Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 7
2. Обзор литературы 12
2.1. Эпизоотическая ситуация по АЧС 12
2.1.1. Пути распространения вируса АЧС 13
2.2. Патогенез и клинические проявления болезни 17
2.3. Характеристика вириона 19
2.3.1. Химические и физические свойства 19
2.3.2. Геном вируса АЧС 19
2.3.3. Полипептидный состав 27
2.3.4. Таксономическая принадлежность вируса АЧС 34
2.4. Лабораторная диагностика АЧС 35
2.4.1. Генотипирование вируса АЧС 38
2.5. Системы экспрессии для получения рекомбинантных белков 41
2.5.1. Экспрессирующие векторы, используемые в клетках Е. coli 43
2.5.2. Экспрессирующие векторы, используемые в клетках дрожжей 45
2.5.3. Эукариотические векторы, используемые в клетках животных 46
2.5.4. Очистка и иммобилизация гибридных белков 48
2.6. Применение рекомбинантных белков в диагностике АЧС 49
2.7. Заключение по обзору литературы 54
3.Собственные исследования 55
3.1. Материалы и методы 55
3.1.1. Препараты вирусной ДНК 55
3.1.2. Ферменты 56
3.1.3. Растворы и реактивы 56
3.1.4. Штаммы Е. coli 59
3.1.5. Сыворотки 59
3.1.6. Антигены 60
3.1.7. Лабораторное оборудование 60
3.2. Методы 60
3.2.1. Очистка вируса АЧС 60
3.2.2. Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей 61
3.2.3. Полимеразная цепная реакция 61
3.2.4.Электрофорез ДНК 62
3.2.5. Рестрикция ДНК 62
3.2.6. Лигирование 62
3.2.7. Электропорация 62
3.2.8. Выделение плазмидной ДНК 63
3.2.9. Электрофорез белков 63
3.2.10. Иммуноферментный анализ 64
4. Результаты исследований 65
4.1. Клонирование генов рЗО и р72 вируса АЧС 65
4.1.1. Выбор участков и подбор праймеров для получения ПЦР-продуктов, содержащих последовательности генов р30ир72 65
4.1.2. Оптимизация ПЦР для получения продуктов, содержащих последовательности генов рЗО и р72 69
4.1.3. Применение праймеров p30F/R и p72F/R для выявления ДНК вируса АЧС 73
4.1.4. Чувствительность метода ПЦР 77
4.1.5.Выявление вирусной ДНК в пробах органов инфицирован ных животных 78
4.2. Клонирование и экспрессия генов рЗО и р72 80
4.2.1. Рестрикция ПЦР-продуктов и плазмидного вектора 80
4.2.2. Выделение тела плазмиды из геля агарозы 80
4.2.3.Трансформация лигазной смесью компетентных клеток Е. СОІІМ15 81
4.2.4. Скрининг рекомбинатных клонов 82
4.2.5. Экспрессия гибридных белков в клетках E.coli 87
4.2.6. Очистка гибридного белка, содержащего целлюлозо-связывающий домен 91
4.3. Использование рекомбинантного белка рЗО для выявления антител к вирусу АЧС в сыворотках крови свиней на основе непрямого варианта ИФА 92
4.3.1. Проверка активности и специфичности рекомбинатного антигена 95
5. Обсуждение результатов исследований 98
6. Выводы 107
- Патогенез и клинические проявления болезни
- Системы экспрессии для получения рекомбинантных белков
- Методы
- Клонирование и экспрессия генов рЗО и р72
Введение к работе
Актуальность проблемы
Вирус африканской чумы свиней (АЧС) - крупный икосаэдрический оболочечный ДНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Asfarviridae [87]. По структуре и механизму репликации генома вирус АЧС имеет сходство с поксвирусами [223].
АЧС является особо опасной болезнью домашних свиней, характеризующейся сильной лихорадкой, геморрагиями, слабостью, цианозом кожи ушных раковин, подгрудка, живота, пятачка и конечностей. Высоковирулентные штаммы вируса вызывают смертность, близкую к 100%. Болезнь протекает сверхостро, остро, подостро и хронически [1, 10, 22, 80, 83, 139, 150]. При сверхострой форме первым признаком болезни является внезапная гибель животных. При остром и подостром течении животные обычно гибнут через 2-14 суток после появления первых клинических признаков. Выжившие животные остаются в течение всей жизни вирусоносителями или хронически больными АЧС. Хроническая форма длится от 2 до 10 месяцев и сопровождается исхуданием, признаками пневмонии, артрита, обострениями болезни и гибелью [11, 80, 83, 150]. Вирус АЧС поражает клетки системы мононуклеарных фагоцитов, включая тканевые макрофаги и ретикулярные клетки селезёнки, лимфатических узлов, лёгких, почек и печени.
Средства специфической профилактики при АЧС не разработаны. Во многом это объясняется биологическими свойствами вируса. Полевые штаммы вируса АЧС обычно являются гетерогенными поликлональными популяциями, различающимися по вирулентности, гемадсорбирующим, антигенным и иммунобиологическим свойствам, что свидетельствует о его многотиповой вариабельности. Выделение вируса с использованием чувствительных животных и культур клеток требует длительного времени и специально оборудованных помещений, имеющих определенный уровень защиты для работы с возбудителями особо опасных инфекций. Всё это обусловливает трудность борьбы с АЧС и необходимость совершенствования противоэпизоотических мероприятий на основе новейших научных достижений [20].
Выявление умеренно вирулентных изолятов АЧС, вызывающих невысокий уровень смертности, но высокий уровень заболеваемости, часто основывается на обнаружении специфических антител [92, 160]. Однако, стандартизация диагностикумов на основе поликлональных антител, выделенных из сывороток крови гипериммунных свиней, часто бывает затруднительной, вследствие различия в физиологическом статусе доноров иммуноглобулинов, появления у них аутоантител. Производство таких препаратов требует больших затрат и сопряжено с необходимостью создания жёстких санитарных условий при содержании инфицированных животных.
