Введение к работе
Актуальность проблемы. Оптимизация и дальнейшее совершенствование различных используемых, а также разработка новых систем доставки и экспрессии рекомбинантных генов, в зависимости от типа клеток-мишеней и спектра задач, представляет собой важную функциональную научную задачу и имеет практическое значение в области медицины. Конструирование векторных ДНК для введения целевых последовательностей в геномы микроорганизмов, дрожжей, растений, насекомых, млекопитающих находит практическое применение для решении широкого спектра задач. На сегодняшний день используются различные методы для введения чужеродных генов в клетки про- и эукариот при помощи физико-химических способов доставки (электропорации, бомбардировки микрочастицами золота или вольфрама и т.д.) и при помощи различных вариантов биологической доставки (липидных коньюгатов – липосом, рекомбинантных вирусов и т.д). Введение рекомбинантных гибридных молекул ДНК в прокариотические и эукариотические клетки с помощью векторов имеет массу преимуществ и вышло на первый план при решении этой задачи и разработка на их основе различных систем экспрессии, обеспечивающих эффективную продукцию белков in vitro и in vivo, постоянно совершенствуется, расширяется круг задач, при решении которых они применяются.
Кишечная палочка E. coli - наиболее генетически, биохимически и физиологически изученный микроорганизм, поэтому основные работы по гетерологичной экспрессии выполняются на этих клетках. Однако E. coli относится к условно-патогенным для человека микроорганизмом, что может создавать определенные трудности при получении на ее основе, например, фармацевтических препаратов. Сегодня E. coli часто используют в качестве «промежуточной» системы клонирования при конструировании гибридных молекул ДНК для других типов клеток. Так, в новых бакуловирусных системах для получения рекомбинантного вируса используются клетки E. coli на промежуточной стадии для поддержания и размножения вирусной ДНК в виде кольцевой формы, с последующей репликацией бакуловируса в клетках насекомых.
Бактерия Bacillus subtilis по степени популярности и изученности следует за E .coli: на ее основе также конструируют штаммы-продуценты, секретирующие чужеродные белки из клеток. B. subtilis безопасна для человека и животных и успешно освоена микробиологической промышленностью.
Из низших эукариот хорошо изучены дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Первый штамм–продуцент поверхностного антигена вируса гепатита В был создан именно на S. cerevisiae. Дрожжи представляют собой один из важнейших промышленных микроорганизмов, поэтому интенсивная разработка исследований по созданию векторной дрожжевой системы продолжает быть актуальной и в настоящее время.
Системы клеток бактерий и дрожжей имеют свои особенности при использовании в генетической инженерии и при создании векторов для клонирования и экспрессии генов, для секвенирования ДНК и в качестве модельных систем для изучения генетических процессов, которые применяются в фундаментальной и прикладной биомедицине. Получены штаммы бактерий и дрожжей, для клонирования и экспрессии генов с высокой эффективностью синтезирующие гетерологичные белки человека и животных. Каждая из систем клонирования и экспрессии имеет свои недостатки и преимущества. Системы клонирования и экспрессии генов в клетках бактерий и дрожжей не позволяют экспрессировать несплайсированные гены. Кроме того, в них невозможен сложный посттрансляционный процессинг полипептидов, происходящий в клетках млекопитающих. Поэтому все большую актуальность приобретает проблема экспрессии мультимерных белков эукариот, которые требуют для проявления своей биологической активности специфических посттрансляционных модификаций и сборки из различных субъединиц. В этих случаях используют экспрессирующие системы на основе клеток высших эукариот, которые обеспечивают синтез белков, структурно и функционально близких к своим природным аналогам. В последние два десятилетия предложено большое число векторов, в качестве которых выступают различные вирусы для введения чужеродных генов в клетки-мишени. С помощью вирусов - естественных переносчиков чужеродной ДНК в клетки млекопитающих - удается обеспечить эффективное проникновение генетического материала в клетки-мишени, достичь высокого уровня трансфекции клеток in vitro и in vivo и высокого уровня экспрессии внесеннных генов. Однако существование врожденного иммунитета у человека к большинству таких векторов может ограничить их применение.
