Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Природные регуляторные пептиды 14
1.1.1. Общая характеристика 14
1.1.2. Классификация регуляторных пептидов 19
1.1.2.1. Нейропептиды 19
1.1.2.2. Пептиды желудочно-кишечного тракта 27
1.1.2.3. Регуляторные пептиды иммунной системы 30
1.1.2.4. Атриопептиды 32
1.2. Тафтцин 33
1.2.1. Общая характеристика тафтцина 33
1.2.2. Действие тафтцина на иммунную систему 35
1.2.3. Действие тафтцина на ЦНС 36
1.2.4. Противоопухолевое действие тафтцина 38
1.3. Синтетический регуляторный селективный анксиолитик селанк 39
1.3.1. Синтетические регуляторные пептиды 39
1.3.2. Структура селанка 43
1.3.3. Анксиолитическое действие селанка 43
1.3.4. Действие селанка на ЦНС 48
1.3.5. Действие селанка на иммунную систему 51
1.3.6. Другие свойства селанка 52
1.4. Подходы к изучению механизма действия регуляторных пептидов 54
1.4.1. Физиологические методы 54
1.4.1.1. Классификация экспериментальных моделей 54
1.4.1.2. Физиологические методы оценки влияния регуляторных пептидов на поведение животных 55
1.4.2. Биохимические методы 58
1.4.2.1. Изучение биодеградации регуляторных пептидов 58
1.4.2.2. Поиск взаимодействий регуляторных пептидов с рецепторами 59
1.4.3. Молекулярно-биологические методы 60
1.4.3.1. Анализ экспрессии генов на уровне мРНК 60
1.4.3.2. Анализ экспрессии генов на уровне белка 63
Глава 2. Материалы и методы 65
2.1. Приготовление и хранение препаратов селанка 65
2.2. Анализ влияния однократного и курсового введения селанка на экспрессию генов в мозге и селезёнке крысы 65
2.2.1. Характеристика экспериментальных групп животных 65
2.2.2. Выделение тотальной РНК из тканей мозга и селезёнки крысы 67
2.2.3. Оценка уровня экспрессии мРНК генов в гиппокампе крысы с использованием кДНК-микрочипов 68
2.2.4. Оценка уровня экспрессии мРНК генов Actnl, Fg/7, СхЗсгІ, Ptprnl, Slc6a20 в гиппокампе, лобной коре, мозжечке и селезёнке крысы 69
2.2.5. Статистическая оценка результатов 71
2.3. Анализ влияния селанка и его фрагментов на экспрессию генов, вовлеченных в процессы воспаления, в селезёнке мыши 72
2.3.1. Характеристика экспериментальных групп животных 72
2.3.2. Выделение тотальной РНК из тканей селезёнки мыши 73
2.3.3. Оценка уровня экспрессии мРНК генов, вовлеченных в процессы воспаления, в селезёнке мыши под действием селанка ] и его фрагментов с использованием ПЦР-чипов 74
2.3.4. Статистическая оценка результатов 78
2.4. Временная динамика экспрессии мРНК гена Вс16, генов мишеней и генов-корепрессоров белка BCL6 в селезёнке мыши под действием селанкаи его фрагментов 78
2.4.1. Характеристика экспериментальных групп животных 78
2.4.2. Выделение тотальной РНК из тканей селезёнки мыши 79
2.4.3. Оценка уровня экспрессии мРНК гена Всіб, генов-мишеней и генов-корепрессоров белка BCL6 в селезёнке мыши под действием селанка и его фрагментов 79
2.4.4. Статистическая оценка результатов 80
Глава 3. Результаты исследования 81
3.1. Анализ влияния однократного и курсового введения селанка на изменение транскриптома клеток мозга и селезёнки крысы 81
3.1.1. Анализ влияния однократного и курсового введения селанка на изменение транскриптома клеток гиппокампа крысы с использованием кДНК-микрочипов 81
3.1.2. Анализ влияния однократного и курсового введения селанка на изменение экспрессии генов Actnl, СхЗсгІ, Fg/7, Ptprn2 и Slc6a20 в гиппокампе, лобной коре и мозжечке крысы 86
3.1.3. Анализ влияния однократного и курсового введения селанка на изменение экспрессии генов Actnl, СхЗсгІ, Fgf7, Ptprn2 uSlc6a20n селезёнке крысы 91
3.2. Анализ влияния селанка и его фрагментов (тафтцина, ArgPGP и GP) на экспрессию генов, вовлеченных в процессы воспаления, в селезёнке мыши через 6 и 24 часа после введения 94
3.3. Временная динамика экспрессии гена Всіб, генов-мишеней и генов-корепрессоров белка BCL6 в селезёнке мыши под действием селанка и его фрагментов 98
3.3.1. Временная динамика экспрессии гена Всіб под действием селанкаи его фрагментов 98
3.3.2. Временная динамика экспрессии генов-мишеней белка BCL6 под действием селанка и его фрагментов 100
3.3.3. Временная динамика экспрессии генов-корепрессоров белка BCL6 под действием селанка и его фрагментов 101
Глава 4. Обсуждение результатов 104
4.1. Влияние однократного и курсового введения селанка на изменение транскриптома клеток мозга и селезёнки крысы 104
4.1.1. Влияние однократного и курсового введения селанка на изменение транскриптома клеток гиппокампа крысы 104
4.1.2. Влияние однократного и курсового введения селанка на изменение экспрессии генов Actnl, СхЗсгІ, Fgf7, Ptprn2 и Slc6a2C в гиппокампе, лобной коре, мозжечке и селезёнке крысы 113
