Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
Ретиноиды: функциональное и клиническое значение, метаболические и сигнальные
пути, роль в канцерогенезе 9
1.1. Номенклатура, структура и химические свойства ретиноидов 9
1.2. Биологическая роль ретиноидов 10
1.3. Метаболизм ретиноидов
1.3.1. Поступление ретиноидов в организм человека 12
1.3.2. Транспорт и хранение ретиноидов 15
1.3.3. Биосинтез полностью транс-ретиноевой кислоты (ATRA)
1.3.3.1. Окисление ретинола в ретинальдегид 16
1.3.3.2. Восстановление ретинальдегида в ретинол 19
1.3.3.3. Окисление ретинальдегида в ATRA 20
1.3.3.4. Деградация и транспортировка ATRA в клеточное ядро 21
1.4. Сигнальный путь ретиноидов 22
1.4.1. Ретиноидные рецепторы 22
1.4.2. Транскрипционная регуляция экспрессии генов ретиноевои кислотой 24
1.4.3. Негеномные действия ретиноидов 28
1.4.4. Участие ретиноевои кислоты в различных сигнальных путях 28
1.5. Ретиноиды и процесс канцерогенеза 31
1.5.1. Участие ретиноидов в регуляции клеточного цикла и апоптозе 32
1.5.2. Участие ретиноидов в процессах дифференцировки и пролиферации клеток 34
1.5.3. Использование природных ретиноидов в медицинской практике 35
1.5.4. Использование синтетических ретиноидов в медицинской практике 36
1.5.5. Использование ретиноидов для лечения рака кожи, головы и шеи 38
1.5.6. Использование ретиноидов при раке легкого 38
1.5.7. Использование ретиноидов при раке молочной железы 39
1.5.8. Комбинированная химиотерапия с применением ретиноидов 39
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Клинические образцы
2.2. Анализ транскриптомных баз данных 43
2.3. Выделение РНК из тканей и клеточных культур 44
2.4. Реакция обратной транскрипции 45
2.5. Полуколичественная ОТ-ПЦР 45
2.6. Количественная ПНР в реальном времени 46
2.7. Вестерн-блоттинг 47
2.8. Обработка клеточных линий злокачественных опухолей толстой кишки 5-аза-2 -дезоксицитидином и трихостатином А 49
2.9. Статистический анализ 49
ГЛАВА 3. Результаты исследования
3.1. Идентификация генов, потенциально вовлеченных в метаболизм ретиноидов в нормальных и опухолевых тканях толстой кишки, желудка и легкого с помощью анализа транскриптомных баз данных 50
3.2. Анализ изменения экспрессии ATRA-зависимых генов при раке толстой кишки, раке желудка и легкого на основе транскриптомных данных 54
3.3. Определение изменения экспрессии генов, участвующих в метаболизме и сигнальном пути ретиноидов при раке толстой кишки
3.3.1. Гены, кодирующие ретинол-окисляющие ферменты 55
3.3.2. Гены, кодирующие ретиналь-восстанавливающие ферменты 60
3.3.3. Корреляция между изменением уровня мРНК и белка AKR1B10 3.3.4. Гены, кодирующие ретиналь-окисляющие и ATRA-деградирующие ферменты, ретинол- и ATRA-связывающие белки 62
3.3.5. Экспрессия генов метаболизма ретиноидов в клеточных линиях злокачественных опухолей толстой кишки 64
3.3.6. Гены ядерных рецепторов ретиноевои кислоты и ретиноидных X рецепторов. 65
3.3.7. Изменение экспрессии ATRA-зависимых генов 66
3.3.8. Изменение экспрессии ретиноид-ассоциированных генов в клеточных линиях злокачественных опухолей толстой кишки, обработанных 5-аза-с1С и TSA 70
3.4. Определение изменения экспрессии генов, участвующих в метаболизме и сигнальном пути ретиноидов при раке желудка 70
3.4.1. Гены, кодирующие ретинол-окисляющие ферменты 70
3.4.2. Гены, кодирующие ретиналь-восстанавливающие ферменты 72
3.4.3. Гены, кодирующие ретиналь-окисляющие и ATRA-деградирующие ферменты, ретинол- и ATRA-связывающие белки 74
3.4.4. Гены ядерных рецепторов ретиноевои кислоты и ретиноидных X рецепторов.. 74
3.4.5. ATRA-зависимые гены 76
3.5. Экспрессия генов, участвующих в метаболизме и сигнальном пути ретиноидов при немелкоклеточном раке легкого 77
3.5.1. Гены, кодирующие ретинол-окисляющие ферменты 77
3.5.2. Гены, кодирующие ретиналь-восстанавливающие ферменты 78
3.5.3. Гены, кодирующие ретиналь-окисляющие и ATRA-деградирующие ферменты, ретинол- и ATRA-связывающие белки 79
3.5.4. Гены ядерных рецепторов ретиноевои кислоты и ретиноидных X рецепторов 79
3.5.5. ATRA-зависимые гены 81
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов
4.1. Нарушения метаболизма ретиноидов при раке толстой кишки, желудка и легкого 85
4.2. Изменение экспрессии генов ретиноидных рецепторов 93
4.3. Изменение экспрессии ATRA-зависимых генов при раке толстой кишки, желудка и легкого 94
4.4. Участие эпигенетических изменений (метилирования ДНК и модификации гистонов) в инактивации исследованных генов 99
4.5. Корреляционая зависимость между аномальной экспрессией генов и клинико-патологическими характеристиками опухолей 100
Заключение 101
Выводы 102
Список литературы
- Поступление ретиноидов в организм человека
- Выделение РНК из тканей и клеточных культур
- Анализ изменения экспрессии ATRA-зависимых генов при раке толстой кишки, раке желудка и легкого на основе транскриптомных данных
- Изменение экспрессии ATRA-зависимых генов при раке толстой кишки, желудка и легкого
Поступление ретиноидов в организм человека
Ретиноиды выполняют многочисленные функции в организме и являются участниками различных биологических процессов.