В связи с этим одним из основных путей оперативной и ретроспективной диагностики АЧС, эпизоотологического мониторинга, изучения антигенной структуры и вариабельности вируса является разработка современных высоко специфических методов лабораторной диагностики, способных составить одно из определяющих звеньев комплексной программы по профилактике и контролю АЧС. Возможным решением этой задачи может стать технология получения рекомбинантных белков вируса АЧС, предоставляющая следующие преимущества по сравнению с методами, базирующимися на получении антигена из экстракта инфицированных клеток:
1) исключается использование живого вируса для получения антигена (безопасность);
2) компоненты культур клеток не контаминируют антиген;
3) отпадает необходимость инактивации вируса, что сохраняет нативными конформационные эпитопы антигена;
4) позволяет стандартизировать антиген.
Цели и задачи исследования
В связи с выше сказанным основной целью исследований являлось клонирование и экспрессия рекомбинантных антигенов рЗО и р72 вируса АЧС, являющихся облигатными индукторами антителогенеза, пригодных для использования в ИФА.
Для этого необходимо было решить следующие задачи:
1) Определить участки генов, кодирующих иммунореактивные последовательности мажорных антигенов рЗО и р72 вируса АЧС;
2) Рассчитать праймеры и оптимизировать полимеразную цепную реакцию для получения ПНР-продуктов, содержащих нуклеотидные последовательности генов рЗО и р72 вируса АЧС;
3) Создать генно-инженерные конструкции, экспрессирующие белки рЗО и р72;
4) Оптимизировать условия наращивания, выделения и очистки рекомбинантных белков рЗО и р72 в прокариотическом векторе;
5) Оценить пригодность рекомбинантных белков для использования их в качестве антигена для постановки серологических реакций.
6) Определить возможность использования праймеров,
комплементарных гену рЗО, для выявления ДНК вируса АЧС в различных вируссодержащих материалах.
Научная новизна
Получены рекомбинантные белки рЗО и р72 вируса АЧС в составе плазмидного вектора рТТ9, содержащего целлюлозосвязывающий домен, который позволяет быстро выделить и очистить белок из клеток Е. соН с помощью сорбции на целлюлозной матрице.
Рекомбинантный антиген рЗО пригоден для выявления антител к вирусу АЧС в непрямом варианте ТФ ИФА и не реагирует с сыворотками, специфичными к гетерологичным вирусам.
Показана возможность использования полимеразной цепной реакции, целевым геном которой является рЗО, для выявления ДНК вируса АЧС в различных вируссодержащих материалах.
Практическая значимость работы
Разработанная методика получения рекомбинантного антигена рЗО вируса АЧС в прокариотическом векторе исключает использование для этой цели живого вируса и позволяет выявлять антитела против вируса АЧС в непрямом варианте ТФ ИФА. Антигенная активность и специфичность рекомбинантного белка рЗО была подтверждена комиссионно (акт № 18 от 24.10.03).
Оптимизация условий постановки ПНР на основе амплификации последовательностей гена рЗО позволяет обнаруживать ДНК вируса АЧС у животных с хроническим и латентным течениями болезни, что свидетельствует о пригодности данного метода для экспресс-диагностики АЧС.
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
1. Методика получения рекомбинантного антигена рЗО вируса АЧС.
2. Результаты использования непрямого варианта твердофазного иммуноферментного анализа на основе рекомбинантного белка рЗО для выявления антител к вирусу АЧС.
3. Оптимизация условий постановки полимеразной цепной реакции на основе амплификации последовательности гена рЗО для выявления ДНК вируса АЧС в вируссодержащих материалах.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ (2002-2004 гг.).
Материалы диссертации доложены на IV Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (г. Москва, 2002 г.), Международной научно-практической конференции, посвященной 45-летию института 24-26 сентября 2003 г. «Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов» (г. Покров, 2003 г.).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.
Личный вклад
Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором в основном самостоятельно. В выполнении работы по разделам 4.2.3., 4.2.4., 4.2.5., 4.2.11., 4.2.13., 4.2.14. и 4.2.15. оказывали практическую и консультативную помощь сотрудники ГНУ ВНИИВВиМ: Власова Н.Н., Цыбанова Л.Я., а также сотрудники ВНИИСБ: Лунин В.Г. и Колобова О.С.
Патогенез и клинические проявления болезни
Патогенез инфекции, вызванной вирусом АЧС, характеризуется двумя основными чертами: массированным апоптозом В-клеток и гемморагиями [156, 171, 213]. Клетками-мишенями для вируса АЧС являются клетки системы мононуклеарных фагоцитов: моноциты крови, а также тканевые макрофаги [240]. В этих клетках он подавляет синтез провоспалительных цитокинов, а-интерферона и интерлейкина-8 и, напротив, усиливает выработку противовоспалительных цитокинов и трансформирующего ростового фактора Р [169, 221]. Разрушение макрофагов вызывает высвобождение цитокинов и фактора некроза опухолей (TNF-a), индуцирующих апоптоз сначала Т-клеток, а потом и В- клеток. Усиливая продуцирование противовоспалительных цитокинов, вирус АЧС направляет иммунный ответ в неэффективное русло [227]. TNF-a, помимо индукции апоптоза, увеличивает проницаемость сосудов, нарушает антикоагуляцию, способствуя образованию тромбов [103]. Первым признаком сверхострой формы АЧС является внезапная гибель животных. Клинические признаки при этом сходны с таковыми при острой форме КЧС. При острой форме вирус АЧС вначале инфицирует лимфоидную ткань в области глотки (в случае алиментарного пути заражения), оттуда распространяется к соответствующим лимфатическим узлам, а затем к лимфоидным органам всего организма. Наблюдается лихорадка (40,5— 42С), ранняя лейкопения и тромбоцитопения (48 -72 часов), анорексия, цианоз кожи ушных раковин, подгрудка, живота, пятачка и конечностей, нарушения координации за 24 - 48 часов до гибели, учащённый пульс, нарушения дыхания. Летальный исход наступает через 6-13 дней, иногда через 20. Смертность среди домашних свиней достигает 100%. Выжившие животные остаются пожизненными вирусоносителями [1, 10, 22, 80, 83, 150]. При подострой форме клинические признаки менее выражены. Смерть наступает через 15-45 дней и составляет 30-70%. Патогенез хронической формы АЧС характеризуется потерей веса, некрозами кожи, лихорадкой, отёками суставов, пневмонией и фибринозными перикардитами [82]. Иногда длительность может составлять 15 месяцев. Характерен низкий уровень смертности. Хроническую форму АЧС наблюдали при применении живых вакцин в Испании и Португалии в 1962-1963 гг. [185, 1963]. У домашних свиней африканских пород и их диких сородичей болезнь протекает без клинических признаков.
