Введение к работе
Актуальность проблемы. Выявление молекулярных механизмов наследственных психических заболеваний и поиск путей их коррекции являются ключевой проблемой нейрогеномики поведения и молекулярной нейрофармакологии. Многие тяжелые нарушения нервной системы сопровождаются каталепсией (реакцией замирания) -состоянием длительной неподвижности с пластическим тонусом мускулатуры, неспособностью изменить приданную позу (Sanberg et al., 1988; Weder et al. 2008; Daniels 2009). В клинике каталепсия чаще всего проявляется при злокачественном экстрапирамидном синдроме, вызванном лечением пациентов блокаторами дофаминовых D2 рецепторов (нейролептиками) (Ahlenius and Hillegaart 1986; Klemm 1989; Wadenberg 1996; Caroff et al. 2000; Lee 2007; 2010; Paparrigopoulos et al. 2009; Porsolt et al. 2010). Выяснение молекулярно-генетического механизма каталепсии является актуальной задачей молекулярной биологии и медицины.
Моделью патологической реакции замирания является щипковая каталепсия у мышей (Amir et al., 1981; Kulikov et al., 1993). Была установлена ассоциация предрасположенности щипковой каталепсии у мышей с «депрессивным» состоянием (Куликов, 2004; Базовкина и др., 2005; Kulikov, Popova, 2008) и со сниженным порогом судорожной активности нейронов гинпокампа (Лисачев и др, 2008). Щипковая каталепсия довольно редкое явление и не обнаружена у мышей большинства линий, таких как AKR/J, C57BL/6, DBA/2 и др. В то же время, она наблюдается у половины мышей линии CBA/LacJ (Куликов и др., 1989; Kulikov et al., 1993). Гипертрофированная предрасположенность к каталепсии у мышей CBA/LacJ была значительно усилена у мышей линии ASC (Antidepressant Sensitive Catalepsy), полученной длительной селекцией гибридов между СВА и некаталептической линией AKR/J (Kondaurova et al., 2006). Методами Quantative trait loci-анализа (QTL) (Куликов и др., 2003; Куликов, Базовкина, 2003) и длительной селекции (Kondaurova et al., 2006) главный ген каталепсии был локализован в дистальном фрагменте хромосомы 13. С помощью переноса дистальных фрагментов хромосомы 13 от каталептической линии CBA/LacJ в геном некаталептической линии AKR/J главный ген каталепсии был локализован во фрагменте 111.35 - 116.14 Мб хромосомы 13. Была создана коигенная линия AKR.CBA-D13Mit76, отличающаяся от AKR/J наличием СВА-фрагмента хромосомы 13 в геноме AKR/J и высокой предрасположенностью к каталепсии (Kulikov et al., 2008).
Среди генов, локализованных в данном фрагменте, наиболее вероятным геном кандидатом является ген H6st, кодирующий белок gpl30, осуществляющий трансдукцию сигнала от рецепторов цитокинов группы интерлейкина-6 (IL-6). Это чрезвычайно важная группа интерлейкинов (IL), включающая IL-6, IL-11, IL-27, leukaemia inhibitory factor (LIF), ciliary neurotropic factor (CNTF), онкостатин M, кардиотропин-1 и др. (Chesnokova and Melmed 2002; Fasnacht and Muller 2008; Heinrich et al. 2003), играет ключевую роль в нейрогенезе, нейрональной дифференциации, иммунном ответе и воспалении (Naka et al. 2002). Ряд авторов предполагает участие IL-6 в механизме депрессии (Bluthe et al. 2000; Hayley et al. 2005; Leonard, Myint, 2009). На этом основании была сформулирована гипотеза, что причиной наследственной каталепсии у мышей CBA/LacJ могут быть мутации в гене Il6st или регуляторных областях гена, изменяющие его экспрессию или функцию белка gpl30 (Kulikov et al., 2008).
Цель работы состояла в изучении структуры и экспрессии гена H6st, а также функциональной активности белка gpl30, а также в установлении их возможной ассоциации с наследственной каталепсией у лабораторных мышей, различающихся по предрасположенности к каталепсии.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Определить нуклеотидные последовательности экзонов гена H6st мышей
некаталептической линии AKR/J и каталептической линии CBA/LacJ.
2. Изучить уровни транскрипции гена Il6st в головном мозге у животных
каталептических линий CBA/LacJ, AKR.CBA-D13Mit76, ASC и устойчивой к
каталепсии линии AKR/J.
-
Исследовать уровень трансляции и долю гликозилировашюй формы белка gpl30 в мозге у животных линий CBA/LacJ, AKR.CBA-D13Mit76, ASC и AKR/J.
-
Исследовать влияние липополисахарида (ЛПС) на поведение и экспрессию генов II6st и его гена-мишени Gfap в головном мозге у мышей конгенных линий AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76.
-
Исследовать влияние IL-6 на поведение у мышей конгенных линий AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76.
-
Изучить влияние IL-6 ex vivo на экспрессию генов Il6st и Gfap в срезах гиппокампа мышей линий AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76.