4.2. Изменение экспрессии генов, вовлеченных в процессы воспаления, под действием селанка и его фрагментов в селезёнке мыши 116
4.3. Временная динамика экспрессии гена Всіб, генов-мишеней и генов-корепрессоров белка BCL6 в селезёнке мыши под действием селанка и его фрагментов 122
Заключение 127
Выводы 129
Список литературы 131
Публикации по теме диссертации 159
- Нейропептиды
- Анализ экспрессии генов на уровне мРНК
- Анализ влияния однократного и курсового введения селанка на изменение экспрессии генов Actnl, СхЗсгІ, Fg/7, Ptprn2 и Slc6a20 в гиппокампе, лобной коре и мозжечке крысы
- Временная динамика экспрессии гена Всіб, генов-мишеней и генов-корепрессоров белка BCL6 в селезёнке мыши под действием селанка и его фрагментов
Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время в медицинской практике для профилактики и лечения различных заболеваний применяется множество лекарственных средств разной природы. Но, несмотря на огромное количество разработанных лекарственных препаратов, проблема лечения многих из ныне существующих заболеваний остаётся нерешённой. В связи с этим одной из важнейших задач молекулярной биологии является разработка и изучение механизма действия новых лекарственных препаратов, которые окажутся более эффективными по сравнению с существующими продуктами фармации. На данный момент одним из ведущих направлений разработки лекарственных препаратов является использование соединений на основе природных регуляторных пептидов, которые с одной стороны оказывают направленное воздействие на организм, а с другой - практически не имеют побочных эффектов. Синтетические регуляторные пептиды обладают широким спектром клинического действия, однако до настоящего времени точный механизм их действия на организм остаётся неясным. Поэтому изучение механизма действия синтетических регуляторных пептидов является одной из наиболее актуальных задач современной молекулярной биологии. В данном контексте большой интерес для изучения представляет изменение экспрессии генов, функционирующих в здоровом организме и реагирующих в ответ на различные физиологические воздействия.
К числу лекарственных препаратов на основе природных регуляторных пептидов относится разработанный в Институте молекулярной генетики РАН в сотрудничестве с НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН и недавно вошедший в клиническую практику в качестве анксиолитического и нооторопного средства пептидный препарат селанк. Селанк является синтетическим аналогом тафтцина - короткого фрагмента Thr-Lis-Pro-Arg тяжёлой цепи иммуноглобулина G человека, удлинённого с С-концевой части
молекулы трипептидом Pro-Gly-Pro для повышения метаболической стабильности и продолжительности действия пептида. В клинике было показано, что данный препарат эффективно купирует чувство тревоги и страха и наряду с этим обладает ноотропным действием, оказывая позитивное влияние на формирование памяти и процессы обучения. Благодаря наличию данных свойств, селанк приобрёл широкое применение в лечении и профилактике стрессовых и тревожных состояний, генерализованных тревожных расстройств и неврастении, а также в качестве стимулирующего средства при повышенных психоэмоциональных нагрузках. В исследованиях in vitro и in vivo было показано, что селанк также обладает выраженными противовирусными свойствами в отношении вирусов гриппа А человека, вируса простого герпеса, цитомегаловируса и др.
Ранее было установлено, что пептидные препараты способны изменять экспрессию генов. Так, семакс, синтетический аналог фрагмента АКТГ4-7, обладающий выраженным ноотропным и нейропротективным действием, способствует повышению экспрессии нейротрофинов как на уровне белка, так и на уровне мРНК. В отношении селанка подобные исследования практически не проводились, и, несмотря на имеющиеся сведения о его способности оказывать действие на экспрессию мРНК гена Bdnf в мозге крысы, механизм действия пептида пока остаётся неясным. Кроме того, исследования деградации селанка в плазме крови и мозге крысы, а также выявление самостоятельных эффектов его фрагментов, ставит вопрос о влиянии на экспрессию генов каждого из них в отдельности.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы стало изучение влияния селанка на транскрипционный профиль клеток мозга и селезёнки крыс и мышей. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
Анализ влияния однократного и курсового введения селанка на изменение транскрипционного профиля клеток гиппокампа крысы с использованием технологии кДНК-микрочипов.
