Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Строение, регуляция и функции белка gpl 30 в мозге млекопитающих 12
1.1. Цитокины семейства IL-6 12
1.2. Структура гена Il6st 14
1.3. Структура белка gpl30 16
1.4. Строение сигнального комплекса на примере IL-6 19
1.5. Молекулярные внутриклеточные процессы с участием белка gpl 30 на примере рецептора IL-6 22
1.6. Гены, активирующиеся через gpl30 25
1.7. Супрессия передачи сигнала 27
1.8. Функция gpl30 и связанных с ним цитокинов в регуляции центральной нервной системы и поведения 30
1.9. Ассоциация между геном Il6st и каталепсией 36
Глава 2. Материалы и методы 40
2.1. Материалы 40
2.1.1. Химические реактивы 41
2.1.2. Оборудование 41
2.1.3. Программное обеспечение 41
2.1.4. Базы данных
2.2. Животные 43
2.3. Введение препаратов 43
2.4. Исследование поведения мышей в тесте открытого поля 43
2.5. Исследование вырожденности каталепсии 44
2.6. Секвенирование кодирующей последовательности гена IWst 44
2.7. Выделение РНК и ОТ-ПЦР 46
2.8. Определение характеристик gpl30 и степени его гликозилирования с помощью Вестерн блоттинга 48
2.9. Сравнение действия IL-6 ex vivo на экспрессию генов Il6st и Gfap в срезах гиппокампа 50
2.10. Статистический анализ данных 54
Глава 3. Результаты
3.1. Анализ нуклеотидной последовательности кДНК гена Il6st у мышей AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76 52
3.2. Влияние фрагмента 111.35-116.14 Мб хромосомы на уровнень транскрипции гена Il6st 52
3.3. Изучение соотношения гликозилированной и негликозилированной форм gpl30 у мышей, различающихся по предрасположенности к каталепсии 54
3.4. Изучение влияния липополисахарида на поведение и экспрессию гена Il6st и его гена-мишени - Gfap 60
3.5. Изучение влияния IL-6 на поведение мышей линии AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76...65
3.6. Влияние IL-6 на экспрессию генов Il6st и Gfap в срезах гиппокампа ex vivo 66
Глава 4. Обсуждение результатов 68
Выводы 72
Список цитируемой литературы
- Строение сигнального комплекса на примере IL-6
- Химические реактивы
- Выделение РНК и ОТ-ПЦР
- Изучение соотношения гликозилированной и негликозилированной форм gpl30 у мышей, различающихся по предрасположенности к каталепсии
Строение сигнального комплекса на примере IL-6
Теоретическая и научно-практическая ценность работы. Основным вкладом данного исследования в изучение генетических и молекулярных механизмов нарушений поведения является экспериментальное доказательство ассоциации наследственной каталепсии с чувствительностью к ЛПС и IL-6. Другим важным положением, продемонстрированным в работе, является экспериментальное доказательство участия белка gpl30 в механизме каталепсии мышей. Несмотря на то, что полученные экспериментальные результаты не подтвердили гипотезу о том, что наследственная каталепсия у мышей CBA/LacJ вызвана мутацией в гене Il6st, изменяющей его экспрессию или функцию белка gpl30, проделанная работа позволила сократить первоначальный список генов-кандидатов, ассоциированных с наследственной каталепсией у мышей CBA/LacJ. Была показана научно-практическая ценность конгенной линии AKR.CBA-D13MU76 как модели для экспериментального изучения молекулярных механизмов действия ЛПС и IL-6. Полученные результаты используются в курсе лекций «Молекулярные механизмы поведения» для студентов 4 курса факультета естественных наук НГУ.
Положения, выносимые на защиту:
1. Наследственная каталепсия у мышей линии CBA/LacJ не ассоциирована с изменениями в кодирующей части гена Il6st, а также с изменениями в экспрессии гена U6st и функциональной активности gpl30.