Одна из наиболее важных функций ретинола - поддержание нормального эмбрионального развития (недостаток витамина А вызывает многочисленные врожденные аномалии), питание зародыша и уменьшение риска таких осложнений беременности, как малый вес новорожденного.
Ретиноиды крайне важны для функции зрения. В этом физиологическом процессе особую роль играет хромолипопротеин - сложный белок родопсин или зрительный пурпур, являющийся основным светочувствительным пигментом сетчатки. На свету родопсин расщепляется с образованием белка опсина и ретиналя, последний подвергается ряду конформационных изменений и превращению в транс-форму. С этими превращениями связана трансформация энергии световых лучей в зрительное возбуждение. В темноте происходит обратный процесс - синтез родопсина, требующий наличия активной формы альдегида - 11-цис-ретиналя, который может синтезироваться из цис-ретинола или транс-ретиналя [233]. ATRA обеспечивает нормальное проведение нервных импульсов (так как способствует синтезу миелина) и моделирует их передачу в синаптические структуры (способствует включению сульфатов в сульфацереброзиды, участвующие в депонировании медиаторов различных импульсов). Изменение количества ATRA влияет на экспрессию нейростероидных генов, что приводит к неправильному дорсовентральному функционированию спинного мозга, а также недостатку аксонов нервных клеток при передачи сигнала от спинного мозга к периферической нервной системе [116]. ATRA важна для формирования пространственной и семантической памяти, контроля передачи дофамина в мезолимбических и мезостриатальных нейронах [235].
Витамин А поддерживает деление иммунекомпетентных клеток и нормальный синтез иммуноглобулинов, в том числе секреторного иммуноглобулина А и других факторов специфической и неспецифической защиты - интерферона, лизоцима. Ретинол повышает барьерную функцию слизистых оболочек, увеличивает фагоцитарную активность лейкоцитов и других факторов неспецифического иммунитета [109]. Витамин А защищает от простуд, гриппа и инфекций дыхательных путей, пищеварительного тракта и мочевых путей. Достаточное содержание в крови витамина А - один из главных факторов, способствующих более легкой переносимости детьми в более развитых странах инфекционных заболеваний, таких как корь, ветряная оспа, тогда как в странах с низким уровнем жизни смертность от этих вирусных инфекций намного выше. Употребление витамина А в необходимом количестве продлевает жизнь больным СПИДом [163].
Витамин А и Р-каротин проявляют антиоксидантное действие, защищая мембраны клеток мозга от разрушительного действия свободных радикалов, при этом Р-каротин нейтрализует самые опасные виды свободных радикалов: радикалы полиненасыщенных кислот и радикалы кислорода. Антиоксидантное действие Р-каротина играет важную роль в предотвращении заболеваний сердца и артерий, он обладает защитным действием у больных стенокардией, а также повышает содержание в крови «полезного» холестерина (липопротеина высокой плотности) [204].
Ретинол необходим для поддержания и восстановления эпителиальных тканей, из которых состоят кожа и слизистые покровы. Он применяется при лечении практически всех заболеваний кожи (псориаз, трофические язвы, гнойные и воспалительные заболевания кожных покровов) [189]. При повреждениях кожи (раны, солнечные ожоги) витамин А ускоряет процессы заживления, а также стимулирует синтез коллагена, улучшает качество вновь образующейся ткани и снижает опасность инфекций. Витамин А принимает участие в синтезе стероидных гормонов (включая прогестерон), сперматогенезе, является антагонистом тироксина - гормона щитовидной железы.