Отбор генов с наиболее значительным изменением экспрессии мРНК в гиппокампе крысы после однократного и курсового введения селанка и анализ экспрессии отобранных генов в лобной коре, мозжечке и селезёнке крысы.
Анализ экспрессии генов, вовлечённых в процессы воспаления, в селезёнке мыши через 6 и 24 часа после введения селанка и трёх его фрагментов - тафтцина, Arg-Pro-Gly-Pro (ArgPGP) и дипептида Gly-Pro (GP) и отбор генов с наиболее значительным изменением экспрессии.
Анализ временной динамики экспрессии гена ВЫб, генов-мишеней и генов-корепрессоров белка BCL6 в селезёнке мыши под действием селанка и его фрагментов.
Научная новизна и практическая значимость работы Показано, что однократное и курсовое введение селанка приводит к широкомасштабному изменению транскрипционного профиля клеток гиппокампа крысы. Большинство генов, уровень мРНК которых изменился более чем в 2 раза, кодируют белки, ассоциированные с плазматической мембраной (в том числе трансмембраннные белки). Это позволяет говорить о наличии у селанка способности регулировать ионный гомеостаз клеток гиппокампа и, тем самым, модулировать на молекулярно-генетическом уровне различные ион-зависимые процессы, к которым относятся процессы обучения и формирования памяти.
Показано, что как однократное, так и курсовое введение селанка приводит к изменению в экспрессии генов Actnl, СхЗсгІ, Fg/7, Ptprn2 и Slc6a20 в гиппокампе крысы. Действие селанка на экспрессию данных генов носит тканеспецифичный характер, при этом наиболее близкий паттерн изменения экспрессии их мРНК наблюдается в лобной коре и мозжечке. Наиболее
сильный ответ отобранных генов был отмечен в селезёнке после однократного введения селанка.
Показано, что селанк и его фрагменты (тафтцин, ArgPGP и GP) изменяет экспрессию мРНК генов цитокинов, хемокинов, их рецепторов и некоторых других генов, вовлечённых в процессы воспаления, в селезёнке мыши. При этом наибольшее количество генов изменили экспрессию после введения дипептида GP.
Показано, что селанк и его фрагменты оказывают сложное мультинаправленное действие на динамику экспрессии гена ВЫб, который играет ведущую роль в формировании и развитии иммунной системы, а также на динамику экспрессии генов-мишеней и генов-корепрессоров белка BCL6.
Полученные результаты позволяют расширить представления о механизме действия синтетического регуляторного пептида селанк на уровне транскрипции генов и объяснить некоторые аспекты клинического действия этого пептида с молекулярно-генетической точки зрения. Быстрое и мощное действие селанка и его фрагментов на экспрессию генов, вовлечённых в процессы воспаления, даёт основания предложить этот пептид в качестве иммуномодулирующего средства для профилактики и лечения вирусных и бактериальных инфекций разных типов.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 4 статьи и 5 сообщений в материалах тезисов научных конференций и симпозиумов.
Апробация диссертации
Результаты, полученные в данной работе, были представлены на следующих конференциях и конгрессах: конференции Европейского Общества Генетики Человека (ESHG) в 2009 и 2010 гг., VI Съезд Российского общества медицинских генетиков (14-18 мая 2010 г., Ростов-на-Дону, Россия), Седьмой
Международный Междисциплинарный Конгресс «Нейронаука для медицины и психологии» (3-13 июня 2011 г., Судак, Крым, Украина).
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов исследования, заключение, выводы и библиографический указатель. Список литературы состоит из 272 источников, среди которых 79 источников отечественной и 193 источников зарубежной литературы. Диссертация содержит 8 таблиц и 11 рисунков.
Нейропептиды
Нейропептиды (НП) - представители регуляторных пептидов, образующиеся в центральной или периферической нервной системе и регулирующие физиологические функции организма человека и животных. Термин ввел Д. Де Вид в 1969 году. Значительный вклад в изучение НП внесли Р. Гиймен и Э. Шалли, которые впервые показали, что гипоталамус способен регулировать деятельность гипофиза посредством выделения малых количеств пептидов - рилизинг-факторов, а также определили последовательность аминокислотных остатков в некоторых гормонах гипоталамуса (окситоцине и вазопрессине) и осуществили их лабораторный синтез (Guillemin, 1964; Schally и др., 1968; Schally и др., 1969; Guillemin, 1971). Изучение регуляторных пептидов (в частности нейропептидов) в России тесно связано с именем И.П. Ашмарина. К числу его достижений можно отнести создание концепции функционального континуума РП (а в дальнейшем математической модели действия пептидных комплексов), всестороннее исследование плейотропности ряда НП. Большое внимание было уделено изучению биологической активности производных адренокортикотропного гормона (АКТГ). Также было выявлено и охарактеризовано новое семейство РП - глипролинов, образующихся в ходе биодеградации коллагена и эластина. Данные исследования впоследствии привели к созданию нового лекарственного пептида - семакса, вошедшего в клиническую практику в качестве ноотропного средства, а также средства профилактики и лечения инсульта и ряда других патологий (Вальдман, 1982; Ашмарин и др., 1986; Ашмарин и др., 1994; Ашмарин и др., 1996; Ашмарин и др., 1999).