2. Конгенная линия мышей AKR.CBA-D13Mit76 обладает повышенным уровнем мРНК гена Il6st в стриатуме по сравнению с линиями AKR/J, CBA/LacJ и ASC.
3. Наибольший уровень мРНК гена Il6st для мышей линий AKR.CBA-D13MU76, AKR/J, CBA/LacJ и ASC обнаружен в среднем мозге и гипоталамусе. Наибольший уровень обеих форм (гликозилированной и негликозилированной) белка gpl30 наблюдался в среднем мозге у мышей этих линий.
4. Фрагмент 111.35 - 116.14 Мб хромосомы 13 влияет на чувствительность мышей к липополисахариду (ЛПС) и IL-6.
5. Стимуляция gpl30 экзогенным IL-6 или эндогенным IL-6, секретированным в ответ на введение липополисахарида (ЛПС) вызывает каталептогенное действие у мышей. Апробации результатов. Полученные результаты были представлены и обсуждены на XLVIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2010), 5-ой международной конференции «Биологические основы чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2010), XXI съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010), Первой всероссийской молодежной научной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (Томск, 2010), 13ой ежегодной встрече интернационального общества поведческой и нейрональной генетики Genes, Brain and Behavior 2011 (Рим, 2011), 15ой Международной конференции по нейронаукам и биологической психиатрии «Стресс и поведение» (Санкт-Петербург, 2011) и VII съезде Казахского физиологического общества с международным участием «Современная физиология: от клеточно-молекулярной до интегративной - основа здоровья и долголетия» (Алматы, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них четыре статьи, из списка журналов, рекомендованных ВАК в отечественных (2) и международных (2) журналах, 4 тезисов на всероссийских и 3 на международных конференциях.
Соавторство и благодарности. Автор выражает глубокую признательность к.б.н. П.Д. Лисачеву (лаборатория биомедицинской информатики конструкторско-технологического института вычислительной техники СО РАН) за приготовление и инкубацию срезов гиппокампа, к.б.н. Д.В. Базовкиной (лаборатория нейрогеномики поведения ИЦиГ СО РАН) за помощь в проведении тестов на каталепсию и секвенировании, к.б.н. М.А. Тихоновой (лаборатория нейрогеномики поведения ИЦиГ СО РАН) за помощь в обработке поведенческих тестов и к.б.н. Кондауровой Е.М (лаборатория нейрогеномики поведения ИЦиГ СО РАН) за совместную работу по Вестерн блоттингу.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список цитируемой литературы (301 наименований) и приложение. Работа изложена на 99 страницах, содержит 29 рисунков, из которых 15 оригинальные, и 9 таблиц, из которых 4 оригинальные. В приложениях помещены 10 оригинальных таблиц, которые поясняют рисунки 14-29. Глава 1. Обзор литературы Строение, регуляция н функция белка gpl30 в мозге млекопитающих
Цитокины представляют собой большую группу растворимых плейотропных пептидов, полипептидов и гликопротеинов, молекулярной массой 8-60 кДа, вырабатывающихся клетками иммунной системы, а также другими типами клеток в ответ на повреждения тканей, инфекции или воспаления, действие которых происходит ауто- и паракринно. Отличием цитокинов от гормонов являются неспециализированность клеток, секретирующих цитокины, неконститутивность экспрессии, взаимоперекрываемость их биологических эффектов, а также локальность действия [30]. Характерной чертой цитокинов является то, что они могут вызывать биологические эффекты при крайне низких концентрациях - 10"10-10"13М (1нг/мл - 1пг/мл). Это связано с высоким сродством цитокиновых рецепторов к своим лигандам: 10"9-10"12М [31].
