Введение к работе
Актуальность проблемы
Исследование транскриптома – одна из актуальных проблем современной молекулярной биологии. Основными задачами транскриптомики, изучающей совокупность транскриптов всех генов, экспрессирующихся в какой-либо клетке или ткани в определенные моменты функционирования, – являются изучение их структуры, пространственного и временного распределения. Анализ содержания транскриптов позволяет исследовать особенности функционирования отдельных генов, оценить их степень участия в том или ином физиологическом процессе, их вовлеченность в развитие заболеваний. Особенно важен анализ транскриптома при патологических процессах, так как он не только позволяет оценить роль отдельных генов в патогенезе болезни, но и дает возможность разработки новых терапевтических подходов для ее лечения.
Одним из состояний, для которых исследование транскриптома представляет особую важность, является ишемия головного мозга, возникающая вследствие снижения мозгового кровотока и последующего дефицита кислорода и глюкозы. Церебральная ишемия вызывает драматические изменения в экспрессии генома и запускает разветвлённую систему генетических программ, от исхода которых зависит судьба нервных клеток в пораженной области. Для исследований транскриптома при ишемических процессах широко используются экспериментальные модели ишемии. С их помощью стало возможным проводить анализ изменений, происходящих в экспрессии генов – мишеней на уровне мРНК в ответ на ишемию или терапевтическое воздействие. Изменение экспрессии генов при лекарственном воздействии указывает на возможные механизмы терапевтического действия и может быть полезно для создания новых лекарств и совершенствования существующей стратегии лечения заболеваний.
В настоящее время активно исследуется возможность использования синтетических пептидов – аналогов природных регуляторных молекул для лечения многих заболеваний. Лекарственные препараты, изготовленные на их основе, обладают такими свойствами как высокая эффективность, быстрота наступления эффекта и длительность воздействия, а также отсутствие побочных явлений. К числу препаратов, используемых для лечения заболеваний, в основе которых лежат нарушения мозгового кровообращения, относится семакс – синтетический гептапептид Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro, N-конец которого содержит фрагмент АКТГ(4-7), а С-конец – пептид Pro-Gly-Pro (PGP). Семакс обладает широким спектром терапевтических свойств, важнейшим из которых является нейропротекция. Пептид PGP, изначально использовавшийся для пролонгирования действия семакса путем препятствия его преждевременного взаимодействия с эндогенными эндопептидазами, обнаруживает и самостоятельные регуляторные свойства. Однако, несмотря на многочисленные исследования, механизм действия семакса до конца не ясен. Ранее, в целом ряде работ было показано влияние семакса на функционирование системы нейротрофинов и их рецепторов. Нейротрофинами называют группу близких по происхождению секреторных белков – факторов роста, обеспечивающих выживание, рост и дифференцировку нейронов. Эти протеины ответственны за выбор нервными клетками генетических программ выживания/апоптоза в критических патологических условиях. Также было показано, что эти факторы, прежде всего BDNF, являются мощными природными нейропротекторами, защищающими нервные клетки от повреждающего воздействия ишемии. Анализ экспрессии нейротрофинов и их рецепторов может не только помочь в уточнении деталей патологических процессов, происходящих в ишемизированном мозге, но и оценить эффективность терапевтических процедур. На данный момент точно не известно, как в условиях глобального дефицита глюкозы и кислорода применение семакса действует на экспрессию нейротрофинов и их рецепторов в различных участках мозга. Особенно важно знать характер таких изменений во времени, прежде всего в первые часы после начала ишемии.
Принимая во внимание выраженные ноотропные свойства семакса, а также его участие в нейропротекции при ишемии, необходимо исследовать его влияние на экспрессию мРНК не только генов системы нейротрофинов, но и других генов, активно участвующих в реакции генома на ишемию. Среди них могут быть гены, белковые продукты которых участвуют в процессах воспаления, глутаматной эксайтотоксичности, пролиферации глии, программируемой смерти клеток и т.д.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось изучение влияния препарата семакс и его С-концевого фрагмента PGP на морфологию нервной ткани и экспрессию мРНК генов нейротрофинов Ngf, Bdnf, Nt-3, рецепторов нейротрофинов TrkA, TrkB, TrkC, р75, а также генов Egr1, Cplx2, VegfA и Npy1r в условиях неполной глобальной ишемии головного мозга крыс. Для этого были поставлены следующие задачи:
-
Провести гистологическое и иммуногистохимическое исследование головного мозга крыс в норме и в условиях выбранной модели ишемии.
-
Изучить влияние семакса и PGP на морфологию нервной ткани и пролиферативную активность клеток головного мозга крыс в норме и при ишемии.