Было показано, что большинство НП образуются в нервных клетках путем расщепления крупных молекул-предшественников по строго определенным связям. Таким образом, из одной молекулы-предшественника, синтезируемой обычным путем на рибосомах, образуется целый набор НП, обладающих разнообразными свойствами. Например, из полипептида проопиомеланокортина (ПОМК), состоящего из 265 аминокислотных остатков, образуются АКТГ, липотропин, меланоцитстимулирующий гормон (МСГ) и др. В свою очередь, некоторые из этих НП образуют меньшие молекулы, действие которых может и количественно и качественно отличаться от действия исходных веществ. В ряде органов и тканей не нервными клетками синтезируются и секретируются пептиды, идентичные или близкие по строению и функциям многим НП. Это говорит о том, что НП являются частью общей системы РП. (De Wied D и др., 1982; Krieger, 1983).
НП регулируют практически все функции ЦНС - болевую чувствительность, состояние сон-бодрствование, половое поведение, процессы фиксации информации и др. Кроме того, НП управляют вегетативными реакциями организма, регулируя температуру тела, дыхание, артериальное давление, мышечный тонус и т.д. Предположительно, в организме существует совокупность пептидных регуляторов, обеспечивающая все необходимые оттенки модуляций процессов жизнедеятельности. Эта совокупность представляет собой систему, в которой изменение количества любого пептида приводит к изменению активности других НП, а, следовательно, к отдаленным по времени эффектам. Именно это определяет исключительную функциональную динамичность НП (Ашмарин и др., 1999).
НП могут содержать в молекуле до 50 аминокислотных остатков, а размер активного центра, необходимого для взаимодействия с рецептором, не превышает обычно 4-5 аминокислотных остатков. Остальные участки НП выполняют дополнительные функции, например, обеспечивают устойчивость к действию протеолитических ферментов (период полураспада НП колеблется от несколько секунд до мин) (Вальдман, 1982).
К наиболее изученным можно отнести следующие семейства нейропептидов: Гипоталамические либерины и статины
Данное семейство объединяет НП, основной функцией которых является регуляция выхода гормонов гипофиза. Большинство представителей семейства синтезируется в гипоталамусе. Либерины оказывают стимулирующее действие на синтез гипофизарных гормонов, статины -тормозят его. Так, например, тиреотропин-рилизинг-гормон (тиролиберин), усиливающий продукцию тиреотропного гормона гипофиза, обладает высокой противотревожной активностью и способен регулировать эмоциональное поведение. Гонадотропин-рилизинг-гормон (гонадолиберин), усиливающий выход лютеинезирующего и фолликулостимулирующего гормонов гипофиза, способен оказывать влияние на половое поведение за счет непосредственного действия на соответствующие области мозга. Кортикотропин-рилизинг-гормон (кортиколиберин) воздействует на переднюю долю гипофиза и активирует продукцию АКТГ. Он также способен подавлять половое поведение, потребление пищи и влиять на эмоциональное состояние. Основным представителем статинов является соматостатин, который подавляет секрецию гипоталамусом соматолиберина и секрецию гипофизом тиреотропина и соматотропина (Папсуевич и др., 1986).
Опиоидные нейропептиды
Наиболее многочисленное и разнообразное по функциям семейство НП. Представители данного семейства являются естественными лигандами к опиоидным рецепторам и имеют общие особенности структуры. В качестве основы все представители семейства содержат схожие мет- и лей-энкефалиновые структуры, в зависимости от наличия которых семейство делится на две группы - энкефалиновые, включающие структуры YGGFM и YGGFL, и параэнкефалиновые, включающие аналоги этих структур.
В свою очередь группа энкефалиновых опиоидных НП в зависимости от пептида-предшественника, из которого образуются конечные пептиды, делится на 3 подгруппы: производные проопиомеланокортина (а-, Р- и у эндорфины, дез-тирозил-у-эндорфин, метэнкефалин и др.), производные проэнкефалина А (адренорфин, лей-энкефалин, «октапептид», «гептапептид» и др.) и производные продинорфина (динорфин А, а- и [3-неоэндорфины, леуморфин и др.). Группа параэнкефалинов включает дерморфин-7 и Р-казаморфин-7, которые являются продуктами неполного гидролиза казеина и глютена в желудочно-кишечном тракте.