Клетки очень чувствительны к концентрации ретинола, и даже незначительное отклонение от нормы сказывается на их жизнедеятельности [23]. Организм млекопитающих имеет надежную систему регуляции, позволяющую контролировать и поддерживать концентрацию ретинола на должном уровне. Для обозначения суточной потребности витамина А используют интернациональные единицы (IUs - international units; HUs = 0.3 мкг ретинола) или эквивалент активности ретинола (RAE - retinol activity equivalent), равный 1 мкг ретинола, или 12 мкг Р-каротина, или 24 мкг а-каротина/ Р-криптоксантина [89].
Диапазон концентрации ретинола в сыворотке крови при нормальных условиях составляет 1-3 мкмоль/л. При дополнительном поступлении витамина А поддержание этой концентрации регулируется несколькими механизмами, включая формирование неактивных метаболитов ретиноидов из ретинола и ATRA и/или увеличение концентрации циркулирующих ретиниловых эфиров.
В литературе обсуждаются данные о метаболизме ретиноидов, связанном с их поступлением в организм человека, транспортировкой и хранением, биосинтезом и деградацией ATRA, а также перемещением ATRA в ядро. Дополнительные стадии ретиноидного метаболизма могут включать изомеризацию ATRA под действием внутриклеточных изомераз в такие изоформы, как 9-цис, 11-цис и 13-цис.
В организме животных и человека синтез витамина A de novo не происходит. Источником ретиноидов в основном служат пищевые эфиры ретинола, содержащиеся в животных жирах, и растительные каротиноиды (провитамины А - а-, Р-каротины и Р-криптоксантин), поступающие в пищеварительную систему человека [89]. Из каротиноидов наибольшей биологической активностью обладает Р-каротин.
Полученные с животными жирами ретиниловые эфиры (преимущественно пальмитаты) до поглощения энтероцитами тонкой кишки гидролизуются до ретинола с помощью нескольких панкреатических ретинил-эфир-гидролаз (REH): панкреатической триглицерид липазы (PTL), кишечной фосфолипазы В (PLB), а также панкреатической липазы-2 (PLRP-2). Полагают, что основную роль в превращении ретиниловых эфиров играет липаза PLB, которая проявляет наибольшую активность [182].
Неэтерефицированный ретинол в физиологических дозах попадает в клетки кишечника при помощи пассивного транспорта в комплексе с белком STRA6. Этот трансмембранный транспортер служит специфическим рецептором для ретинол-связывающего белка RBP4 [181]. STRA6 совместно с RBP4 осуществляет двунаправленный транспорт ретинола, поддерживая баланс концентрации ретинола между внутри- и внеклеточным пространством [97].
Контроль за главными этапами абсорбции Р-каротина и образования ретинола в кишечнике осуществляет транскрипционный фактор ISX (intestine-specific homeobox) [131].
Р-каротин поглощается щетинками клеточных мембран эритроцитов непосредственно в тонкой кишке с помощью пассивной диффузии. В основном здесь происходит его симметричное расщепление по центральной двойной связи (15,15 ) с образованием двух молекул ретиналя, прямого предшественника ретинола и ретиноевой кислоты (Рис. 2). Реакция проходит при участии цитозольной бета-каротин-диоксигеназы ВС01. Высокий уровень экспрессии ВС01 у человека показан для тощей кишки, печени и почек, низкий уровень - для простаты, яичек и скелетных мышц.
Диоксигеназа ВС02 осуществляет несимметричное расщепление Р-каротина с образованием Р-апокаротеноидов с разной длиной цепи (Р-аро-81-, Р-аро-10 -, Р-аро-12 -, Р-аро-14 -каротеналь) (Рис. 2). Обе оксигеназы экспрессируются в тонкой кишке, однако ВС02 проявляет значительно более низкую активность в расщеплении Р-каротина [89]. Предполагают, что несимметричное расщепление происходит в условиях недостатка антиоксидантов (при курении, состояниях оксидативного стресса и/или избытка каротина), при этом уровень ATRA понижается, а при нормальных физиологических условиях наблюдали симметричное расщепление.
Выделение РНК из тканей и клеточных культур
Полагают, что молекулярный механизм ATRA-зависимой дифференцировки происходит с помощью регуляции каскада событий в изменении экспрессии генов, которые кодируют транскрипционные факторы, метаболиты ATRA или транспортные белки, протоонкобелки, апоптоз-связанные белки, ростовые факторы и др. Выделяют три фазы ATRA-зависимой дифференцировки. В первой фазе участвуют гены, экспрессия которых изменяется практически сразу после обработки ATRA (от 4-х до 16 часов). Такие гены (например, RARa, RARfi, Hoxal, НохЫ, Сур26А1) имеют RARE в своих промоторах, поэтому происходит непосредственное связывание ATRA с гетеродимером RAR/RXR. У большой группы генов (например, РЪх, Sox6, Rex-1, Wnt-1 и др.) изменяется уровень экспрессии после обработки ATRA от одного до трех дней и участие в дифференцировке является опосредованным. Изменение экспрессия генов третьей фазы проявляется более чем через 3 дня с момента обработки ATRA [72].