Одним из подходов к преодолению этой проблемы является создание рекомбинантных вирусов, не патогенных для человека, в качестве векторов для переноса генов. Например, у человека отсутствует врожденная гуморальная и клеточная иммунная память по отношению к бакуловирусам. Поэтому бакуловирусная система экспрессии на основе клеток насекомых отряда Spodoptera, которая обеспечивает сверхпродукцию рекомбинантных белков в эукариотических клетках, популярна в настоящее время. Бакуловирусная система (БЭС) позволяет экспрессировать несплайсированные гены, а особенности структуры капсидной оболочки бакуловирусов позволяют упаковывать в нее очень большие гены. Рост интереса к этим системам экспрессии связан также с возможностью использования бакуловирусных векторов для доставки и экспрессии гетерологичных генов в клетках млекопитающих. Экспрессионная система на основе бкуловирусов, позволяющая синтезировать полноценные эукариотические белки в различных клетках млекопитающих in vitro, ex vivo и in vivo, рассматривается в качестве перспективной альтернативы векторам на основе вирусов человека. Оптимизация такой системы, в зависимости от типа клеток-мишеней, является актуальной задачей современных исследований в области биомедицины.
Цель работы: Сравнительный анализ различных векторных систем, клонирование и экспрессия целевых рекомбинантных генов в клетках про- и эукариот и их применение для решения научных и прикладных задач. Оптимизация системы доставки и экспрессии генов в клетках насекомых и млекопитающих на основе бакуловирусных векторов.
Основные задачи исследования: Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. С использованием бактериальных систем клонирования и экспрессии:
Получить библиотеки бактериальных клонов, содержащих ДНК-копии геномных РНК вируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) и вируса картофеля (ХВК), для изучения структуры вирусных геномов.
Разработать тест-систему для функциональной селекции библиотек мутантных рибозимов в клетках Bacillus subtilis с целью изучения механизмов функционирования синтезированных рибозимов in vivo.
2. С использованием систем экспрессии в клетках листьев табака, ооцитов:
Создать генетические конструкции для доставки и экспрессии гена серотонинового рецептора мозга мыши 5HT1c в клетках листьев табака, ооцитах ксенопуса и клетках насекомых для изучения роли серотониновой системы в реакции различных типов клеток на стрессорные сигналы.
3. С использованием дрожжевой системы экспрессии:
Создать набор векторных конструкций, содержащих делеционные варианты промотора
кислой фосфатазы PHO5, для экспрессии и секреции генов в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
4. С использованием бакуловирусной системы экспрессии на основе клеток насекомых и
млекопитающих:
Создать набор мультипромоторных векторов экспрессии для клеток насекомых, содержащих промоторы поздних генов вируса ядерного полиэдроза (ВЯП), которые обеспечивают одновременную экспрессию нескольких генов в одной инфицированной клетке насекомого.
Сконструировать трансфер-векторы на основе бакуловирусов, содержащие регуляторные элементы, используемые ферментативными системами клеток млекопитающих, для экспрессии клонированных целевых генов в культуре клеток млекопитающих.
Получить рекомбинантные вирусы и линии клеток насекомых, синтезирующие иммунологически активные - и -субъединицы хорионгонадотропина (ХГ) и CD4 рецептора.
Получить рекомбинантную функционально-активную стероид-21-гидроксилазу человека и мутантный вариант этого фермента с высоким уровнем экспрессии в клетках насекомых Sf9 и Hi5 с использованием бакуловирусов и провести функциональный анализ мутантного фермента in vitro.
Получить структурные белки и вирусоподобные частицы вируса гепатита С (ВГС ) в клетках насекомых и клетках млекопитающих с помощью бакуловирусной системы экспрессии и исследовать их функциональные характеристики.
Исследовать морфогенез вируса гепатита C: изучить влияние гликозилирования оболочечных белков ВГС на их экспрессию и процессинг и формирование вирусоподобных частиц ВГС в клетках насекомых.
Исследовать влияние новых синтетических ингибиторов гликозилирования белков на процессинг структурных белков и формирование вирусоподобных частиц ВГС в клетках насекомых и млекопитающих.
Научная новизна и практическая ценность работы заключается в разработке и совершенствовании систем экспрессии, с помощью которых можно эффективно получать in vitro и in vivo гетерологичные белки, имеющие практическое значение.