По месту синтеза опиоиды сильно различаются - большая часть эндорфинов и часть мет-экефалина образуются в гипофизе; динорфины, неоэндорфины, леуморфин - преимущественно в мозге; адренорфин, «окта»-и «гептапептиды» - в надпочечниках; большая часть лей-энкефалина и часть мет-энкефалина образуются как в мозге, так и в надпочечниках.
К основным свойствам опиоидных НП относят способность оказывать обезболивающие действие, обусловленное их связыванием с рецепторами опиоидной системы организма. Система опиоидных пептидов головного мозга играет важную роль в формировании мотиваций, эмоций, поведенческой привязанности, реакции на стресс и боль и в контроле приёма пищи. Также отмечено воздействие опиоидов на иммунную систему. Так (3-эндорфин является активатором естественных киллеров, играющих огромную роль в противоопухолевой активности организма (Zioudrou и др., 1979; McDowell и др., 1987; Olson, 1993;). Меланокортины
Меланокортины представляют семейство НП, принадлежащих к группе так называемых стрессовых пептидов, образующихся в результате протеолиза молекулы-предшественника проопиомеланокортина (ПОМК). Семейство делится на 2 группы - кортикотропины (АКТГ и его фрагменты АКТГ4_7 и АКТГ4-ю) и меланотропины (а-, Р-, у-меланоцит-стимулирующие гормоны).
Наиболее ярким представителем семейства является АКТГ гипофизарный гормон, который контролирует синтез и секрецию гормонов коры надпочечников. В основном АКТГ влияет на синтез и секрецию глюкокортикоидов - кортизола, кортизона и кортикостерона, а также параллельно повышает синтез надпочечниками прогестерона, андрогенов и эстрогенов. Последовательность AKTTVH соответствует последовательности а-меланоцит-стимулирующего гормона (а-МСГ), структура которого идентична для всех позвоночных (Antonawich и др., 1994; Hoi и др., 1995).
Помимо эндокринных эффектов АКТГ обладает способностью влиять на поведение. Так, было продемонстрировано, что введение АКТГ может снимать чувство беспокойства, влияет на запоминание и вызывает ряд других поведенческих реакций у животных. Установлено, что минимальные фрагменты АКТГ4_7 и АКТГ4.10 оказывают воздействие на формирование памяти и процессы обучения (Mirsky и др., 1953; Murphy и др., 1955).
Анализ экспрессии генов на уровне мРНК
Для создания целостной картины в изучении механизма действия регуляторных пептидов и их синтетических аналогов необходимо принимать во внимание их способность воздействовать на функции организма на уровне транскриптома и протеома. Использование молекулярно-биологических методов исследования позволяет оценить степень влияния регуляторных пептидов на экспрессию генов как на уровне мРНК, так и на уровне белка.
Среди наиболее распространенных технологий в анализе экспрессии генов на современном этапе развития молекулярной биологии и генетики является технология кДНК-микрочипов. Так как на чипе могут быть расположены десятки тысяч зондов, то с помощью такой технологии возможно одновременное проведение множества экспериментов. Таким образом, использование этого подхода позволило значительно ускорить и упростить многие типы исследований, и, в первую очередь, анализ транскрипционного профиля клеток, в том числе под воздействием различных лекарственных препаратов (Celis и др., 2000; Velculescu и др., 2000).
Существует два основных типа микрочипов: точечный микрочип, получаемый нанесением фрагментов ДНК на покрытое гелем предметное стекло, и олигонуклеотидный микрочип высокой плотности, который производится путем прямого синтеза олигонуклеотидов на стеклянной подложке и может включать в себя до сотен тысяч последовательностей. Принцип действия микрочипов основан на получении экспрессионных профилей методом мультиплексной гибридизации с использованием сложных смесей меченных молекул ДНК или РНК. Интенсивность гибридизационного сигнала в каждой позиции микрочипа при сканировании лазером с определенной длиной волны пропорциональна относительному содержанию специфической ДНК или РНК в составе зонда. Для адекватной интерпретации полученных количественных данных, отражающих изменение экспрессии тех или иных генов, их нормализуют относительно уровня экспрессии генов сравнения. Обычно в качестве генов сравнения используются гены «домашнего хозяйства», высоко представленные и стабильно экспрессирующиеся в исследуемой ткани (Реапо и др., 2006; Teng и др., 2009).