В семейство цитокинов IL-6 входят интерлейкины IL-6, -11, -27, -31, LIF (leukemia inhibitory factor), CNTF(ciliary neurotrophic factor), OSM (oncostatin M), CT-1 (carditrophin-1), и, вероятно, NNT-l/BSF-3(novel neurotrophin/B cell-stimulating factor). Они вовлечены в функцию иммунной, нервной, сердечной, эндокринной систем, систему гемапоэза, а также в процессы воспаления [32]. Общим для всех цитокинов семейства IL-6 является наличие в составе их рецептора гликопротсида gpl30. Поэтому они еще называются родственными gpl30 цитокинами (gpl30-related cytokines). Все белки данного семейства содержат 4 длинные а-спирали (A-D) в ориентации «вверх-вверх-вниз-вниз» [25]. Молекулярная масса белков, входящих в семейство IL-6 составляет около 20 кДа. Цитокины этого семейства, за исключением CNTF и СТ-1, имеют N-терминальный сигнальный пептид, IL-6, LIF и OSM гликозилированы по N концу (Табл.1) [33].
Химические реактивы
Показано, что IL-6 может косвенно стимулировать нейродегенеративные процессы - обнаружено, что оверэкспрессия IL-6 астроцитами вызывает симптомы, характерные для нейродегенеративных болезней - атаксию, тремор и конвульсии [159] и у трансгениых мышей приводит к снижению нейрогенеза в гиппокампе на 63 % [160]. Кроме того, избыточная экспрессия этого цитокина в мозжечке, наблюдающаяся у больных аутизмом, значительно изменяет функионирование синапсов, стимулируют формирования синапсов возбуждения [99].
Существуют противоречивые сведения относительно роли IL-6 в нейропротекторных процессах. В одних исследованиях процессов при цитотоксичности, вызванной хронической активацией 7V-methhyl-D-aspartate (NMDA) рецепторов, наблюдающейся при травмах мозга, ишемии и нейродегенеративных заболеваниях, IL-6 вызывал увеличение гибели нейронов [161], а других наблюдался прямо противоположный эффект [162, 163], связанный с активацией А1 рецепторов аденозина, активация которых ингибирует высвобождение глютамата из пресинаптических нейронов и подавляет передачу сигнала от активированных NMDA рецепторов в постсинаптических нейронах [86].
Исследован эффект пренатального воздействия IL-6 - у потомков самок крыс, подвергнутых действию IL-6, наблюдалось снижение экспрессии минерало- и глюкокортикоидов в гиппокампе, увеличение экспрессии corticotrophin-releasing factor CRF и CRF1R в гипоталамусе, а также увеличение уровня кортизола в плазме [164].
Кроме того, полагают, что IL-6 играет роль в механизме депрессивно-подобных расстройств. Депрессия является широко распространенным тяжелым нарушением, иногда приводящим к летальному исходу: около 10 % людей испытывают симптомы депрессии на протяжении жизни, причем 15% из них заканчивают жизнь самоубийством [165]. Клиническими признаками депрессии являются - депрессивная идея (печаль, страдание, подавленность, отчаяние, опустошенность, горе, пессимизм, идея ненужности, вины), ангедоиия (неспособность получать удовольствие), когнитивные расстройства (трудность концентрации, негативные мысли, низкая самооценка), психомоторные нарушения (гипер- или гипоактивиость), вегетативные нарушения (нарушения режима питания и сна) и тревожность [166].
Молекулярные механизмы возникновения депрессии пока изучены не достаточно. Показано, что в ее возникновение вовлечено сразу несколько систем -глюкокортикоидная, адренергическая, серотонинэргическая, ГАМК (гамма-амино масляная кислота) - эргическая, дофамииэргическая, холинергическая и цитокиновая [167]. В настоящее время появляется все больше свидетельств относительно вовлеченности в этиологию депрессий цитокиновой системы. Сформирована гипотеза о том, что депрессия является результатом нейродегенерации, обусловленной воспалительными процессами в мозге и дисрегуляцией секреции и/или рецепции провоспалительных цитокинов [28, 29, 168]. Большинство авторов отмечают увеличение [167-176], хотя некоторые исследователи отмечают снижение [179-181] уровня IL-6 в крови депрессивных больных.