Основным эффекторным геном р53 является ген р21 , который взаимодействует с различными CDK и ингибирует образование комплексов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла. Промотор ингибитора CDK р21 содержит RARE (DR5), что указывает на прямую регуляцию его экспрессии с участием рецепторов ATRA [129].
Члены семейства генов Нох определяют пространственную организацию эмбриона. Ряд генов этого семейства имеют хорошо узнаваемые RARE в своих промоторах [11]. Гены НОХ регулируются индукцией дифференцировки клеток с помощью ATRA. В эмбрионах ATRA может влиять на уровень экспрессии НОХ в конечностях [118].
С-тус ОТНОСИТСЯ к транскрипционным факторам, участвующим в регуляции пролиферации и апоптоза. Повышенную экспрессию белка с-тус наблюдали в большинстве опухолей человека [145]. В промоторе гена с-тус не найдены RARE, поэтому рецепторы ATRA связываются с ДНК не напрямую [96].
Ген STRA13 (stimulated by retinoic acid 13) отвечает за упаковку ДНК-связывающих белков в структуру спираль-петля-спираль. Показано, что при воздействии ATRA его экспрессия быстро изменяется в эмбриональных опухолевых клетках Р19. Однако остается неизвестным, взаимодействует ли STRA13 с ядерными рецепторами ATRA прямо или косвенно, так как в его промоторе RARE не обнаружены [218].
С/ЕВРє - член семейства ССААТ/энхансер связывающих белков -транскрипционный фактор, преимущественно экспрессирующийся при терминальной дифференцировке гранулоцитов [15]. C/ERPs-нокаутные мыши проявляют дисфункцию нейтрофилов, вызывающую оппортунистические инфекции и миелодисплазию. ATRA-индуцированная дифференцировка гранулоцитов в клеточных линиях промиелоцитной лейкемии ассоциирована с повышенным уровнем С/ЕВРє мРНК. Ген С/ЕВРе имеет RARE (DR5) в своем промоторе [171].
Комплекс ATRA/RAR/RXR может регулировать экспрессию генов и независимо от присутствия RARE в этих генах, например через регуляцию других транскрипционных факторов. Ретиноиды могут действовать через RAR, ингибируя АР-1-регулируемую клеточную пролиферацию [30]. Активирующий белок АР-1 представляет собой димер из двух белков семейств Fos- и Jun - модуляторов транскрипции, которые участвуют в изменении транскрипционной активности многих генов. ATRA также ингибирует активность транскрипционного фактора NFkB у мышей, контролирующего клеточный ответ на экзо- и эндогенные сигналы. Подавляя апоптоз, NFkB способствует выживанию раковых клеток [9]. Посредством RARP ATRA изменяет внутриклеточный уровень Са и, таким образом, контролирует активацию фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K), которая в нервных клетках способна активировать ряд сигнальных белков, включая некоторые онкобелки, важных для регуляции таких функций клетки как рост, выживаемость, старение и опухолевая трансформация [36]. RARa может взаимодействовать с мРНК в цитоплазме и контролировать трансляцию. Различные типы ATRA-регуляции включают способность активировать димеры ядерных рецепторов, отличные от RAR/RXR, и т.д. [22, 23]. Все эти механизмы дополняют возможные действия ретиноидов [30]. Ретиноевая кислота регулирует также транскрипцию большого количества некодирующих РНК посредством димеров RAR/RXR [23].
Ретинол и ретиналь также способны модулировать экспрессию генов. В клеточных линиях кератиноцитов (НаСаТ) регулирование экспрессии генов посредством ретинола и ретиналя происходит путем связывания с RXR и RAR, а также с ядерными рецепторами PPAR, TR и VDR [5].
Показано, что ATRA может ковалентно связываться с некоторыми регуляторными белками в результате ретинилирования (retinoylation) - ацилирования белков ретиноевой кислотой, посттрансляционной модификации белков, происходящей во многих эукариотических клетках. Для первой стадии ретинилирования требуется коэнзим А [220]. ATRA сначала преобразуется в активированное промежуточное соединение ретинил-коэнзим А с последующим образованием сложного эфира с гидроксильной группой тирозина, треонина или серина, или тио-эфира с сульфгидрильной группой цистеина. Источником для этой реакции, скорее всего, служит ретинил-глюкуронид, а не свободная ретиноевая кислота.