Не менее распространенными в экспрессионном анализе является метод обратнотранскрипционной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), в ходе которой производится наработка кДНК-копий, количество которых соответствует исходной популяции РНК. кДНК используется в качестве матрицы для последующей амплификации интересующего фрагмента (Doak и др., 2012). Определение уровня мРНК того или иного гена также проводят с использованием полуколичественной ПНР и количественной ПНР в реальном времени (ПЦР-РВ). Для определения относительной концентрации ПЦР-продукта по окончании полимеразнои реакции используются флуоресцентные (SYBR Green I, EtBr) и радиоактивные (у-Р32) метки, обеспечивающие флуоресцентный сигнал или излучение, интенсивность которого прямо пропорциональна количеству ПЦР-продукта. По отклонению от нормы концентрации ПЦР-продукта определяют относительное изменение уровня мРНК исследуемого гена (Zipper и др., 2004; Carleton, 2011).
ПЦР-РВ позволяет определять выход продукта реакции после каждого цикла амплификации. Для детекции количества амплифицированной ДНК используются флуоресцентные красители (интеркалирующие агенты, флуоресцентно-меченные олигонуклеотидные зонды, комплементарные участку амплифицируемого фрагмента) обеспечивающие сигнал, прямо пропорциональный количеству ПЦР-продукта (Ponchel и др., 2003).
Для анализа экспрессии генов методом ПЦР-РВ используют два подхода - абсолютный и относительный количественный анализ. В первом случае проводят сравнение результатов измерения флуоресценции стандартов, в которых точно известна концентрация амплифицируемого продукта, и исследуемых образцов. Во втором - определяют изменения уровней экспрессии изучаемых генов относительно уровней экспрессии генов сравнения. Относительный количественный анализ не требует использования стандартов. Для подсчета уровня экспрессии изучаемого гена в сравнении с экспрессией соответствующего референсного гена используют принятые математические модели, которые основываются на сравнении пороговых циклов флуоресценции и вычислении точек пересечения кривых реакций амплификации (Nolan и др., 2006; Hurteau и др., 2002).
Использование современных молекулярно-генетических технологий в экспрессионном анализе позволяет быстро и эффективно оценивать изменения транскрипционного профиля клеток в норме и патологии, а так же под воздействием различных лекарственных препаратов. Лидирующими в данной области являются технологии кДНК-микрочипов.
Анализ влияния однократного и курсового введения селанка на изменение экспрессии генов Actnl, СхЗсгІ, Fg/7, Ptprn2 и Slc6a20 в гиппокампе, лобной коре и мозжечке крысы
Данные, полученные с использованием кДНК-микрочипов, показали, что в гиппокампе крысы наблюдается достоверное изменение уровня мРНК генов Actnl, СхЗсгІ, Fgf7, Ptprn2 и Slc6a20, как после однократного, так и после курсового введения селанка (Рис. 5). В связи с этим данные гены были отобраны для дальнейшего более детального изучения.
Следует отметить, что для четырёх генов направление изменения уровня мРНК после однократного введения селанка соответствует таковому после курсового введения. Так для генов Fg/7, Ptprn2 и Slc6a20 наблюдается повышение уровня мРНК после использования обеих схем введения, а для гена Actnl, напротив, двукратное падение уровня мРНК в обоих случаях. Разнонаправленное изменение экспрессии отмечено для гена СхЗсгІ, уровень мРНК которого, снижается после однократного введения селанка и возрастает после курсового введения пептида.
С использованием метода количественной ПЦР-РВ была проведена оценка изменения уровня мРНК отобранных генов в лобной коре и мозжечке крысы. Было показано, что в лобной коре наибольшее повышение экспрессии отмечено для гена Slc6a20 после однократного введения селанка, которое составляет 3,9 раза (Рис. 6).
После курсового введения пептида изменение уровня мРНК данного гена менее выражено и составляет 1,8 раза. Достоверным изменением экспрессии при использовании обеих схем введения селанка также характеризуется ген СхЗсгІ, для которого отмечено двукратное повышение уровня мРНК после однократного введения и 1,5-кратное повышение после курсового введения пептида. Для генов Fgf7 и Ptprn2 статистически значимых отличий выявлено не было.
В мозжечке крысы для генов СхЗсгІ и Ptprn2 отмечено статистически значимое изменение уровня мРНК в ответ на однократное и курсовое введение селанка (Рис. 7).
При этом для гена Ptprn2 наблюдается однонаправленное изменение экспрессии (снижение) после однократного и курсового введения селанка в 1,5 и 2,0 раза, соответственно. Для гена СхЗсгІ, напротив, отмечен 1,5-кратный рост уровня мРНК после однократного введения селанка и равное по величине падение после курсового введения. Наиболее значительное повышение уровня мРНК было отмечено для гена SIc6a20 после курсового введения селанка.