Клинические и патологоанатомические признаки у дикого европейского кабана и домашних свиней при АЧС сходны [46, 84, 110]. 2.3. Характеристика вириона 2.3.1. Химические и физические свойства Вирион состоит из нуклеопротеиновой коровой структуры, диаметром 70-100 нм, окружённой внутренним липидным слоем, икосаэдральным капсидом, имеющим диаметр 172-191 нм, и внешней липосодержащей оболочкой. Внеклеточные оболочечные вирионы имеют диаметр 175-215 нм [56; 74]. Плавучая плотность в перколле - 1,095 г/см3, в CsCl - 1,19-1,24 г/см3 [79]. Вирион чувствителен к хлороформу, эфиру, дезоксихолату, облучению, инактивируется при 60С в течение 30 минут, а при 4С сохраняется в течение нескольких лет [10; 80]. Инфекционность вируса сохраняется в диапозоне рН 4-13 [167]. Вирус инактивируется дезинфектантами (1%-ным формальдегидом - за 6 суток, 2%-ным NaOH -за 1 сутки), очень эффективны парафенилфенольные соединения [16; 87]. 2.3.2. Геном вируса АЧС Работами Larenaudie В. [123], Plowright W. [166] и Lucas А. [127] было показано, что вирус АЧС содержит ДНК. Геном вируса АЧС представлен двунитевой ДНК, размеры которой варьируют от 170 до 190 тыс. п.о. [57]. На концах ковалентно замкнутого генома имеются шпильки из 37 нуклеотидных остатков, за которыми расположены терминальные инвертированные повторы длиной до 100 п.о. [107, 155]. Sogo J.M. [200] обнаружил у изолята BA71V терминальные инвертированные повторы общей длиной 2134 п.о. При этом 82% повторов состояли из 5 коротких (27-35 нулеотидов) тандемных наборов [81]. Вирус осповакцины также содержит подобные повторы длиной 10 тыс. п.о. Эти факты позволили Dixon L.K. [85] сделать вывод о сходстве механизма репликации вируса АЧС и поксвирусов. Содержание GC-nap несколько выше, чем у поксвирусов (39%) [91]. Интенсивные исследования структуры генома вируса АЧС привели к накоплению большого количества информации о нуклеотидных последовательностях вирусных генов и, следовательно, об аминокислотных последовательностях соответствующих им белков [12, 25, 26, 28, 61, 63, 64, 69, 118, 124, 126, 140, 145, 146, 147, 148, 197, 207, 209, 230, 231, 232, 233, 237,239]. При исследовании физических карт генома вируса АЧС было установлено, что его центральная часть (около 70%) является высококонсервативной, а терминальные участки существенно различаются по своей структуре у разных изолятов [19, 81, 86, 89]. При изучении транскрипционных и трансляционных карт было выяснено, что как РНК, синтезируемая в клетках Vero, инфицированных вирусом АЧС, в присутствии ингибиторов синтеза белка, гибридизуются преимущественно в четырёх зонах с координатами Е1 (0-51,9 тыс. п.о.), ЕЗ (63,7-75,2 тыс. п.о.), Е5 (100,1-111,6 тыс. п.о.) и Е7 (150-170 тыс. п.о.), где Е означает «early» («ранние»). После репликации ДІЖ синтезируются новые РНК, которые гибридизуются с участками ДНК, не транскрибируемыми in vitro или в инфицированных клетках, в присутствии ингибиторов синтеза ДНК и белка. Эти зоны были обозначены как L2 (51,9-63,7 тыс. п.о.), L4 (75,2-100,1 тыс. п.о.) и L6 (111,6-150 тыс. п.о.) (L «late» - «поздние»). Гены поздних белков расположены внутри большой центральной зоны (35,7 - 153,7 тыс. п.о.), и только Есо RI - L фрагмент левой концевой области кодирует специфические поздние полипептиды [85, 211, 223]. В настоящее время известна полная нуклеотидная последовательность вируса АЧС (изолят В А 7IV) [232], а так же последовательности многих генов структурных белков различных штаммов вируса. Установлено, что около 150 открытых рамок считывания расположены в центральной части генома близко друг к другу (межгенное расстояние обычно менее 200 п.о.) и читаются с обеих цепей ДІЖ. В терминальных вариабельных областях генома вируса АЧС выявлены мультигенные семейства 100, ПО и 360, а так же два новых мультигенных семейства (МГС) 505 (530 для изолята Malawi Lil-20/l) и 300 [34, 36, 235, 238]. МГС-530 содержит, по крайней мере, 6 различных рамок считывания, кодирующих в среднем 530 аминокислот, содержащих 4 высоко консервативных домена [238]. МГС-300 состоит из 3 открытых рамок трансляции, кодирующих в среднем 300 аминокислот, содержащих 3 высококонсервативных домена. Аминоконцевые области белков, кодируемых МГС-530 и 300, обладают значительным сходством друг с другом, а также с соответствующими областями, охарактеризованным ранее МГС-360. МГС-110 и 300 локализованы на левом концевом участке, МГС-100 на правом, а МГС-360 и 505 - на обоих концах генома [34, 36, 235].