Ретинилированию могут подвергаться такие важные белки, как сАМР-зависимая протеинкиназа, цитокератины, рибонуклеотидредуктаза и др. [79, 159, 221, 231]. Показано, что ретиноиды влияют на функцию таких регуляторных белков как G-белки и белки ras-онкогенов [31, 202]. ATRA модулирует активность протеинкиназы С, регулирующей фундаментальные клеточные функции, включая пролиферацию, дифференцировку, канцерогенез и апоптоз. Ретиноевая кислота повышает стабильность мРНК кератина, что приводит к увеличению синтеза этого белка [50].
Большое количество публикаций посвящено взаимодействию ретиноевой кислоты с другими сигнальными путями. Например, сигнальный путь ATRA взаимодействует с сигнальными путями Wnt (wingless/integrated-growth-factors) [63], фактора роста фибробластов (FGF) [217], костного морфогенетического белка (BMP) [147], эстрогеновым и другими сигнальными путями, имеющими важное значение для регулирования фундаментальных процессов жизнедеятельности организмов.
Эстрогеновый сигнальный путь Взаимодействие между ретиноидным и эстрогеновым сигнальными путями показано при РМЖ. Методом иммунопреципитации хроматина на чипах обнаружено, что связывание RARa с ДНК в опухолевой клеточной линии молочной железы MCF-7 в высокой степени совпадает со связыванием рецептора эстрогена a (ERa) для многих ERa-зависимых генов [93]. В отличие от ATRA, которая оказывает антипролиферативное действие на некоторые раковые клетки молочной железы, эстрогены стимулируют пролиферацию преимущественно тех клеток, которые экспрессируются посредством ERa. Полагают, что ретиноидный сигнальный путь противодействует эстрогеновому сигнальному пути в клетках РМЖ, и связывание ERa с эстрогеном антагонизирует ретиноидный сигнальный путь. Также показано, что транскрипционный фактор FoxAl необходим для связывания RARa со специфическими сайтами генов-мишеней. На основе этих данных предполагают, что агонисты RAR должны проявлять активность в ERa-положительном РМЖ [52]. Считают, что RARa является неотъемлемой частью транскрипционного комплекса ERa в клетках MCF-7, обработанных эстрогеном [192]. Wnt/NOTCH-сигнальные пути
Сигнальный путь Wnt участвует в регуляции эмбриогенеза, дифференцировке клеток и развитии злокачественных опухолей [24, 54, 158, 241]. Полагают, что в процессе образования и развития клеток происходит конкуренция за связывание комплексов ядерных рецепторов (RXR, PPAR и др.) с генами, участвующими как в сигнальном пути ATRA, так и Wnt-сигнальном пути [87, 236].
Повышенная экспрессия трансмембранного рецепторного белка NOTCH положительно коррелирует с плохим прогнозом для больных с диагнозом РМЖ [86]. В опухолевых клеточных линиях молочной железы ATRA в больших концентрациях снижает экспрессию белка NOTCH3 и инвазивную способность опухоли [148].
Анализ изменения экспрессии ATRA-зависимых генов при раке толстой кишки, раке желудка и легкого на основе транскриптомных данных
На основе анализа современной биомедицинской литературы нами отобраны гены, потенциально участвующие в биосинтезе ATRA - основном метаболическом процессе ретиноидов, протекающем в изучаемых нами тканях. Первоначальный набор из 33 генов включал семь ADH (ADH1A, -В и -С, ADH2, ADH3, ADH4, ADH6), 16 RDH (RDH10, RDHL, RDH5, RoDH, RoDH4, RDHE2, XOR, RDH8, RDH 11-14, RDH 17, DHRS4, DHRS4L2, SDRO), две AKR (AKR1B1 и -BIO), три RALDH (RALDH1, 2 и 3), три CYP26 (CYP26A1, Bl и СІ), a также гены CRBP1 и CRABP2. Все эти гены могут проявлять ткане-специфичную экспрессию. Для идентификации кандидатных генов, вовлеченных в биосинтез ATRA в нормальных и опухолевых тканях, мы провели анализ разных транскриптомных баз данных: EST, ReffixA, ONCOMINE и RNA-seq (толстая кишка, Таблица 7), EST, ReffixA и ONCOMINE (желудок, Таблица 8), и EST (легкие, Таблица 9). Обнаружены мРНК 14-ти (толстая кишка), 15-ти (желудок) и 11-ти (легкие) генов, представляющих интерес для дальнейшего изучения, и для большинства из них показана дифференциальная экспрессия в опухолевых образцах по сравнению с нормой (ONCOMINE и/или EST) (Таблица 7-9). В нормальной слизистой толстой кишки экспрессируются в основном гены ADH1B, ADH1C и ADH3, кодирующие ретинол-окисляющие ферменты, в нормальной слизистой желудка -гены ADH1B, ADH1C, ADH3 и ADH4, в нормальных тканях легкого - ADH1B, ADH3 и ADH4. Содержание мРНК генов ADH1B, ADH1C и ADH3 резко снижено в опухолевых образцах толстой кишки. Уровень мРНК генов ADH1B, ADH1C и ADH4 значительно снижен в опухолевых образцах РЖ в отличие от гена ADH3, уровень мРНК которого остается неизменным. Содержание мРНК гена ADH1B резко снижено, а мРНК гена ADH4 уменьшено незначительно в опухолевых образцах легкого по сравнению с нормальной слизистой оболочкой в отличие от гена ADH3, уровень мРНК которого остается неизменным.