Анализ экспрессии отобранных генов в трех отделах мозга крысы показал, что по сравнению с гиппокампом, в мозжечке и лобной коре в большинстве случаев наблюдается схожий паттерн изменения уровня мРНК как после однократного, так и после курсового введения селанка (Рис. 8).
Так при однократном введении селанка для генов Actnl, СхЗсгІ и Ptprn2 отмечено однонаправленное изменение уровня мРНК в лобной коре и мозжечке, и противоположное по направлению изменение уровня мРНК в гиппокампе. Уровень мРНК гена СхЗсгІ изменяется в гиппокампе, лобной коре и мозжечке как после однократного, так и после курсового введения селанка. Следует отметить, что при однократном введении селанка уровень мРНК данного гена достоверно снижается более чем в 2 раза в гиппокампе и возрастает в 2 и 1,5 раза в лобной коре и мозжечке, соответственно. После курсового введения, напротив, наблюдается рост уровня мРНК данного гена в гиппокампе и лобной коре и падение в мозжечке.
После однократного введения селанка отмечено статистически значимое 4-кратное повышение уровня мРНК гена Slc6a20 в гиппокампе и лобной коре крысы. После курсового введения пептида отмечено однонаправленное изменение уровня мРНК данного гена во всех рассмотренных отделах мозга. При этом наибольшее повышение экспрессии гена Slc6a20 после курсового введения было отмечено в мозжечке и составило 3,1 раза.
Временная динамика экспрессии гена Всіб, генов-мишеней и генов-корепрессоров белка BCL6 в селезёнке мыши под действием селанка и его фрагментов
Для дальнейшего исследования был отобран ген Вс16, который кодирует ядерный транскрипционный репрессор, играющий ключевую роль в развитии и нормальном функционировании иммунной системы. Экспрессия гена Вс16 является необходимым условием для формирования и надлежащего функционирования зародышевых центров, расположенных во вторичных лимфоидных органах и отвечающих за созревание, пролиферацию и дифференциацию В-клеток в плазматические клетки и клетки памяти (Nutt и др., 2011; Eto и др., 2011). Данный ген и кодируемый им белок также участвует в регуляции экспрессии цитокинов и поддержании Thl/Th2 баланса (Crotty, 2011; Ye и др., 1997).
Белок BCL6 является транскрипционным репрессором и содержит в своей структуре N-концевой BTB/POZ-домен и шесть цинковых пальцев на С-конце (Рис. 11). Гомодимерный или гетеродимерный BTB/POZ-домен, который представляет собой консервативный мотив белок-белкового взаимодействия, необходимый для репрессорной активности белка. Этот домен непосредственно взаимодействует с SMRT-корепрессором или родственными ядерными корепрессорами N-CoRl и N-CoR2, которые в свою очередь способны ассоциироваться с mSIN3A корепрессором, а также с ацетилазами гистонов (HDACs) для создания большого репрессионного комплекса. Взаимодействие ВТВ домена BCL6 через его латеральную бороздку с SMRT, N-CoR и дополнительным корепрессором BcoR является взаимоисключающим, поэтому данные корепрессоры конкурируют за связывание в данном сайте. Второй участок, локализованный в середине молекулы, содержит дополнительный автономный транс-репрессорный домен, который также отвечает за взаимодействие с mSIN3A корепрессором (Dhordain и др., 1998; Ahmad и др., 2003). Цинковые пальцы BCL6 связывают ДНК в соответствующем высокоафинном сайте, который содержит специфическую последовательность из 9 п.о. (TTCCTA/CGAA) и полностью гомологичен консенсусному сигналу сайта связывания трансдуктора и активатора транскрипции (STAT). Данный механизм позволяет BCL6 репрессировать транскрипцию через сайты связывания STAT-фактора и ингибировать цитокин-индуцированную транскрипцию. Помимо этого цинковые пальцы могут специфически связывать белки семейства Jun (c-Jun, JunB and JunD, известные как АР-1 факторы) и регулировать экспрессию генов, не имеющих сайтов связывания BCL6 в своих промоторных областях (Blimp-l,p21cdkl)(DentHflp., 1997).
В ходе исследования была проведена оценка временной динамики экспрессии гена Вс16 под действием селанка и его фрагментов. Для анализа были отобраны три временные точки: 30 мин, 90 мин и 3 ч. Было показано, что, через 90 мин и 3 ч после введения селанка наблюдается равное по значению, но противоположно направленное изменение уровня мРНК данного гена. Введение GP приводит к достоверному снижению уровня мРНК данного гена на всех временных интервалах. Введение ArgPGP и тафтцина оказывает незначительное воздействие на экспрессию гена Вс16 -статистически значимое снижение уровня мРНК наблюдается лишь спустя 90 мин после введения ArgPGP (Рис. 10).