-
Определить изменения относительного содержания мРНК генов Ngf, Bdnf, Nt-3, TrkA, TrkB, TrkC, р75, Egr1, Cplx2, VegfA и Npy1r в различных структурах мозга крыс, подвергнутых неполной глобальной ишемии, спустя 30 мин, 1, 2, 4, 8, 12 и 24 ч после операции.
-
Определить изменения относительного содержания мРНК исследуемых генов под действием семакса или PGP у животных, подвергнутых ишемии.
-
Провести сравнительный анализ эффектов семакса и PGP в условиях эксперимента.
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые была подробно изучена временная динамика изменений относительного содержания мРНК генов нейротрофинов и их рецепторов в лобной коре, гиппокампе и мозжечке крыс, подвергнутых неполной глобальной ишемии в течение 30 мин, 1, 2, 4, 8, 12 и 24ч и в присутствии пептидов семакс или PGP. В работе было показано, что действие семакса на транскрипцию генов нейротрофинов и их рецепторов при ишемии наиболее выражено в гиппокампе – участке мозга, наиболее страдающем от недостатка кислорода и глюкозы. В гиппокампе крыс семакс способствовал активации синтеза мРНК подавляющего большинства анализируемых генов нейротрофинов и их рецепторов. Эффект препарата на экспрессию генов нейротрофинов и их рецепторов проявлялся уже через 15 мин после введения и был наиболее выражен спустя 12 ч после окклюзии общих сонных артерий. В рамках работы было исследовано воздействие семакса и PGP на экспрессию других генов, ответственных за важнейшие процессы жизнедеятельности клеток и являющихся возможными мишенями терапевтического действия семакса. Впервые было показано разнонаправленное влияние семакса и ишемии на содержание мРНК гена VegfA в лобных долях коры и гиппокампе крыс. Установлено, что эффекты семакса и PGP на экспрессию мРНК большинства генов в экспериментальных условиях различаются. Отличается не только набор генов, изменяющих свою экспрессию, но и временные интервалы, в которые эти изменения обнаружены, а также их продолжительность и глубина.
Впервые изучено воздействие семакса и PGP на морфологию нейронов и нейропиля в норме и в условиях неполной глобальной ишемии, а также проведена оценка пролиферативного статуса стволовых клеток мозга в этих условиях. Сравнительное морфофункциональное исследование действия семакса и PGP на головной мозг животных контрольных групп свидетельствует, что оба пептида активируют капиллярную сеть и однотипно влияют на морфологию нейронов. Показано, что из двух препаратов только семакс оказывает нейропротекторное действие, снижая выраженность ишемического повреждения нейронов и предупреждая развитие локальных очагов деструкции нервной ткани. Впервые обнаружена стимуляция семаксом пролиферативной активности клеток герминативных зон, что создает предпосылки для усиления репаративной регенерации поврежденных клеточных и тканевых структур головного мозга в условиях ишемии.
Результаты проведенного исследования эффектов семакса и PGP в условиях неполной глобальной ишемии представляют научно-практический интерес. Результаты гистологического и иммуногистохимического исследования вместе с данными о динамике изменений содержания мРНК генов нейротрофинов и их рецепторов имеют существенное значение для выяснения механизма нейропротекторного действия семакса. Полученные результаты могут оказаться важными не только для терапевтического применения семакса, но и для анализа новых препаратов пептидной природы, обладающих ноотропными и нейропротекторными свойствами.
Кроме того, в результате работы были получены важные данные о состоянии тканей головного мозга и экспрессии целого ряда генов в условиях неполной глобальной ишемии мозга крыс. Эта модель ишемии вызывает глубокие изменения в метаболизме клеток мозга, затрагивая в той или иной степени все его участки. Полученные результаты расширяют наши представления о данной модели, что дает возможность для её использования при оценке нейропротекторных свойств новых препаратов.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 3 статьи и 10 материалов симпозиумов и конференций.
Апробация диссертации
Результаты, полученные в данной работе, были представлены на конференциях Американского Общества Генетики Человека (ASHG) в 2004 и 2007 гг., Европейского Общества Генетики человека (ESHG) 2005, 2007, 2008 и 2009 гг., на Российском симпозиуме «Белки и пептиды» в 2007 г., съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов в 2008 г., VI Съезде Российского общества медицинских генетиков, изложены на конкурсе работ на стипендию фонда «Будущее молекулярной генетики» (Москва, ИМГ РАН, 2007 г). Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании Ученого совета ИМГ РАН 23 января 2012 г. и на заседании секции «Молекулярная биология» Ученого совета ФГУП «ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов» 25 января 2012 г.
Структура и объем диссертации
Диссертация включает введение; обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение; выводы; библиографический указатель. Список литературы состоит из 249 источников, среди которых 26 источников отечественной и 223 источника зарубежной литературы. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста и содержат 16 таблиц и 16 рисунков.