Существуют свидетельства ассоциации симптомов депрессии с активацией неспецифического иммунного ответа. Введение добровольцам ЛПС вызывало формирование депрессивных симптомов, наряду с достоверным увеличением таких цитокинов, как IL-6, TNF-a [182]. Введение риновируса [183] или вакцины Salmonella typhi [184] вызывало ухудшение настроения и коррелировало с увеличением назального уровня 1L-6, но не 1L-1(3 и TNF-a.
В настоящее время создана гипотетическая модель действия провоспалительных цитокинов в мозге, объясняющая их негативное влияние на нейропластичность, что служит вероятной причиной депрессии. Во время стресса происходит активация секреции периферических цитокинов (в основном - TNFa, IL-1, IL-6), синтезирующихся в моноцитах, макрофагах и клетках печени. Достигая мозга, они стимулируют секрецию цитокинов клетками микроглии; при этом наблюдается изменение синтеза, секреции и обратного захвата моноаминов [185].
Цитокины активируют индоламин 2,3 диоксигеназу (IDO), которая катализирует синтез кинуринина из триптофана-предшественника серотонина, что вызывает снижение уровня серотонина. Кинуришш может превращаться в кинуреновую кислоту в астроцитах и хинолиновую кислоту в микроглие. Кипуреновая кислота ингибирует секрецию глутамата, что в свою очередь, снижает секрецию дофамина. Хинолиновая кислота, наоборот, активирует секрецию глутамата через активацию NMDA рецепторов, а также индуцирует окислительный стресс (Рис.14.) [185, 186].
Кроме того, цитокины уменьшают синтез дофамина за счет активации N0 синтазы, использующей тетрагидробиоптерин - кофактор, необходимый для синтеза медиатора [185].
Также, МАРК, активируемые цитокинами (р38, ERK1/2) могут активировать мембранные транспортеры серотонина, дофамина и норадреналина, увеличивая их обратный захват [185].
Цитокины могут влиять и на функционирование гипоталамо-гипофизарно-надпочечной оси, активируя секрецию CRF, adrenocorticotropic hormone (ACTG) и кортизола [23, ЗО, 187-189]. Цитокины повышают экспрессию [3-изоформы рецепторов глюкокортикоидов (GR), которая не обладает функциональной активностью, но способна связывать лиганд. В итоге чувствительность рецепторов снижается, что вызывает постоянное увеличение уровня глюкокортикоидов [23, 190]. Кроме того, показано, что цитокины могут прерывать сигналы от GR за счет: 1) ингибирующего фософорилирования рецепторов ERK киназами; 2) образования неактивных комплексов GR-NF-KB; 3) разрыва транслокации GR при связывании со STAT5 [179]. Еще одним патофизиологическим действием провоспалительных цитокинов в мозге является их способность нарушать нейрон-глиальное взаимодействие, через действие на трофические факторы, в частности, на brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Фактор BDNF вовлечен в нейрогенез, пластичность и рост нервной ткани [191]. Нарушение экспрессии фактора сопряжено с возникновением нейродегенеративных болезней [192]. Показано, что уровень BDNF снижен в плазме крови больных депрессией, а также в мозге у самоубийц [193]. Действительно, введение ЛПС - индуктора провоспалительных цитокинов ингибирует нейрогенез в гиппокампе, причем главную роль в этот процесс вносит IL-6 [194].
Выделение РНК и ОТ-ПЦР
Таким образом, мы показали, что предполагаемый функциональный полиморфизм не влияет на уровень трансляции мРНК гена Il6st и на важную пострансляционную модификацию - гликозилирование.
Следующим шагом было изучение функциональной активности белка gpl30 в физиологическом эксперименте по изучению различия в поведении мышей при его активации неспецифическим агентом - ЛПС и при непосредственной активации IL-6.
В этом эксперименте для активации gpl 30 использовали неспецифический индуктор секреции IL-6 - липополисахарид (ЛПС) (50 и 200 мкг/кг, в/б).