В нормальной слизистой оболочке толстой кишки согласно базе данных EST и Reffixa на высоком уровне обнаружена мРНК только одного из генов, кодирующих ретинол-окисляющие RDH - RDHL, уровень экспрессии которого снижен в опухолях. мРНК генов RDH10 и RDH5 обнаружена в нормальной слизистой толстой кишки на относительно меньшем уровне и в опухолях их содержание изменяется незначительно. Таблица 7. Экспрессия генов, участвующих в метаболизме ретиноидов, при РТК
В нормальной слизистой оболочке желудка выявлен достаточно высокий уровень мРНК генов RDH10 и RDHL. Экспрессия RDHL гена снижена в опухолевых образцах желудка, а экспрессия RDH10 незначительно повышена (приблизительно в два раза). Уровень мРНК генов окисления ретинола RDH10 и RDHL в нормальных тканях легкого почти не изменен.
Из мРНК, кодирующих ретиналь-восстанавливающие ферменты, в нормальных тканях толстой кишки обнаружены RDH11, AKR1B1 и AKR1B10. Содержание мРНК гена AKR1B10 резко снижено в опухолевых образцах толстой кишки, тогда как экспрессия AKR1B1 незначительно снижена (приблизительно в три раза), а экспрессия RDH11 незначительно повышена. Таблица 8. Экспрессия генов метаболизма ретиноидов при РЖ
В нормальной слизистой оболочке желудка на высоком уровне детектирована только мРНК гена RALDHJ, ее содержание в опухолях желудка уменьшено. В нормальных тканях легкого уровень экспрессии гена RALDH1 значительно снижен, а уровень экспрессии RALDH2 - незначительно.
Обнаружено небольшое повышение мРНК гена CYP26AJ, кодирующего фермент, отвечающий за деградацию ATRA при РТК. Содержание мРНК гена CRBP1, кодирующего клеточный ретинол-связывающий белок, остается неизменным в опухолевых тканях РТК по сравнению с нормальными клетками согласно базе данных EST и незначительно повышается согласно данным ONCOMINE. При РЖ экспрессия генов CYP26A1 и CRBP1 остается неизменной, RefExA данные показывают относительно низкую их экспрессию.
Одновременное использование разных транскриптомных баз данных позволило нам идентифицировать панель генов, потенциально вовлеченных в биосинтез ATRA в нормальных и опухолевых тканях толстой кишки, желудка и легкого и установить тенденции изменения экспрессии этих генов при РТК, РЖ и РЛ. Результаты биоинформатического транскриптомного анализа сравнили с данными полу количественного ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ. Для экспериментальной проверки отобраны гены, экспрессирующиеся на высоком и среднем уровне в нормальных и/или опухолевых тканях толстой кишки (ADHIB, ADHIC, ADH3, RDHIO, RHDL, RDH5, RDHll, AKRIBI, AKRIBIO, RALDHl, RALDH3, CYP26A1 и CRBP1), желудка (ADHIB, ADHIC, ADH3, ADH4, RDHIO, RHDL, RDHll, RDH12, AKRIBI, AKRIBIO и RALDHl) и легкого (ADHIB, ADH3, ADH4, RHDL, RDHll, AKRIBI, AKRIBIO, RALDHl и RALDH2). Эти наборы генов мы расширили, добавив гены, экспрессия которых выявлена биоинформатическим анализом на невысоком уровне или вообще не обнаружена, но, которые, как известно из литературных данных, кодируют высокоактивные ретиноид-ассоциированные ферменты (РТК - ADH1A, ADH2, ADH4, RoDH4, RDH12 и RALDH2; РЖ - ADH1A, ADH2, RoDH4, RALDH2, RALDH3 и CYP26A1; НМШ-ADHIA, ADHIC, ADH2, RDHIO, RoDH4, RDH12, RALDH3 и CYP26A1) или известные белки, ассоциированные с опухолями желудочно-кишечного тракта (RDH5 - РЖ и НМРЛ). Мы также анализировали экспрессию генов CRBP1 (РЖ и НМРЛ) и CRABP2 (РКТ, РЖ и НМРЛ), играющих важную роль в биосинтезе и транспортировке ATRA в ядро клетки.
