Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
Взаимодействия растений с патогенами 8
Умолкание генов 9
Умолкание генов - механизм регуляции, характерный для эукариот 9
Инициация RS, функции днРНК 10
Системное распространение RS 12
Стадии ПТУГ 13
Общая схема деградации РНК в xoneRS 13
Клеточные белки, принимающие участие в RS 15
Роль RS у различных организмов 20
Супрессия умолкания генов вирус-специфическими белками 21
Супрессия RS - свойство вирусов, инфицирующих различные организмы
Вирусы растений, способные подавлять ПТУГ 23
Обнаружение вирусных супрессоров ПТУГ 25
Супрессор ПТУГ потивирусов 26
Супрессоры ПТУГ кукумовирусов 34
Супрессоры ПТУГ полеровирусов 37
Супрессоры ПТУГ клостеровирусов 39
Супрессор ПТУГ пеклувирусов 41
Супрессор ПТУГ Х-вируса картофеля 43
Супрессоры ПТУГ томбусвирусов 45
Белок оболочки - супрессор ПТУГ кармовирусов 50
Супрессоры ПТУГ геминивирусов 52
Супрессоры ПТУГ тоспо- и тенуивирусов 53
Разнообразие супрессоров ПТУГ вирусов растений 55
Супрессия ПТУГ и дальний транспорт вирусов 56
Гордеивирусы 57
Организация генома представителей рода Hordeivirus 57
Цистеин-богатые белки yb гордеивирусов 59
Материалы и методы 63
Реактивы 63
Ферменты и наборы 63
Векторы для клонирования и бактериальные штаммы 64
Трансформация бактериальных клеток Е. coli плазмидной ДНК 64
Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli 65
Экспрессия рекомбинантных белков в клетках Е. coli 66
Трансформация бактериальных клеток A. tumefaciens плазмидной ДНК... 66
Выделение плазмидной ДНК из клеток A. tumefaciens 67
Электрофорез в агарозном геле 68
Извлечение фрагментов ДНК из агарозы 68
Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами 68
Дефосфорилирование плазмидной ДНК 69
Затупление концов фрагментов ДНК 69
Лигирование фрагментов 69
Секвенирование ДНК 69
Амплификация фрагментов ДНК с помощью
полимеразной цепной реакции (ПНР) 7»
Транскрипция in vitro 70
Иммунодетекция белков 71
Приготовление тотальных препаратов РНК 72
Блот-гибридизация РНК 72
Растительный материал 76
Инокуляция растений 76
Агроинфильтрация 76
Детекция GFP в растениях N. benthamiana 77
Иммуно-ферментный анализ 77
Получение рекомбинантных плазмид 77
Результаты 83
Изучение влияния экспрессии белка yb ПЛВМ на развитие инфекции ВШМЯ 83
Замена белка yb ВШМЯ на соответствующий белок ПЛВМ приводит к фенотипу "recovery" 85
Изучение влияния экспрессии гена yb ПЛВМ на накопление вирусных белков и РНК ВШМЯ 89
Развитие вирусной инфекции ВШМЯ, несущего делецию генауЬ 91
Белок Нс-Рго А-вируса картофеля комплементирует функцию дальнего транспорта белка yb ВШМЯ 94
Белок Нс-Рго усиливает симптомы инфекции ВШМЯ 95
Белок Нс-Рго подавляет развитие фенотипа "recovery" 96
Экспрессия белков yb ВШМЯ и ПЛВМ в геноме Х-вируса картофеля 97
Способность белков yb ВШМЯ и ПЛВМ подавлять ПТУГ при «перекрестной защите» 99
Способность белков yb ВШМЯ и ПЛВМ подавлять ПТУГ при временной экспрессии генов в клетках N. benthamiana 103
Мутагенез белка yb ПЛВМ 108
Экспрессия мутантных белков yb ПЛВМ в геноме Х-вируса картофеля... 110
Изучение влияния мутаций в белке yb ПЛВМ на его способность подавлять ПТУГ 111
Обсуждение 114
Выводы 122
Список литературы
- Умолкание генов - механизм регуляции, характерный для эукариот
- Супрессия умолкания генов вирус-специфическими белками
- Трансформация бактериальных клеток Е. coli плазмидной ДНК
- Изучение влияния экспрессии гена yb ПЛВМ на накопление вирусных белков и РНК ВШМЯ
Введение к работе
Изучение молекулярных механизмов распознавания и специфической деградации чужеродных РНК, получивших название умолчание генов, у эукариотических организмов и, в частности, у растений представляет собой одно из быстро развивающихся направлений современной молекулярной биологии. Умолкание генов является механизмом регуляции экспрессии генов и развития организма, а также одним из защитных механизмов растений против вирусных патогенов. Изучение умолчания генов имеет важное теоретическое и прикладное значение для современной фитовирусологии, поскольку позволяет не только понять молекулярные основы взаимодействия растение-патоген, но и разработать подходы для борьбы с вирусными заболеваниями важных сельскохозяйственных культур. В связи с этим, особый интерес представляет изучение реакций вирусов растений, которые способны преодолевать защитные механизмы, основанные на умолкании генов. Простота организации геномов фитовирусов позволила выявить вирус специфические белки, подавляющие умолкание генов, что открыло перспективы для подробного изучения не только молекулярных аспектов умолкания генов у растений, но и вирусного патогенеза в целом.