Каталепсия У 9 из 10 конгенных мышей в контрольной группе была выявлена каталепсия (р 0,001), тогда как для линии AKR/J - только у одного из 10. При введении ЛПС (50 мкг/кг) каталепсия наблюдалась у одной мыши AKR/J в группе из 10, тогда как у мышей линии AKR.CBA-D13Mit76 все 11 мышей проявляли каталепсию. Время замирания у контрольных мышей конгенной линии было значительно выше, чем у таковых мышей линии AKR/J (F:36=135,7, р 0,001), тогда как у контрольных мышей линии AKR/J оно было практически нулевым (4,3 ± 7,6 сек). Был выявлен эффект ЛПС (Fi,36=8,6, р 0,006) и взаимодействия данного фрагмента 13 хромосомы и ЛПС (Fi,36 5,3, р 0,032). ЛПС не влиял на время каталепсии у мышей AKR/J, но значительно увеличивал его у мышей AKR.CBA-D13Mit76 (с 72 ± 7,2 сек для контрольных животных до 110 ± 6,9 сек для опытных животных, р 0,0005) (Рис.23). Таким образом, непрямая активация gpl30 эндогенным IL-6, обладает каталептогенным эффектом.
Тест открытого поля В данном тесте, являющимся стандартным тестом на тревожность и исследовательское поведение, не было выявлено эффекта выявлено эффекта фрагмента 111.35-116.14 Мб 13 хромосомы на двигательную активность (Fi s =2,21, р 0,05), время пребывания в центре (Fi s =2,53, р 0,05), число стоек (Fi;45 1) и продолжительность груминга (Fi s 1). Не обнаружено влияние ЛПС на время пребывания в центре (Fj s =6,10, р 0,05). Однако был выявлен эффект ЛПС на двигательную активность (F2.45 1), число стоек (F2,45 =7Д8, р 0,01) и продолжительность груминга (F2,45 =7,03, р 0,01). Не обнаружено эффекта взаимодействия фрагмента 13 хромосомы и ЛПС на двигательную активность (F2.45 1), время пребывания в центре (F2,45 1, р 0,05) и число вертикальных стоек (F2.45 1). В то же время, обнаружено достоверное влияние взаимодействия на выраженность груминга (F2,45= 8.76, Р 0,001).
При введении ЛПС у мышей линии AKR/J наблюдалось достоверное снижение пройденного пути (р 0,02), числа стоек (р 0,02) и интенсивности груминга (р 0,03) только при введении большой дозы (200 мкг/кг), но не маленькой дозы (50 мкг/кг) ЛПС. В то же время, даже малая доза (50 мкг/мг) ЛПС вызывала снижение пройденного пути (р 0,03), числа стоек (р 0,02) и времени груминга (р 0,001) у конгенных мышей. (Рис. 24, Приложение Табл.ДІ- Д 2).
Очевидно, что большей чувствительностью к ЛПС обладают конгенные мыши, имеющие СВА-аллель гена Il6st, т.к. уже в малых дозах ЛПС (50 против 200 мкг/кг) вызывает возникновение sickness behavior - животного аналога депрессивно-подобного поведения, характеризующимся снижением параметров в тесте открытого поля. О Контроль
Пройденный путь (А), число стоек (В), время пребывания в центре (С) и продолжительность груминга (D) в тесте open field у мышей AK.R/J и AKR.CBA-D13MU76 линий при введении ЛПС (50, 200 мкг/кг). р 0,05, р 0,01, р 0,001 по сравнению с соответствующим контролем, й#р 0,01 по сравнению с контролем AKR/J.
Не было обнаружено эффекта данного фрагмента 13 хромосомы (кора - Fjs20 h гиппокамп - Fi,24 1, средний мозг - F,26 1), эффекта препарата (кора - F,2o 1, гиппокамп - F,24 1, средний мозг - Fi,26 1) и взаимодействия эффектов фрагмента хромосомы и ЛПС (50 мкг/кг) (кора - F,2o=l 52, р 0,05, гиппокамп - Fi,24 1, средний мозг - F,26 1) на экспрессию гена Il6st у животных AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76 (Рис. 25, Приложение Табл. Е).
