Введение к работе
Актуальность проблемы. Размеры органов растений контролируются двумя основными механизмами, а именно регуляцией клеточного деления и клеточного растяжения. Во время первой, так называемой, пролиферативной фазы развития любого органа клетки митотически делятся и растет их число. Затем клетки, продолжая делиться, начинают постепенно увеличиваться в размерах за счет роста и растяжения, а также дифференцируются. Регуляция клеточного деления и растяжения в растениях скоординирована и контролируется фитогормонами, микроРНК и большим количеством белковых факторов. Наиболее изученными являются взаимоотношения генетических факторов в апикальной меристеме побега, в то время как о генетической регуляции клеточной пролиферации в зачатках органов известно гораздо меньше. Одним из наиболее известных генов, контролирующих клеточную пролиферацию в зачатках листьев и цветков, является AINTEGUMENTA (ANT) (Krizek, 1999; Mizukami, Fischer, 2000). Транскрипция гена ANT регулируется трансмембранным белком ARGOS, экспрессия которого в свою очередь индуцируется фитогормонами ауксинами и цитокининами (Ни et al., 2003). Было показано, что трансгенные растения, сверхэкспрессирующие ген ANT под контролем 35S промотора, характеризуются несколько большими размерами генеративных и вегетативных органов, за счет увеличения количества клеток (Mizukami, Fischer 2000).
Размер органа растения зависит также от изначального количества недифференцированных клеток в апикальной и флоральной меристемах. Одними из наиболее изученных генов-регуляторов клеточной пролиферации в апикальной меристеме побега являются WUSCHEL (WUS) и CLAVATA3 (CLV3) (Haecker, Laux, 2001). Продукт гена CLV3 негативно влияет на пролиферацию апикальной и флоральной меристем через уменьшение экспрессии гена WUS, что способствует блокированию цитокининового сигнала регуляции клеточного деления (Sablowski, 2011). В то же время, в литературе имеется
довольно мало сведений о взаимодействии генов, контролирующих клеточную
пролиферацию в апикальной меристеме побега и в зачатках органов. Знания в этой области могут приблизить к пониманию особенностей генетической регуляции величины органов у растений и будут способствовать дополнению генных сетей новыми генами и связями между ними. В свою очередь, выяснение механизмов генетической регуляции роста растений, является весьма важным для народного хозяйства, так как данные исследования будут способствовать разработке подходов к получению сельскохозяйственных, декоративных и древесных растений с увеличенными размерами органов.
Для создания трансгенных растений с повышенным уровнем экспрессии целевых генов в основном применяется 35S промотор, активности которого часто оказывается недостаточно. В связи с этим поиск или создание более сильных, чем 35S промотор, растительных промоторов, а также создание генно-инженерных конструкций этих промоторов в сочетании с генами-регуляторами роста и развития растений являются весьма актуальными и, в конечном счете, могут привести к получению трансгенных растений с увеличенными размерами органов. Одним из путей создания новых эффективных промоторов является поиск более сильных природных гомологов 35S промотора вируса мозаики цветной капусты из группы каулимовирусов, а также создание их гибридных форм.
Цель исследования: определение роли и взаимодействия генов ARGOS, AINTEGUMENTA и CLAVATA3, а также возможности их использования в качестве целевых генов для создания трансгенных растений с увеличенными размерами органов.
Задачи исследования:
-
получить гибридные формы промоторов каулимовирусов и отобрать варианты с наибольшей активностью для создания трансгенных растений табака;
-
амплифицировать и клонировать гены ARGOS и CLAVATA3 резуховидки Таля Arabidopsis thaliana и AINTEGUMENTA рапса Brassica napus;
-
получить трансгенные растения табака с повышенным уровнем экспрессии гетерологичных генов ARGOS, AINTEGUMENTA и CLAVATA3;
-
провести сравнительный морфологический анализ полученных трансгенных растений табака;
-
определить фитогормональный статус и уровень экспрессии генов AINTEGUMENTA и ШЕХРА5 в трансгенных по гену CLAVATA3 растениях табака;
-
на основе литературных данных и полученных обобщенных результатов построить генную сеть, отражающую возможные пути взаимодействия генов ARGOS, AINTEGUMENTA и CLAVATA3.
Научная новизна. Методом рестрикции-лигирования получены гибридные формы промоторов каулимовирусов. Показано, что в трансгенных растениях табака промотор вируса мозаики георгина обладает большей активностью, чем 35S промотор. Впервые получены трансгенные растения табака с повышенным уровнем экспрессии гетерологичных генов AINTEGUMENTA В. napus, а также ARGOS и CLAVATA3 A. thaliana. Эктопическая экспрессия генов AINTEGUMENTA и ARGOS в табаке, в отличие от A. thaliana, способствовала, в первую очередь, увеличению размеров листьев и стебля, а размеры цветков изменялись в меньшей степени. Впервые показано, что сверхэкспрессия гена CLAVATA3 приводит к увеличению концентрации цитокининов и уменьшению уровня экспрессии гена AINTEGUMENTA в листьях трансгенных растений табака.
Практическая значимость работы. Генно-инженерные конструкции на основе бинарных векторов с промоторами каулимовирусов могут быть использованы для получения трансгенных растений с повышенным уровнем экспрессии различных целевых генов. Знания о взаимодействии генов-регуляторов роста между собой и с фитогормонами будут способствовать разработке стратегии создания хозяйственно-полезных растений с
увеличенными и уменьшенными размерами органов. Выделенные нами гены AINTEGUMENTA и ARGOS в сочетании с промоторами каулимовирусов могут быть использованы для увеличения размеров листьев и стебля у хозяйственно-ценных растений.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008), на 14-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), II Всероссийской школе-конференции молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе, 4 в журналах из Перечня ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах, содержит 6 таблиц и 16 рисунков. Включает в себя введение, обзор литературы (глава 1), описание методов исследования (глава 2), результаты исследования и их обсуждение (глава 3), заключение, выводы и список литературы (139 источников).