Предложена схема организации фрагментированного генома вируса штриховатой мозаики ячменя, показано, что исследуемые штаммы ВШМЯ являются близкородственными. Впервые получена библиотека бактериальных клонов, содержащих ДНК-копии геномной РНК ВШМЯ.
Предложена бактериальная система селекции рибозимов на основе B. subtilis, которая может быть применена для функционального скрининга библиотек мутантных рибозимов.
Предложенная векторная система дрожжей с использованием промотора гена PHO5 может быть использована для секреции гетерологичных белков в клетках S. cerevisiae.
Разработанные условия синтеза серотонинового рецептора 5HT1c мозга мыши в клетках растений и его функциональной активности в клетках растений и в ооцитах Xenopus laevis могут быть использованы для анализа клеточной системы преобразования внешнего стимулирования во внутриклеточные сигналы в клетках растений.
Новые дву- и трех-промоторные векторы экспрессии на основе бакуловирусов позволят в одной инфицированной клетке насекомого экспрессировать одновременно несколько генов и получать мультимерные белки, функционально близкие природным аналогам.
Предложенный роллерный метод препаративного выращивания рекомбинантных бакуловирусов может использоваться для получения штаммов-продуцентов белков, имеющих практическое значение.
Новые бакуловирусные векторы с экспрессирующими кассетами под контролем промотора, функционирующего в клетках млекопитающих, и разработанные условия доставки модифицированных векторов в клетки млекопитающих могут быть успешно использованы для эффективнго переноса и экспрессии целевых генов как in vitro, так и in vivo.
Разработанные условия синтеза CYP21A2 с большим выходом в бакуловирусной системе, могут быть использованы для функционального анализа мутаций стероид-21-гидроксилазы. Данные о влиянии мутаций на свойства стероид-21 - гидроксилазы, полученные in vitro, могут иметь важное значение для прогнозирования тяжести течения классической формы адреногенитального синдрома.
Мультисубъединичные вирусоподобные частицы вируса гепатита С (ВГС), полученные в клетках насекомых с помощью бакуловирусной системы могут использоваться для иммунологических и терапевтических исследований, для получения вакцин, для поиска новых соединений с антивирусной активностью, а также в качестве модельной системы для изучения взаимодействия ВГС с клетками, механизмов размножения вируса.
Исследование N-гликозилирования оболочечных белков Е1 и Е2 ВГС в клетках насекомых позволит уточнить роль углеводных цепей в образовании комплекса Е1Е2 и его функционировании в инфекционном цикле вируса.
Воздействие новых синтетических N-алкилированных DNJ на вирусный морфогенез ВГС может быть использовано в качестве альтернативного подхода к существующим стратегиям блокирования вируса гепатита С.
Личный вклад автора. Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Апробация работы. Результаты исследований представлены на IV Международном симпозиуме СССР-ФРГ (Ереван, 1981), VI Международном симпозиуме СССР-Франция (Цхалтубо, 1982), Всесоюзном совещании «Геном вирусов растений» (Владивосток, 1982), Международной конференции (Jena, GDR, 1983), 16 конференции FEBS ( Москва, 1984), конференции “ Генная и клеточная инженерия” (Москва, 1993), Международной конференции, посвященной памяти акад. А.А.Баева (Москва, 1996), V Международной Энгельгардтовской конференции по молекулярной биологии (Москва, 2001), VII Международной Энгельгардтовской конференции по молекулярной биологии (Суздаль, 2004), 30-том Конгрессе FEBS (Будапешт, 2005). XVII Зимней школе для молодых ученых (Москва, 2005), XI Международной конференции для молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2005), на XХII Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2010). Отдельные материалы диссертационной работы докладывались на научных семинарах Лаборатории молекулярной эндокринологии, Лаборатории популярных основ действия физиологически активных соединений и обьединенном семинаре нескольких научных подразделений биологической направленности Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта.
Публикации. По теме диссертации, помимо тезисов конференций (20), опубликовано 20 статей в рецензируемых научных журналах и 1 статья принята к печати.
Структура и обьем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения и выводов, списка литературы по теме диссертации. Диссертация изложена на 167 страницах, содержит 46 рисунков и 8 таблиц.