Установлено влияние данного фрагмента на экспрессию гена глиального белка Gfap, являющимся геном-мишенью, активируемым IL-6, в коре (Fii6=7,79, р 0,05) и среднем мозге (Fi,2i—6,28, р 0,05). Экспрессия гена Gfap в этих структурах у животных AKR была выше, чем у мышей AKR.CBA-D13Mit76. В то же время фрагмент 111.35-116.14 Мб 13 хромосомы не влиял на экспрессию гена Gfap в гиппокампе (Fj,25=l-2, Р 0,05). ЛПС (50 мг/кг) увеличивал экспрессию Gfap в гиппокампе (F, 25=5,32, р 0,05) и среднем мозге (Fi,2i=4.93, р 0,04), но не в коре (Fi,ie l). В среднем мозге ЛПС активировал экспрессию Gfap только у животных AKR AKR.CBA-D13MU76 и .CBA-D13Mit76 (р 0,01), но не AKR/J (Рис. 26, приложение Табл. Ж). Не был установлен эффект взаимодействия линии и ЛПС ни в одной из структур (кора - Fyg 1, гиппокамп - Fi25 1, средний мозг - F) 2i =2,29, р 0,05). А-С - типичные электрофореграммы продуктов ОТ-ПЦР: А - кора, В - гиппокамп, С -средний мозг. D - влияние препарата на уровень мРНК Gfap гена в различных структурах мозга. Условн. обозначен.: D13 - AKR.CBA-D13MU76; К- - отрицательный контроль; 1 -AKR/J, 2 - AKR.CBA-D13Mit76. р 0,05 по сравнению с контролем AKR/J, р 0,01 по сравнению с контролем AKR.CBA-D13MU76. Несмотря на то, что активация gpl30 вызывала поведенческие различия у мышей каталептической некаталептической CBA/LacJ линии, она не приводила к достоверному изменению уровня мРНК гена Il6st, но влияла на уровень мРНК его гена-мишени GFAP в среднем мозге. Следующим этапом работы было выяснение различий на поведенческом, а также на транскрипционном уровне у мышей этих линий при активации gpl 30 экзогенным IL-6.
В тесте на каталепсию среди контрольных мышей AKR/J каталепсию проявляли 2 из 9 мышей, тогда как у AKR.CBA-D13Mit76 - 14 из 20. При введении IL-6 (3 мкг/кг) каталепсия проявлялась у 4 из 9 мышей линии AKR/J, а в группе конгенных мышей - у всех 16 животных.
Был обнаружен эффект фрагмента 13 хромосомы (Fi,52=38,61, р 0,001) на время реакции замирания, однако не было выявлено эффекта IL-6 (Fi,si=3,49, р 0,05) и эффекта взаимодействия фрагмента хромосомы и препарата (Fii5i l). Введение IL-6 не влияло на время замирания у мышей AKR/J (17,39±5,52 сек у контрольных животных против 24,82±7,59 сек у опытных, р 0,05), но увеличивало его у конгенных мышей (с 67,73±9,92 сек до введения препарата до 93,73±6,04 сек после введения, р 0,001) (рис.27). Таким образом, как и в случае с эндогенным, экзогенный IL-6 вызывает каталептогенное действие у мышей, имеющих СВА-аллель гена Il6st.