Терминальные участки генома у различных изолятов сильно варьируют по размеру вследствии гомологичной и негомологичной рекомбинации, приводящей к делециям генов нескольких мультигенных семейств. Потеря участков генома может сопровождаться снижением вирулентности (например, для вирулентного штамма Ф-32 и его авирулентного делеционного мутанта ФК-135) (18, 19). Neilan J.G. [149] идентифицировал в левом вариабельном регионе генома вируса АЧС детерминанту вирулентности, состоящую из генов МГС-360 и МГС-530. При изучении изолятов вируса АЧС MS 16 и BA71V, адаптированных к культурам клеток обезьян MS и Vero обнаружено, что они теряют способность реплицироваться в культурах клеток макрофагов свиньи, вызывая их раннюю гибель. В опытах по спасению маркера, космида, содержащая фрагмент из левого конца генома патогенного изолята Е70, размером 38 тыс. п.о., полностью восстанавливала рост обоих вирусов в макрофагах свиньи. Этот фрагмент содержит гены МГС-360 и МГС-530, которые являются генами, определяющими круг хозяев, существенными для выживания инфицированных макрофагов [238]. Гены вируса АЧС по времени их экспрессии подразделяют на 3 основных класса: ранние, промежуточные и поздние. Все 3 класса генов транскрибируются одной и той же вирусной РНК-полимеразой. Для каждого из класса генов характерна своя определенная последовательность, то есть специфичность взаимодействия РНК-полимеразы с разными типами промоторов определяются дополнительными белковыми факторами [178]. Синтез ранних вирусных полипептидов, раздевание вириона и последующая репликация ДНК необходимы для активации пострепликативных генов вируса АЧС. Сразу после репликации вирусной ДНК транскрибируются промежуточные гены даже в отсутствие белкового синтеза.
Системы экспрессии для получения рекомбинантных белков
Синтез белков, предназначенных для проведения тех или иных исследований или для применения в медицине и промышленности, - это одна из самых первых задач, которые ставились при разработке технологии рекомбинантных ДНК. В настоящее время ряд поступающих в продажу ферментов, используемых для конструирования рекомбинантных молекул ДНК, в свою очередь синтезируются под контролем генов, клонированных в плазмидных векторах Е. coli. Использующиеся при этом препараты имеют высокую степень очистки, относительно недороги. С помощью методов клонирования были получены важные в клиническом отношении белки, которые трудно было получить иным способом. Были синтезированы белки, кодируемые некоторыми вирусами животных (в том числе вирусами человека, такими, как вирус гепатита В) и простейшими (например, Plasmodium falciparum, возбудителем малярии человека). Они использовались в качестве антигенов в некоторых вакцинах [100, 199, 229, 234]. Для экспрессии уже клонированного гена выбор хозяина имеет такое же большое значение, как и при самом клонировании. Наиболее подходящими хозяевами для получения белка часто оказываются клетки Е. coli, поскольку с ними просто манипулировать и их легко выращивать в больших объемах. После открытия интронов, прерывающих кодирующие участки многих эукариотических генов, для использования в экспрессирующих векторах чаще стали применять клонированные кДНК, а не сами гены. Однако при синтезе активных форм определенных эукариотических белков в клетках Е. coli возникает ряд проблем. Так, первичные продукты трансляции некоторых эукариотических генов должны подвергнуться специфическим посттрансляционным модификациям, прежде чем образуются функциональные молекулы. Обычно эти модификации состоят в протеолизе, фосфорилировании, ацетилировании и гликозилировании. Ферменты, катализирующие эти реакции в клетках Е. coli обычно отсутствуют [138]. Векторы, предназначенные для эффективной транскрипции и трансляции клонированного сегмента, содержат элементы, повышающие эффективность репликации вектора и экспрессии соответствующих генов. Таким образом, экспрессирующие векторы обычно содержат точку начала репликации и кодируют некоторые другие функции, необходимые для эффективной внутриклеточной репликации и не обеспечивающиеся хозяйскими клетками.
Транскрипция зависит от наличия в векторе промотора, который соответствует присутствующей в клетках РНК- полимеразе, т.е. промотора Е. coli для экспрессии в клетках бактерий и промотора, используемого РНК-полимеразой II, для экспрессии в эукариотических клетках [201]. Этот промотор должен быть расположен в векторе таким образом, чтобы клонированный ген мог встроиться в правильной ориентации и за промотором по ходу транскрипции. Эукариотические экспрессирующие векторы должны также иметь сайт для расщепления и полиаденилирования транскрипта-предшественника функци ональной мРНК. Для точной трансляции в начале кодирующей области должен находиться кодон ATG, а в конце - один из стоп-кодонов. Последний обычно содержится в клонированном сегменте, но стартовый кодон часто отсутствует во вставке кДНК, поэтому его функции должен \ выполнять вектор. Для трансляции в Е. coli на 5 -конце на расстоянии примерно 10 нуклеотидов от инициирующего кодона должен находиться сайт связывания с рибосомой, последовательность Шайна-Дальгарно [21]. В экспрессирующие векторы часто бывают включены дополнительные элементы. Обычно они предназначаются для увеличения выхода полипептидов или для упрощения процедуры очистки нужного белка от других клеточных белков. Одним из основных факторов, ответственных за уменьшение выхода, является нестабильность многих белков в чужеродной клеточной среде. Чтобы добиться экспрессии гена (или кДНК), обычно каждый раз приходится решать уникальную экспериментальную задачу. Поэтому многие экспрессирующие векторы, хотя и обладают некоторыми общими свойствами, имеют свои особенности [100,229]. 2.5.1. Экспрессирующие векторы, используемые в клетках Е. coli Для клонирования фрагментов чужеродной ДНК и репликации их в Е. coli могут использоваться 4 типа векторов: космиды, плазмиды, бактериофаг А., бактериофаг М13 [78, 184]. Векторы, сконструированные для осуществления эффективного белкового синтеза в Е. coli, обычно происходят от pBR322 или другой высококопийной плазмиды. Это необходимо для получения максимального числа матриц для транскрипции [184]. Большинство векторов, предназначенных для изучения экспрессии генов, содержат один из сильных промоторов: lac-промотор с соответствующим оператором, trp-промотор и оператор, а также PL-промотор бактериофага X. Обычно используют мутантный 1ас-промотор, называемый UV5, поскольку это позволяет осуществлять транскрипцию с большей скоростью, чем в случае промотора дикого типа, а кроме того, активность сохраняется даже в отсутствие положительного эффектора САР-сАМР. Другой часто используемый промотор, lac, представляет собой синтетическую конструкцию: его — 35-последовательность представляет собой —35-последовательность trp-промотора, а блок Прибнова (—10-последовательность) - соответствующую последовательность промотора UV5. Таким образом, lac-промотор идентичен оптимальному промотору Е. coli, структура которого была определена исходя из данных, полученных при сравнении последовательностей многих природных промоторов. Как и ожидалось, он оказался весьма эффективным [100, 229]. Помимо такого достоинства, как эффективность, эти четыре промотора обладают еще одним ценным свойством: они позволяют осуществлять временной контроль инициации транскрипции, поскольку связаны с регуляторными элементами. Это очень важно, так как накопление больших количеств чужеродного для Е. соН белка может подавлять рост клеток и тем самым ограничивать конечный выход белка. Плазмидные векторы, содержащие промотор lacUV5, часто содержат также последовательность Шайна-Дальгарно lac-оперона и кодирующие последовательности для р-галактозидазы.
