноводческих хозяйств.
- изучить распространение М hyopneumoniae в дикой фауне РФ.
1.4. Научная новизна исследований. Впервые в РФ разработан метод обнаружения ДНК М. hyopneumoniae, основанный на ПЦР с электрофоретической детекцией.
Впервые в России разработан метод количественного обнаружения ДНК М hyopneumoniae, основанный на ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ).
Проведен филогенетический анализ полевых изолятов М. hyopneumoniae.
Впервые в РФ получен рекомбинантный видоспецифичный белок р65 М. hyopneumoniae, и на его основе разработан непрямой вариант иммуноферментного анализа для выявления антител к М. hyopneumoniae.
Проведён мониторинг микоплазменной инфекции свиней, показано широкое распространение М. hyopneumoniae в свиноводческих хозяйствах и дикой фауне РФ.
С использованием непрямого варианта ИФА определен серологический статус более 5 тысяч племенных свиней, ввезенных в
Россию в 2005-2009 гг из Канады и европейских стран, в отношении микоплазменной инфекции.
1.5. Практическая значимость исследований. В результате
проведённых исследований утверждены следующие нормативные
документы:
«Методика обнаружения антител к Mycoplasma hyopneumoniae в непрямом варианте иммуноферментного анализа», одобренная учёным советом и утверждённая директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 08.02.2006 г.;
«Методика обнаружения Mycoplasma hyopneumoniae с использованием полимеразной цепной реакции», одобренная учёным советом и утверждённая директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 20.03.2006 г.;
«Методические указания по выявлению и количественному анализу Mycoplasma hyopneumoniae методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», одобренная учёным советом и утверждённая директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 10.03.2010 г.
Разработанные методики и методические указания используются при проведении диагностических и мониторинговых исследований для выявления М. hyopneumoniae и антител к ней.
-
Публикации научных исследований. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе три работы в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
-
Апробация работы. Материалы диссертации представлены, опубликованы и обсуждены на научно-практической конференции "Ветеринарное обеспечение свиноводства: современное состояние и пути развития" (Харьков, 2005 г.), в материалах международной научно-практической конференции "Современные проблемы ветеринарной медицины в свиноводстве" (Киев, 2006 г.), на XV московском международном ветеринарном конгрессе по болезням мелких домашних
животных "Проблемы инфекционной патологии свиней" (Москва, 2007 г.), а также на заседаниях учёного совета ФГУ "Федеральный центр охраны здоровья животных" в период 2005-2009 гг.
1.8. Личный вклад:
Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывали следующие сотрудники лаборатории диагностики особо опасных инфекций: к.б.н. А. С. Яковлева, к.в.н. А. В. Каньшина, к.в.н. А. М. Тимина, заведующий лабораторией, к.б.н. А. В. Щербаков.
1.9. Основные положения, выносимые на защиту:
Метод обнаружения ДНК М. hyopneumoniae, основанный на ПЦР с электрофоретической детекцией.
Метод количественного обнаружения ДНК М. hyopneumoniae, основанный на ПЦР в реальном времени.
Филогенетический анализ полевых изолятов М. hyopneumoniae.
Рекомбинантный видоспецифичный белок М. hyopneumoniae и разработанный на его основе непрямой вариант ИФА для выявления антител к микоплазме.
Результаты использования разработанных методов при проведении диагностических и мониторинговых исследований микоплазменной инфекции.
1.10. Структура и объём работы. Диссертация изложена на 134
страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы,
результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение и
выводы. Список используемой литературы включает 215 источников, из
которых 185 иностранных. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 17
рисунками.