Изучение соотношения гликозилированной и негликозилированной форм gpl30 у мышей, различающихся по предрасположенности к каталепсии
Ключевой проблемой современной молекулярной генетики является изучение последовательности молекулярных событий, ведущей от гена к сложному физиологическому признаку. Особую важность эта проблема приобретает при изучении молекулярных механизмов нарушения поведения и психики. Наследственная каталепсия у мышей, несомненно, является проявлением патологии функции мозга. Во-первых, это чрезвычайно редкий признак, обнаруженный пока у единственной линии мышей CBA/LacJ [13, 14, 18]. Во-вторых, наследственная каталепсия у мышей CBA/LacJ ассоциирована с депрессивно-подобным поведением [266, 291], со сниженным порогом судорожной активности нейронов гиппокампа [17] и супрессией специфического иммунитета [267]. В-третьих, каталепсия у мышей CBA/LacJ имеет простое наследование и, вероятнее всего, возникла в результате мутации в одном локусе [13].
В результате длительных исследований было установлено, что главный ген, определяющих высокую предрасположенность к каталепсии локализован между 111.35 и 116.14 Мб хромосомы 13 [22]. В этом участке генома обнаружено 6 генов, продукты которых выполняют сигнальные функции в мозге, каждый из которых можно рассматривать как потенциальный ген-кандидат каталепсии. К сожалению, в настоящее время не существует универсального молекулярно-генетического метода для выбора гена каталепсии среди этого множества генов и, следовательно, выяснение участия каждого из этих генов в регуляции наследственной каталепсии у мышей требует собственного исследования.
При планировании исследования было предположено, что наиболее вероятным геном-кандидатом является ген Il6st, кодирующий белок gpl30, так как он экспрессируется в клетках мозга, участвует в сигнальных процессах, выживании нейронов, нейрогенезе и воспалении. Не последнюю роль в выборе гена Il6st в качестве объекта данного исследования сыграла простота фармакологической активации gpl30 с помощью ЛПС или IL-6. До начала этой работы не было никаких данных указывающих на то, что данный ген может контролировать каталепсию, поэтому была сформулирована гипотеза, о том, что высокая предрасположенность к каталепсии может быть связана с мутацией в гене Il6st, изменяющей экспрессию его продукта — gpl30 или его функциональную активность.
Па первом этапе нами были определены нуклеотидные последовательности к ДНК у мышей родительских линий - AKR/J и CBA/LacJ. Не было обнаружено никаких различий в кодирующей области у мышей этих линий, различающихся по проявлению каталепсии. Однако функциональный полиморфизм мог быть вызван мутацией в нитронах или регуляторных областях гена, расположенных в области, предшествующей 5 - концу, изменяя его экспрессию на транскрипционном или трансляционном уровнях.
Для проверки предположения исследовали ассоциацию наследственной каталепсии с экспрессией гена U6st на транскипционном уровне в головном мозге мышей. Для этого определяли уровень мРНК гена Il6st в коре, гиппокампе, гипоталамусе, стриатуме и среднем мозге мышей каталептических линий с СВА-аллелем гена CBA/LacJ, ASC и AKR.CBA-D13Mit76 и мышей некаталептичской линии AKR/J. Было обнаружено увеличение уровня мРНК этого гена у мышей конгенной линии AKR.CBA-D13Mit76 по сравнению с другими линиями, что свидетельствует об отсутвии ассоциации между предрасположенностью к каталепсии и уровнем транскрипции гена Il6st. Полученные негативные результаты делают маловероятным предположение о том, что мыши каталептических линий отличаются от AKR/J наличием функциональной мутации в промоторном районе гена U6st, способной регулировать экспрессию данного гена [292].
Тогда мы предположили возможное наличие мутации в некодирующей части гена (в интронах или 3 -фланкирующей области), изменяющей функциональную активность белка gpl30. Однако у мышей AKR/J, CBA/LacJ, ASC и AKR.CBA-D13MU76 не было обнаружено различий по концентрации белка gpl30 и по процентному соотношению его гликозилированной формы в коре, гиппокампе, гипоталамусе, стриатуме и среднем мозге, что опровергало эту гипотезу.
Следующей гипотезой была гипотеза о том, что мыши с различной предрасположенностью к каталепсии различаются фунциональной активностью белка gpl30.