Поскольку экспрессия, инициируемая на участке с 1ас-оператором-промотором, находится под контролем lac-оперона, транскрипцию можно инициировать с помощью индуктора изопропил-Р-О-тиогалактозида (IPTG) [205]. В экспрессирующем векторе с trp-промотором перед полилинкером находятся trp-промотор, оператор, последовательность Шайна-Дальгарно, аттенуатор, а также примерно 300 кодонов гена trp Е. Транскрипцию можно контролировать, поместив содержащие плазмиду клетки Е. coli, выращенные до высокой плотности, в среду без триптофана (голодание) и добавив затем З-Р-индолилакриловую кислоту. Последняя конкурирует с оставшимся триптофаном за связывание с trp-репрессором, однако образует неактивный комплекс, в результате чего происходит дерепрессия промотора [21]. Экспрессирующий вектор, использующий PL-npoMOTop бактериофага X позволяет синтезировать эукариотические белки, не сливающиеся с чужеродным полипептидом. Транскрипция с этого промотора подавляется .-репрессором, который образуется профагом, присутствующим в клетке-хозяине. Применение клеток, лизогенизнрованных фагом, который кодирует чувствительный к нагреванию репрессор (clts), позволяет индуцировать экспрессию гена путем переноса клеток, выращенных при 30С, в среду с температурой 42С. Таким образом, вектор поставляет все регуляторные элементы, необходимые для транскрипции и трансляции, за исключением стоп-кодона, который обычно находится в пределах клонированных эукариотических кДНК [100,229]. Векторы на основе бактериофага X применяются для клонирования больших фрагментов ДНК и создания геномных библиотек. Но они довольно неудобны в качестве векторов для работы с небольшими встройками и для их пробного анализа [70]. Наиболее распространёнными векторами на основе бактериофагов, содержащих одноцепочечную ДНК, являются векторы на основе фага М13. Они используются главным образом при получении матриц для секвенирования методом терминирования цепей по Sanger F. с использованиехМ дидезоксинуклеотидов и как источник отдельных цепей ДНК для гибридизации нуклеиновых кислот [137; 189]. 2.5.2. Экспрессирующие векторы, используемые в клетках дрожжей Наиболее эффективные в отношении экспрессии генов дрожжевые векторы сконструированы на основе 2 мкм-кольцевой плазмиды дрожжей. Эта плазмида обеспечивает образование в дрожжевых клетках большого числа копий рекомбинантной ДНК до тех пор, пока сегмент REP3 находится в цис-положении, а функциональные гены REPIH REP2 - либо в цис-, либо в транс-положении (например, в составе другой плазмиды). Применяются несколько разных регулируемых дрожжевых промоторов, например, промотор гена CYC1, кодирующего изо-1-цитохром с.
Методы
Культивирование вирусов осуществляли в перевиваемых клетках почки поросёнка (ППК-666) и первичных клетках костного мозга свиней. Клетки заражали вирусом с множественностью 1 ГАЕ/клетку. В период наиболее полного вирусиндуцированного цитолиза вируссодержащую суспензию осветляли низкоскоростным центрифугированием, вирус концентрировали при 28 000 g в течение 1,5 часов, осадок ресуспендировали в 2-5 мл 100 мМ NaCl, 10 мМ Трис- HC1, рН 7,5, ІмМ ЭДТА (буфер STE), обрабатывали проназой Е (200 мкг/мл) 30 минут и очищали центрифугированием в течение 4 часов при 25 000 g в ступенчатом градиенте плотности сахарозы (35, 45, 50%). Фракцию очищенного вируса (на 45%-ной сахарозе) разбавляли буфером STE до 15 мл и вирус осаждали высокоскоростным центрифугированием в режиме, описанном выше. Осадок ресуспендировали в 500 мкл буфера STE. ДНК из препаратов очищенного вируса выделяли фенольно-детергентным методом. К 0.1-0.5 мл вируссодержащей суспензии в буфере ТЕ (рН 8.0) добавляли протеиназу К (100 мкг/мл), раствор ДСН (0.5 %) и инкубировали 30 минут при температуре 56 С. После экстракции фенолом ДНК из водной фазы переосаждали 2.5 объемами перегнанного этанола и полученные препараты ДНК хранили при - 20 С. 3.2.2. Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей Специфичность праймеров подтверждена с помощью поисковой системы BLAST [38]. Для анализа нуклеотидных последовательностей и построения рекомбинантных конструкций использовали программу Clone. Анализ аминокислотных последовательностей белков проводили с помощью пакета прикладных программ DNAsis (версия 2.5). 3.2.3. Полимеразная цепная реакция ПЦР проводили в реакционной смеси объёмом 25 мкл, содержащей 10-кратный буфер для амплификации, 200 цМ каждого dNTP, 10 пмоль каждого праймера, 2 ед. Taq-ДНК-полимеразы, 5 мкл раствора ДНК. Поверх реакционной смеси наслаивали 30 мкл лёгкого минерального масла для предотвращения испарения. После проведения первой ПЦР отбирали из-под масла 5 мкл пробы и использовали для реамплификации. Все манипуляции проводили в соответствии с рекомендациями [15, 143, 182]. Размер продуктов определяли с помощью электрофореза в агарозном геле. Пробы ДНК по 5 мкл смешивали с 5 мкл специального буфера, содержащего интеркалирующий краситель бромистый этидий. Затем вносили пробы в лунки геля, концентрация которого зависела от длины разделяющихся продуктов.