Научная новизна работы. В настоящей работе впервые:
1. Определены нуклеотидные последовательности кодирующей области гена I16st у
мышей линии AKR/J (номер доступа в базе данных GenBank () - JQ085376) и CBA/LacJ (номер доступа в базе данных GenBank - JQ085377).
2. Выявлена зависимость экспрессии гена Il6sl от структуры мозга у мышей линий
AKR/J, CBA/LacJ, AKR.CBA-D13Mit76, ASC.
3. Обнаружено увеличение уровня мРНК гена H6st у мышей линии AKR.CBA-
D13Mit76 в стриатуме по сравнению с линиями AKR/J, CBA/LacJ и ASC.
4. Выявлена зависимость уровня белка gp!30 и степени его гликозилирования от
структур мозга у мышей линий AKR/J, CBA/LacJ, AKR.CBA-D13Mit76, ASC.
5. Установлена положительная ассоциация СВА - фрагмента 111.35- 116.14 Мб
хромосомы 13 с чувствительностью к ЛПС у мышей.
6. Показано участие СВА-фрагмента 111.35 - 116.14 Мб хромосомы 13 в
каталептогенном действии IL-6 у мышей.
Теоретическая и научно-практическая ценность работы. Основным вкладом данного исследования в изучение генетических и молекулярных механизмов нарушений поведения является экспериментальное доказательство ассоциации наследственной каталепсии с чувствительностью к ЛПС и 1L-6. Другим важным положением, продемонстрированным в работе, является экспериментальное доказательство участия белка gpl30 в механизме каталепсии мышей Несмотря на то, что полученные экспериментальные результаты не подтвердили гипотезу о том, что наследственная каталепсия у мышей CBA/LacJ вызвана мутацией в гене 7/6 изменяющей его экспрессию или функцию белка gpl30, проделанная работа позволила сократить первоначальный список генов-кандидатов, ассоциированных с наследственной каталепсией у мышей CBA/LacJ. Была показана научно-практическая ценность конгенной линии AKR.CBA-D13Mit76 как модели для экспериментального изучения молекулярных механизмов действия ЛПС и IL-6. Полученные результаты используются в курсе лекций «Молекулярные механизмы поведения» для студентов 4 курса факультета естественных наук НГУ.
Положения, выносимые на защиту:
1. Наследственная каталепсия у мышей линии CBA/LacJ не ассоциирована с изменениями в кодирующей части гена H6st, а также с изменениями в экспрессии гена H6st и функциональной активности gpl30.
-
Конгенная линия мышей AKR.CBA-DI3Mi(76 обладает повышенным уровнем мРНК гена Il6st в стриатуме по сравнению с линиями AKR/J, CBA/LacJ и ASC.
-
Наибольший уровень мРНК гена Il6st для мышей линий AKR.CBA-D13Mit76, AKR/J, CBA/LacJ и ASC обнаружен в среднем мозге и гипоталамусе. Наибольший уровень обеих форм (гликозилированной и негликозилированной) белка gpl30 наблюдался в среднем мозге у мышей этих линий.
-
Фрагмент 111.35 - 116.14 Мб хромосомы 13 влияет на чувствительность мышей к липополисахариду (ЛПС) и IL-6.
-
Стимуляция gpl30 экзогенным IL-6 или эндогенным IL-6, секретированным в ответ на введение липополисахарида (ЛПС) вызывает каталептогенное действие у мышей.
Апробация результатов. Полученные результаты были представлены и обсуждены на XLVIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2010), 5-ой международной конференции «Биологические основы чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2010), XXI съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010), Первой всероссийской молодежной научной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (Томск, 2010), ІЗой ежегодной встрече интернационального общества поведческой и нейроналыюй генетики Genes, Brain and Behavior 2011 (Италия, Рим, 2011), 15ой Международной конференции по нейронаукам и биологической психиатрии «Стресс и поведение» (Санкт-Петербург, 2011) и VII съезде Казахского физиологического общества с международным участием «Современная физиология: от клеточно-молекулярной до интегративной - основа здоровья и долголетия» (Казахстан, Алматы, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них четыре статьи из списка журналов, рекомендованных ВАК, в отечественных (2) и международных (2) журналах, 4 тезиса на всероссийских и 3 на международных конференциях.
Соавторство и благодарности. Автор выражает глубокую признательность к.б.н. П.Д. Лисачеву (лаборатория биомедицинской информатики конструкторско-технологического института вычислительной техники СО РАН) за приготовление и инкубацию срезов гиппокампа, к.бн. Д.В. Базовкиной (лаборатория иейрогеномики поведения ИЦиГ СО РАН) за помощь в проведении тестов на каталепсию и секвенировании, к.б.н. М.А. Тихоновой (лаборатория иейрогеномики поведения ИЦиГ СО РАН) за помощь в обработке поведенческих тестов и кб.н. Кондауровой ЕМ (лаборатория иейрогеномики поведения ИЦиГ СО РАН) за совместную работу по Вестерн блоттингу.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список цитируемой литературы (301 наименований) и приложение. Работа изложена на 99 страницах, содержит 29 рисунков, из которых 15 оригинальные, и 9 таблиц, из которых 4 оригинальные. В приложениях помещены 10 оригинальных таблиц, которые поясняют рисунки 14 - 29.