Согласно литературным данным ген Всіб и его белковый продукт играют ключевую роль в регуляции врожденного иммунитета. Активация Всіб приводит к репрессии цитокинов, секретируемых при активации гуморального иммунного ответа, а также к поддержанию иммунного ответа по клеточному типу (Jardin и др., 2007). Это позволяет предположить, что волнообразное изменение экспрессии данного гена может быть связано с поддержанием баланса между Thl и ТЪ2-клетками и в целом согласуются с данными, полученными с использованием ПЦР-панели.
Среди мишеней BCL6 множество генов, которые вовлеченны во множество биологических процессов (Huifeng, 2002; Dent и др., 1997) (Рис. 11). Для более детальной оценки экспрессии генов-мишеней BCL6 были отобраны гены: Ccndl, Ccnd2, Cd44, Cd69 и Stat 1 (Табл. 7).
Регуляция клеточной пролиферации осуществляется за счет прохождения проверочных точек клеточного цикла, которые обеспечивают контроль надлежащего качества процессов репликации, накопления специфических для данной стадии белковых продуктов, а также наличия повреждений или ошибок в генетическом аппарате клетки. В результате каждую проверочную точку проходят только нормальные клетки, а клетки, имеющие какие-либо отклонения от нормы, элиминируются по пути апоптоза (Sherr и др., 2004). Одним из основных регуляторов клеточного цикла являются D-циклины, обеспечивающие переход клетки из фазы G-1 в S-фазу посредством активации циклин-зависимых киназ 4 и 6 (Sherr, 1995).
Нами было показано, что селанк и тафтцин не оказывают достоверного влияния на экспрессию гена Ccndl, кодирующего циклин Dl. GP и ArgPGP, напротив, приводят к изменению экспрессии данного гена после введения пептидов. Экспрессия гена Ccnd2 наиболее активно изменяется под действием ArgPGP.
Изменение уровня мРНК фактора дифференциации Cd44, который принимает активное участие в активации лимфоцитов и их рециркуляции (Cichy и др., 2003), наблюдается через 90 мин после введения селанка и GP. Активация гена Cd69, принимающего участие в активации Т-лимфоцитов (Marzio и др., 1999), наблюдается через 30 мин после введения селанка и ArgPGP, а также через 3 ч после введения GP.
Паттерн изменения уровня мРНК гена транскрипционного фактора Statl под действием селанка, практически идентичен паттерну изменения экспрессии гена Всіб под действием данного пептида. Ранняя активация экспрессии данного гена, также соответствующая изменению экспрессии Всіб, наблюдается после введения GP и тафтцина. Statl кодирует фактор транскрипции, который экспрессируется под действием разных типов интерферонов и оказывает инициирующую роль в восприимчивости организма к ним, а также способствует ингибированию эффекта IL4 (Levy и др., 2002). Наличие существенного сходства в направлении и значении изменения экспрессии генов Всіб и Statl дает возможность сделать предположение о способности селанка к специфической активации различных факторов транскрипции.
Полученные данные говорят о том, что изменение уровня мРНК генов-мишеней BCL6 не всегда коррелирует с изменением уровня мРНК гена-репрессора. Это может быть связано с включением ВСЬб-независимых путей регуляции их экспрессии, и/или с непосредственным действием пептидов на экспрессию данных генов. Подобные несоответствия можно также объяснить возможными изменениями экспрессии на уровне белка-репрессора под действием селанка и его фрагментов, количественное содержание которого в данном исследовании не определялось.
Как было сказано ранее, для эффективной репрессии генов-мишеней белок BCL6 должен связаться с белками-корепрессорами для образования полноценного и функционального репрессорного комплекса. В ходе исследования была проведена оценка уровня мРНК генов Всог, Ncorl и Ncor2, которые кодируют белки-корепрессоры и, по всей видимости, конкурируют между собой за связывание с BTB/POZ доменом белка BCL6 (Dhordain и др., 1998). Было показано, что селанк приводит к изменению экспрессии генов-корепрессоров BCL6 через 30, 90 мин и 3 ч после введения. Наиболее схожий паттерн изменения мРНК гена Вс16, Всог и Ncorl, наблюдался через 90 мин и 3 ч после введения GP и через 30 мин и 3 ч после введения селанка (Табл. 8).
Таким образом, изменение уровеня мРНК генов-корепрессоров BCL6 {Ncorl, Ncor2 и Всог) под действием селанка и его фрагментов в большинстве случаев совпадает по направлению с изменением уровня мРНК гена Вс16, что может быть связано с аналогичным влиянием пептидов на экспрессию данных генов. Это позволяет предположить, что селанк способен изменять экспрессию генов-мишеней белка BCL6 посредством регуляции экспрессии его генов-корепрессоров, а, следовательно, эффективности формирования функционального комплекса, необходимого для репрессии генов.