На основании размеров и расстояний пробегов маркерных ДНК (рестрицированная Hindlll и Eco RI ДНК фага лямбда) вычисляли размеры исследуемых фрагментов ДНК. 3.2.5. Рестрикция ДНК Рестрикцию проводили в конечном объёме 10 мкл, содержащем 1 мкл 10-кратного рестрикционного буфера согласно прописи фирмы изготовителя, по 0,5 мкл каждой рестриктазы из расчета (1-5 ед/мкг ДНК). Реакционную смесь инкубировали при 37С в течение 1-1,5 часа. После окончания реакции отбирали по 5 мкл из пробирки и смешивали с 6-кратным буфером для нанесения. Образец наносили затем в лунки агарозного геля, концентрацию которого выбирали в зависимости от длин фрагментов ДНК. 3.2.6. Лигирование Лигирование проводили в объеме 25 мкл, содержащих лигазный буфер, 0,1 М КС1, 1 мМ АТР, 10-кратный гексаминкобальтмагния, 10 единиц ДНК-лигазы Т4,10 мкл векторной ДНК и 5 мкл ПЦР-продукта. 3.2.7. Электропорация Трансформацию компетентных клеток методом электропорации осуществляли согласно рекомендациям фирмы Bio-Rad. При выполнении всех подготовительных мероприятий все материалы были охлаждены, а кюветы тщательно высушены. Электропорацию клеток проводили при силе тока 2,5 мА, а время его воздействия не превышало 4,2 сек. Выделение проводили по методу, предложенному Birnboim Н.С. [55]. Этот метод позволяет получить с 1,5 мл культуры 1-2 мкг плазмидной ДНК. При выделении используются 3 буфера. В буфере 1 проводится лизис клеток E.coli после обработки клеточной стенки бактерий лизоцимом. В буфере 2 происходит денатурация хромосомной ДНК и раскручивание плазмидной ДНК. Буфер 3 изменяет значение рН смеси от щелочного до нейтрального, что способствует ренатурации кольцевой ДНК, тогда как хромосомная ДНК не ренатурирует. 3.2.9. Электрофорез белков Для быстрой оценки экспрессии рекомбинантного белка проводили анализ суммарного клеточного белка с помощью прерывистого электрофореза в SDS-PAGE по Laemmli U.K., с последующим окрашиванием Кумасси бриллиантовым синим [17, 122]. Концентрацию разрешающего геля выбирали, исходя из эффективного разделения белков от 10 до 50 кДа. По данным Laemmli U.K. [122], для этого подходит концентрация ПААГ 12%. В качестве концентрирующего геля использовали 5%-ный ПААГ. Буфером разрешающего геля служил 0,375М Трис-HCl, рН 8,8 с добавлением SDS до 0,1%. Для концентрирующего геля в качестве буфера использовали 0,125М Трис-HCl, рН 6,8, с 0,1% SDS. Для полимеризации в оба геля вносили по 0,025% персульфата аммония и TEMED. Для электрофореза использовали 5-кратный буфер TGB, рН 8,3 (125 тМ Трис-основной, 1,25М глицин, 0,5% SDS). Сначала готовили разрешающий гель без TEMED (его вносили непосредственно перед заливкой геля и после дегазации). Затем наслаивали 3-5 мм бутанола для выравнивания разрешающего геля и дегазации. После поли.меризации вставляли гребёнку, заливали концентрирующий гель и заливали буфер. Белковый препарат (200 мкл) смешивали перед нанесением со специальным 2-кратным буфером, состоящим из Трис-HCl, рН 6,8, 100 тМ DTT, 2% SDS, 0,1% бромфенолового синего, 10% глицерина, и кипятили в течение 5 минут для инактивации протеаз. Электрофорез проводили при напряжении 10 В/см в концентрирующем геле и 180 В/см в разрешающем. Гель окрашивали в ванночке с Кумасси бриллиантовым синим «PAGE blue 83» (0,2% Кумасси бриллиантового синего в водном растворе, содержащем 45:45:10 метанол:вода:уксусная кислота) при комнатной температуре в течение ночи или при 37С в течение 2-3 часов при покачивании. Отмывку от не связавшегося с белком красителя проводили, вымачивая гель в 7%-ной уксусной кислоте [17]. 3.2.10. Иммуноферментный анализ В лунки микропанели вносили антиген, разведенный в 0.05М карбонатно-бикарбонатный буфер (рН 9.6-9.7). Инкубировали при 37С в течение 1 часа или в течение 24 часов при 4С. Затем 5 раз промывали раствором ФБР, рН 7.2, содержащим 0,05 % твин-20 (ФБР-Т). Разбавляли исследуемую сыворотку, а так же положительную и отрицательную сыворотки в соотношении 1:30 в ФБР-Т. Вносили по 200 мкл сывороток в лунки, содержащие антиген. Инкубировали микропанели при 37С в течение 1 часа. Затем 5 раз промывали ФБР-Т. В каждую лунку добавляли 200 мкл конъюгата протеин А - пероксидаза хрена в рекомендуемом разведении на ФБР-Т. Инкубировали при 37С в течение 1 часа. Затем 5 раз промывали ФБР-Т. Добавляли в лунки по 200 мкл раствора субстрата ABTS.