Изменение экспрессии ATRA-зависимых генов при раке толстой кишки, желудка и легкого
В опухолевых тканях толстой кишки уровень мРНК значительно снижен для генов RDHL и RDH5, наблюдается разнонаправленное изменение экспрессии гена RDHIO, а уровень мРНК гена ADH3 не изменяется в большинстве образцов (Рис. 28; Таблица 12). В опухолях желудка по сравнению с нормой уровень мРНК гена RDHL изменяется не столь существенно, а уровень мРНК генов RDHIO, ADH3 и RDH5 остается неизменным (Рис. 29; Таблица 15). При НМРЛ наблюдали значительное снижение уровня мРНК генов ADH3 и RDHL в большинстве опухолевых образцов, содержание мРНК гена ADH1C понижалось значительно лишь в трети и не изменялось в половине образцов, а для генов AHD4, RDH10 и RoDH4 показано разнонаправленное изменение экспрессии (Рис. 30; Таблица 17). j, Автв
Нарушение метаболизма и сигнального пути ретиноидов при РЖ. Толщина и размер шрифта символов генов отражают уровень их экспрессии в нормальных тканях желудка, а толщина и размер стрелок - уровень изменения экспрессии генов в опухолевых тканях по сравнению со смежными нормальными тканями.
Для оценки суммарного эффекта выявленных изменений на биосинтез ATRA кроме уровня экспрессии генов необходимо учитывать активность соответствующих ферментов. И хотя сравнение кинетических констант должно быть сделано с большой осторожностью, т.к. при их определении часто используют различные методические подходы, можно с уверенностью сказать, что в реакции окисления ретинола наибольшей активностью обладают ADH4, RDH10, ADH1C и ADH1B ферменты [16, 170]. Генетические исследования показали, что эти ферменты необходимы для окисления ретинола в ретиналь in vivo. Например, Adhl" мутантные мыши проявляют 10-кратное уменьшение биосинтеза ATRA по сравнению с мышами дикого типа [115, 153]. Добавление ADH ингибиторов, 4-метилпиразола, этанола, ранитидин гидрохлорида или циметидина, приводит к уменьшению образования ATRA у мышей [45, 246]. RDH10 имеет самое низкое значение Km в реакции окисления ретинола (-0.035 цМ) среди всех МАО+-зависимых ретиноид-активных оксид оредуктаз [16]. Опубликованные значения каталитической активности изоферментов ADH широко варьируют, хотя средние кинетические константы ADH1 и RDH10 в реакции окисления ретинола существенно не отличаются {Km (цМ) 0.035-0.182 для членов ADH1 семейства) [33]. \ADH1B
Нарушение метаболизма и сигнального пути ретиноидов при НМРЛ. Толщина и размер шрифта символов генов отражают уровень их экспрессии в нормальных тканях легкого, а толщина и размер стрелок - уровень изменения экспрессии генов в опухолевых тканях по сравнению со смежными нормальными тканями.
Показано, что RDH10 представляет собой доминирующюю ретинол-окисляющюю RDH при эмбриогенезе мышей [198], в то время как семейство ADH ферментов играет важную роль в биосинтезе ATRA в клетках взрослого организма [115]. Следует отметить, что ADH ферменты - цитозольные белки, а высокая каталитическая эффективность окисления ретинола выявлена именно в цитозоле клеток слизистой оболочки толстой кишки [174].
RoDH4 и, в большей степени, оксидоредуктазы ADH3, RDHL и RDH5 характеризуются меньшей каталитической активностью в реакции окисления ретинола [39, 155], поэтому их вклад в реакцию окисления ретинола значительно меньше по сравнению с ADH4, ADH1 и RDH10, учитывая еще и меньший уровень содержания соответствующих мРНК в тканях толстой кишки, желудка и легкого.
Таким образом, выявленное нами в подавляющем большинстве опухолевых образцов резкое снижение уровня мРНК наиболее экспрессирующихся в тканях толстой кишки, желудка и легкого генов, кодирующих высокоактивные ферменты окисления ретинола в ретиналь, может приводить к значительному уменьшению образования ретиналя, и соответственно ATRA, а также к накоплению ретинола (Рис. 28-30).
ADH4, которая характеризуется наибольшей активностью среди всех ретинол-окисляющих ферментов, локализована в пищеварительном тракте в основном в тканях желудка. Снижение уровня ADH4, сопровождаемое уменьшением уровня ATRA, связано с повышением степени воспаления, атрофии и кишечной метаплазии [144]. Кинетические и генетические исследования показывают, что ADH1 и ADH4 могут выполнять две важные физиологические функции - окисление этанола в желудке и синтез ATRA. Нарушение синтеза ATRA под действием этанола может лежать в основе патогенеза алкогольного синдрома и онкозаболеваний верхней части желудочно-кишечного тракта, связанных с употреблением алкоголя [245].