Прежде всего, нами было установлено, что слабые дозы ЛПС [293] и IL-6 увеличивают время каталептического замирания у мышей линии AKR.CBA-D13MU76. Этот каталептогенный эффект ЛПС и IL-6 был подтвержден нашими коллегами на мышах устойчивой к каталепсии линии C57BL/6 [294]. Следовательно, наши исследования и исследования наших коллег доказывают потенциальное участие белка gpl30 в механизме каталепсии мышей.
В ходе исследования было установлено, что СВА-фрагмент 111.35 - 116.14 Мб хромосомы 13, перенесенный в геном AKR/J, увеличивал чувствительность мышей конгенной линии AKR.CBA-D13Mit76 к ЛПС, по сравнению с AKR/J. Действительно, 50 мкг/кг ЛПС достоверно увеличивало время каталепсии, и уменьшало двигательную активность (пройденный путь) и исследовательское поведение (вертикальные стойки) у мышей AKR.CBA-D13Mit76, но не влияло на выраженность этих форм поведения у мышей AKR/J [293, 295].
Повышенная чувствительность к ЛПС у мышей AKR.CBA-D13Mit76 проявляется и на уровне мозга. ЛПС в дозе 50 мкг/кг вызывал увеличение экспрессии регулируемого gpl30 гена Gfap в среднем мозге у мышей AKR.CBA-D13MH76, но не у животных AKR/J [293, 295]. Более того, нами было установлено, что 50 мкг/кг ЛПС повышал экспрессию гена, кодирующего 5-НТ2А рецептор, в среднем мозге мышей AKR.CBA-D13MH76, но не AKR/J [296].
Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют об участии gpl30 и IL-6 в механизме наследственной каталепсии и ассоциации фрагмента 111.35 - 116.14 Мб хромосомы 13, содержащего ген каталепсии, с чувствительностью к ЛПС. Эти результаты подтверждают нашу рабочую гипотезу о связи гена Il6st с наследственной предрасположенностью к каталепсии мышей CBA/LacJ.
В свете полученных негативных результатов необходимо было пересмотреть роль gpl30 в механизме чувствительности к ЛПС у мышей AKR.CBA-D13MU76. Известно, что введения ЛПС повышает концентрацию трех провоспалительных цитокинов, IL-1[3, IL-6 и TNF-a [196]. Поэтому наблюдаемый эффект ЛПС может быть обусловлен влиянием IL-l(i и/или TNF-a, а не только IL-6. Поэтому важным этапом в логической цепи доказательств является исследование непосредственного эффекта экзогенного IL-6 на поведение и экспрессию нейрогенов в мозге мышей AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76.
Введение экзогенного IL-6 (3 мкг/кг) вызывало снижение двигательной активности у мышей конгенной линии, но не у AKR/J, что согласуется с результатами эксперимента по введению ЛПС.
Инкубация срезов гиппокампа мышей AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76 с IL-6 не выявила каких либо эффектов данного цитокина на нейрональном уровне (экспрессия гена-мишени Gfap). Следовательно, IL-6 не принимает участия в механизме увеличения экспрессии гена Gfap в гиппокампе мышей после введения ЛПС.
Таким образом, результаты работы свидетельствуют об участии ЛПС и IL-6 в механизме каталепсии и о важной роли фрагмента 111.35 - 116.14 Мб хромосомы 13 в регуляции чувствительности к ЛПС и IL-6. Однако мы не подтвердили гипотезу о том, что причиной каталепсии является мутация, изменяющая экспрессию гена Il6sl или активность белка gpl30 и, следовательно, имеются все основания для исключения гена Il6st из списка генов-кандидатов, определяющих высокую предрасположенность к каталепсии у мышей CBA/LacJ. Более того, из исходного списка генов-кандидатов, составленного перед началом исследования, следует исключить гены, для которых не показано участие в механизме действия ЛПС. В результате проделанной работы исходный список из шести генов-кандидатов можно сократить до трех - МарЗкІ, ИЗ Ira и Fst.