Инкубировали при комнатной температуре около 15-20 мин. Положительными считали сыворотки, давшие сине-зелёное окрашивание, чётко различимое визуально. В том случае, если положительный контроль не даёт чёткого сине-зелёного окрашивания, использовали считывающее устройство. В этом случае положительными считали те сыворотки, чьи коэффициенты поглощения более чем в 2 раза превышали оптическую плотность отрицательного контроля. 4.1. Клонирование генов рЗО и р72 вируса АЧС Основной целью исследований являлось получение рекомбинантных белков рЗО и р72 вируса АЧС, пригодных для использования в ИФА в качестве антигена. Для этого необходимо было получить ПЦР-продукты, содержащие нуклеотидные последовательности генов рЗО и р72 вируса АЧС и создать генно-инженерные конструкции, экспрессирующие эти белки. 4.1.1. Выбор участков и подбор праймеров для получения ПЦР-продуктов, содержащих последовательности генов рЗО и р72 Из данных литературы известно, что экспрессия белков, содержащих гидрофобные участки, представляет значительные трудности. Установлено, что гидрофильные домены, как правило, соответствуют конформационным эпитопам белков. Поэтому клонирование небольших фрагментов генов, кодирующих гидрофильные участки белка, позволяет существенно упростить эту задачу. Для клонирования последовательностей генов рЗО и р72 вируса АЧС, содержащих конформационные эпитопы, нами были проанализированы профили гидрофильности обоих белков по алгоритму Норр Т.Р. и Woods K.R. [114]. Согласно этому алгоритму ген рЗО содержит гидрофильный участок между 75-ой и 186-ой аминокислотами, а ген р72 -между 215-ой и 365-ой. Полученные результаты коррелируют с данными, полученными Borca M.V. [62] с помощью набора моноклональных антител. Указанные гидрофильные участки предположительно и являются конформационными эпитопами. Из рис.3 видно, что наиболее длинный гидрофильный участок белка р72 находится между 190-ой и 350-ой аминокислотами. Этот участок более подробно рассмотрен на следующем рис.4.
Клонирование и экспрессия генов рЗО и р72
Для клонирования конформационных эпитопов генов рЗО и р72 штамма НВЛ-1 вируса АЧС в векторе рТТ9 в праймеры, фланкирующие эти фрагменты были встроены сайты рестрикции Bam HI и Bsp Mil. После проведения ПНР амплифицированные продукты (в дальнейшем рЗО-ПЦР и р72-ПЦР) были рестрицированы данными ферментами. Плазмиду рТТ9 разрезали по сайтам Bgl II и Bsp МИ, так как этот вектор не содержит сайта Bam HI. Однако рестриктаза Bgl II образует липкие концы, комплементарные липким концам, образованным Ват НІ. В реакционную смесь, содержащую 6 мкл ПЦР-продукта или 3 мкл векторной ДНК, вносили по 5 ед. каждой рестриктазы и 2 мкл 10-кратного буфера Yango (Fermentas). Конечный объём доводили водой 20 мкл и инкубировали при 37С в течение 2 часов. Результаты рестрикции оценивали с помощью электрофореза в 0,9%-ном геле агарозы. Плазмида рТТ9 имела размер 3625 п.о. (тело плазмиды), а подвижность рЗОПЦР соответствовала длине фрагмента 374 п.о., а р72ПЦР - 483 п.о. 4.2.2. Выделение тела плазмиды из геля агарозы Для выделения тела плазмиды из геля агарозы было использовано два способа. 1). Стерильным скальпелем вырезали из геля фрагмент, соответствующий телу плазмидного вектора рТТ9, и помещали его в стерильную пробирку «эппендорф», на дне которого было сделано небольшое отверстие и плотно уложена стекловата фирмы «Serva». Эту пробирку вставляли в другую и центрифугировали в течение 10 мин при 4000 об./мин. При таких режимах агарозный гель «отжимается» и на дне нижней пробирки собирается жидкость, содержащая ДНК. Для сравнения эффективности выделения ДНК из геля агарозы также использовали стандартный метод выделения ДНК из легкоплавкой агарозы (фирма «Bio-Rad»). Агарозный гель с ДНК заливали 5 объёмами буфера ТЕ (50 мкл) и прогревали при 65С в течение 5-7 минут до полного расплавления агарозы. Далее ДНК экстрагировали равным объемом фенола, предварительно прогретым на 65 С в течение 5 мин и центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин. Верхнюю фазу дважды экстрагировали смесью фенол : хлороформ и хлороформом. Отбирали верхнюю фазу в чистые пробирки и ДНК переосаждали двумя объёмами этанола и ацетата натрия при -70С.