В реакции восстановления ретиналя в ретинол участвуют гены МАЕ)Р+-зависимых RDH (RDH11 и RDH12), AKR (AKR1B10 и AKR1B1), а также гены ADH (в основном ADH4 и в значительно меньшей степени - ADH1). Наибольшей ретиналь-восстанавливающей активностью обладают RDH12, ADH4, RDH11 и AKR1B10 [17, 170].
Самые значительные изменения в уровне экспрессии претерпевают наиболее активно экспрессируемые гены: AKR1B10 - в тканях толстой кишки; RDHJ2, ADH4, AKR1B10 - в тканях желудка и RDH11 и AKR1B10 - в тканях легкого. Следует отметить, что уровень мРНК гена AKR1B10 значительно увеличивается в большинстве опухолевых образцов легкого по сравнению с нормальными тканями, в отличие от толстой кишки и желудка. Значение kc&t/Km для AKR1B10 в реакции восстановления ретиналя в ретинол примерно в 100 раз выше, чем у AKR1B1 и сравнимо с наиболее активными ферментами MDR и SDR [76]. Повышение экспрессии AKR1B10 должно приводить к еще большему уменьшению содержания ретиналя, а, следовательно, и ATRA при НМРЛ. С другой стороны, снижение уровня экспрессии генов, кодирующих ретиналь-восстанавливающие ферменты, может приводить к накоплению ретинола. Высокий уровень ретинола может нарушать многие клеточные процессы благодаря его неспецифическому связыванию. Токсичность ретинола показана для Adhl" мышей, у которых обнаружена резко сниженная активность биосинтеза ATRA [155]. Ретинол может претерпевать гидроксилирование под действием цитохромов Р450, образуя токсичные побочные продукты [188]. Исследования на трансгенных мышах показали, что ADH1 - основной фактор защиты против токсичности ретинола [155].
Значительное изменение количества белка AKR1B10 в большинстве опухолевых образцов толстой кишки, положительно коррелирующее с изменением уровня мРНК в одних и тех же образцах (Рис. 12), свидетельствуют о том, что его можно использовать как потенциальный протеомный маркер РТК.
Таким образом, мы наблюдаем аномальную экспрессию генов, кодирующих ферменты, необходимые для превращения ретиналя в ретинол, при РТК, РЖ и НМРЛ по сравнению с нормальными тканями.
У человека окисление ретиналя в ATRA катализируется RALDH1, -2 и -3. Нами показано, что уровень экспрессии гена RALDH1 значительно превышает таковой у генов RALDH2 и RALDH3 во всех трех изученных нами нормальных тканях. Содержание ретиноевой кислоты в крови Raldh" нокаутных мышей значительно уменьшается по сравнению с мышами дикого типа [154]. Снижение образования ATRA наблюдали и при добавлении ацетальдегида - ингибитора RALDH [246]. Обнаруженное нами значительное снижение экспрессии гена, кодирующего ретиналь-окисляющий фермент RALDH1, преобладающий в тканях толстой кишки, желудка и легкого, может также приводить к уменьшению образования ATRA.
Цитохром CYP26A1 катализирует расщепление ATRA на неактивные полярные метаболиты [191]. Немного повышенный уровень экспрессии гена CYP26A1 указывает на то, что даже незначительная деградация ATRA, может усиливаться в большинстве опухолей толстой кишки, желудка и легкого, что в свою очередь, приводит к уменьшению количества ATRA.
Ген CRABP2 кодирует белок, транспортирующий ретиноевую кислоту в ядро клетки, где она связывается с ретиноидными рецепторами. Повышение экспрессии гена CRABP2 в большинстве опухолевых образцов РТК и РЖ может усилить конкуренцию за связывание с ядерными рецепторами.
В опухолевых клеточных линиях толстой кишки RKO, НТ-29 и НСТ-116 мы наблюдали похожую картину изменения уровня экспрессии ключевых генов метаболизма ретиноидов (Рис. 13). Следует отметить, что уменьшение биосинтеза ретиноевой кислоты характерно для многих колоректальных опухолевых клеточных линий, включая вышеперечисленные, и происходит параллельно со снижением экспрессии генов RDHL и RDH5 [100]. Однако ферменты, кодируемые этими генами, обладают двойной ретинол/стерол-субстратной специфичностью и довольно низкой активностью в отношении ретинола. Уменьшение экспрессии этих генов не может быть основной причиной снижения синтеза ATRA.
Исследованные эпителиальные ткани (толстая кишка, желудок и легкие) отличаются не только набором генов, кодирующих ключевые ATRA-синтезирующие ферменты, но и изменением профиля их экспрессии при канцерогенезе (Рис. 28-30). Например, при НМРЛ происходит повышение уровня мРНК renaAKRIBlO, тогда как при РЖ и РТК - значительное снижение уровня этой мРНК.