Наши исследования показали, что выбор того или иного метода выделения фрагментов ДНК из агарозного геля принципиального значения не имеет. Все выделенные обоими методами ДНК плазмиды были успешно лигированы с ПЦР-продуктами. Однако было установлено, что не все типы стекловат подходят для «отжимания» геля. Так, при использовании стекловаты фирмы «Whatman», большая часть плазмидной ДНК необратимо связывалась и в раствор переходила лишь незначительная часть. Так как метод выделения плазмидной ДНК из легкоплавкой агарозы не даёт ощутимого преимущества перед методом «отжимания», нами был сделан выбор в пользу последнего ввиду его простоты исполнения. 4.2.3. Трансформация лигазной смесью компетентных клеток Е. соИ М15 Лигирование плазмидного вектора рТТ9 и ПЦР-продуктов, содержащих последовательности генов рЗО и р72 проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащих 10 ед. ДНК-лигазы, 10 мкл векторной ДІЖ и 5 мкл ПЦР-продукта. После инкубации при комнатной температуре в течение 45 мин ДНК переосаждали тремя объёмами этанола в присутствии ацетата натрия и осадок растворяли в 50 мкл воды. Для трансформации клеток E.coli методом электропорации [151], 1 мл ночной культуры, выращенной, на твёрдой среде LB с пониженным у содержанием NaCl (0,5%), вносили в 100 мл среды LB и после добавления канамицина (50 мкг/мл) инкубировали на качалке (400 об/мин) до достижения оптической плотности 0,3-0,5 ед. Затем клетки трижды промывали равным объемом холодной воды и осадок ресуспендировали в 800 мкл холодного 10%-ного глицерина. Далее 80 мкл суспензии клеток E.coli и 5 мкл лигазной смеси переносили в кювету для электропорации и замыкали контакты при силе тока 2,5 мА. Затем быстро добавляли 1 мл среды LB, подращивали на качалке (200 об/мин) в течение 1 часа при 37С и высевали на твердую среду LB с 1,8%-ным агаром, содержащих ампициллин и канамицин (до конечной концентрации 50 мкг/мл), глюкозу (до конечной концентрации 2%) для селекции рекомбинантных клонов. Чашки инкубировали в течение 1-2 суток при 37С. В результате проведенных экспериментов нами было получено около 200 клонов на чашке с клетками, трансформированными рекомбинантной плазмидой р72ПЦР, и около 300 клонов на чашке с клетками, трансформированными плазмидой рЗОПЦР. 4.2.4. Скрининг рекомбинантных клонов Отдельные клоны отбирали петлей, наносили его штрихом на чашку со свежим агаром с глюкозой и после подращивания их оставляли для хранения. Оставшиеся на петле клетки помещали в пробирку, содержащую 5 мл среды LB с антибиотиками и подращивали на качалке (200 об./мин.) в течение ночи при 37С. Далее из полученных клеток выделяли плазмидную ДНК и использовали для рестрикционного анализа. Для определения наличия вставки в рекомбинантной плазмиде фрагментов генов белков рЗО и р72 вируса АЧС проводили гидролитическое расщепление ДНК двумя рестриктазами ВатШ и Hindlll, сайты которых фланкировали данные последовательности. При электрофорезе в 1,5% геле полученные вставки имели размер 930 п.о. для рЗО и 1038 п.о. для р72. Выше тела плазмиды рТТ9, не содержащей встройки, расположена не имеющая сайтов рестрикции BamHI и Hindlll плазмида pRep4 размером 3740 п.о., экспрессирующая 1ас-репрессор (рис.9). Для экспрессии гибридных белков, клетки E.coli (штамм Ml5), содержащих рекомбинантные плазмиды рТТ9р30-2, рТТ9р30-9 и рТТ9р72-10 высевали в 5 мл жидкой среды LB с антибиотиками на ночь. В отдельную пробирку высевали клетки E.coli (штамм Ml5), не содержащие плазмиду рТТ9 (контроль). Далее по 300 мкл ночной культуры вносили в 3,5 мл среды LB с антибиотиками и глюкозой, помещали на качалку (400 об/мин) и выращивали при комнатной температуре в течение 3-4 часов до достижения оптической плотности 1-1,2 ед. при длине волны 550 нм. После этого стерильно отбирали по 500 мкл культуры до индукции, клетки осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 10000 об/мин и хранили при -20 С. Далее в оставшиеся пробирки с жидкой средой добавляли по 50 мкл 0,1М IPTG и выращивали культуру не менее 2 часов при комнатной температуре для индукции промотора. Затем отбирали пробы по 500 мкл культуры для белкового электрофореза, а также по 1,5 мл для определения растворимости белков. Все пробы центрифугировали в течение 5 мин. при 10000 об/мин и осадок клеток замораживали перед электрофорезом.
Для быстрой оценки экспрессии рекомбинантных белков проводили анализ суммарного клеточного белка клеток E.coli в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) по Laemmli U.K. [122]. В качестве концентрирующего геля использовали 5%-ный ПААГ с 5-кратным электродным буфером буфер TGB (125 тМ Трис-основной, 1,25М глицин, 0,5% SDS, рН 8,3). Образцы лизата клеток E.coli (200 мкл) смешивали с равным объемом 2-кратного буфера (Трис-HCl, рН6,8, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% бромфенолового синего, 10% глицерина), помещали в кипящую водяную баню на 5 мин и вносили в лунки концентрирующего геля. Электрофорез проводили при напряжении 180 В/см. Гели окрашивали 0,2% Кумасси «PAGE blue 83» при комнатной температуре в течение ночи и отмывку от не связавшегося с белком красителя проводили в 7%-ной уксусной кислоте. Для определения растворимости гибридных белков осадок клеток E.coli трижды замораживали и оттаивали, после чего ресуспендировали в буфере, содержащем 50 мМ Трис-НС1, 100 мМ NaCl и 1 мМ ЭДТА, рН 8,0. Затем добавляли лизоцим до концентрации 0,1 мг/мл, выдерживали 10 мин во льду, вносили 10 мкл 10%-ного тритона Х-100 и через 30 мин клетки обрабатывали ультразвуком 3-4 раза по 15 секунд с паузой 40-60 секунд. После центрифугирования в течение 5 мин при 12000 об/мин, тщательно отбирали супернатант в чистую пробирку и добавляли равный объём лизирующего буфера. Осадок клеток также растворяли в 100 мкл 2-кратного буфера для нанесения и проводили электрофорез в 12%-ном ПААГ по Laemmii U.K. [122]. Из данных, приведённых на рис. 12, видно, что отобранные рекомбинантные плазмиды рТТ9рЗО-2, рТТ9рЗО-9 и рТТ9р72-10 после индукции IPTG экспрессируют гибридные белки, которые отсутствуют в треках куда вносили лизаты клеток E.coli (штамм Ml 5) до индукции, а также контрольные клетки E.coli (штамм Ml5), не содержащие плазмиду рТТ9 (рис.12, трек 1). При определении растворимости гибридных белков было установлено, что белок рЗО-CelD у обоих клонов (рТТ9рЗО-2, рТТ9рЗО-9) преимущественно накапливался в растворимой фракции (рис. 12, треки 5, 9).