Объектами настоящей работы являлись цистеин-богатые белки yb вируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) и полулатентного вируса мятлика (ПЛВМ), принадлежащих к роду Hordeivirus. Белок yb ВШМЯ осуществляет ряд регуляторних функций, а также определяет характер развития вирусной инфекции. Однако функции белка yb ПЛВМ, а также способность белков yb ВШМЯ и ПЛВМ подавлять защитный механизм растений, основанный на умолкании генов, не были до сих пор изучены.
Целью настоящей работы было изучение функций белка yb ПЛВМ, а также дальнейшее изучение функций белка yb ВШМЯ. В ходе работы решались следующие основные задачи: изучение влияния удаления цистеин-богатого белка ВШМЯ на развитие вирусной инфекции и накопление вирус-специфических белков и РНК в различных хозяевах, изучение влияния экспрессии цистеин-богатых белков ПЛВМ и ВШМЯ в контексте геномов различных вирусов, комплементационный анализ функций цистеин-богатых белков ВШМЯ и ПЛВМ белками неродственных вирусов, изучение способности цистеин-богатых белков ВШМЯ и ПЛВМ подавлять умолкание генов и определение аминокислотных последовательностей цистеин-богатого белка ПЛВМ, ответственных за супрессию умолкания генов.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Взаимодействия растений с патогенами
Высшие растения могут подвергаться воздействию широкого круга патогенов, таких как бактерии, грибы, вирусы и нематоды. В большинстве случаев растения невосприимчивы к патогенам, поэтому болезнь является скорее исключением, чем правилом. В других случаях растения или не способны противостоять патогену, что приводит к развитию инфекции, или обладают устойчивостью к патогену, и способны остановить развитие его инфекции на определенном этапе.
Растения обладают целым рядом механизмов, которые обеспечивают их устойчивость к вирусным патогенам и препятствуют развитию вирусной инфекции. Один из них основан на том, что растения несут ген устойчивости, продукт которого распознает определенный вирусный белок, т.н. фактор авирулентности. Это взаимодействие приводит к активации защитных механизмов в месте проникновения патогена. В результате происходит его локализация в первично инфицированных и прилегающих к ним клетках. Благодаря этому, с одной стороны, происходит ограничение распространения патогена по инфицированному растению, а, с другой стороны, активируются дополнительные защитные механизмы растения, например, развивается системная устойчивость, и растение не подвергается повторному заражению данным, а также неродственными вирусами. Другой механизм основан на том, что растение напрямую подавляет одну из важных функций вируса, например, проникновение вируса в клетку, разборку вириона, трансляцию вирусных белков, репликацию вирусной нуклеиновой кислоты, сборку вирионов или транспорт вирусов как в другие клетки зараженного растения, так и от зараженных к здоровым растениям, что препятствует распространению вирусной инфекции.
Кроме того, существует механизм устойчивости растений к вирусным патогенам, основанный на умолкании генов, в ходе которого происходит распознавание и специфическая деградация вирусных РНК. Этот механизм действует как на уровне одной клетки, так и на уровне всего растения, т.е. системно, и приводит к ограничению развития вирусной инфекции, а также к приобретению растениями устойчивости к повторному заражению данным, а также близкородственными вирусами.
Умолкание генов - механизм регуляции, характерный для эукариот
Эукариотические организмы обладают способностью подавлять экспрессию чужеродных генов с помощью специфического узнавания и деградации соответствующих мРНК в цитоплазме. Это явление было впервые обнаружено более десяти лет назад в трансгенных растениях. В 1990 году было показано, что введение в геном петунии трансгена халконсинтазы, гомологичного уже имеющемуся у этого растения гену, приводит к подавлению экспрессии как трансгена, так и эндогенного гена. Это явление было названо «ко-супрессия», или посттранскрипционое умолкание генов (ПТУГ) (postranscriptional gene silencing, PTGS) (van der Krol et al., 1990; Napoli et al., 1990). Дальнейшие исследования показали, что вызывать, а также подвергаться ПТУГ могут последовательности, не имеющие гомологии с генами растений (Elmayan and Vaucheret, 1996). Специфическая деградация РНК (RNA silencing, RS), характерная для ПТУГ, была позднее обнаружена у грибов, где этот процесс называется подавлением (quelling), и животных, где этот процесс называется интерференция (RNA interference, RNAi) (Boscher and Labouesse, 2000; Cogoni and Macino, 2000; Ding, 2000).
Деградация РНК в ходе RS носит высоко специфичный характер и основана на гомологии последовательности, которая подвергается разрушению, с последовательностью, которая вызывает эту деградацию. В целом, специфическая деградация РНК у эукариотических организмов направлена на устранение чужеродных последовательностей, попадающих в клетку. Такими чужеродными последовательностями являются мобильные элементы генома, трансгены и вирусы. RS можно рассматривать как своеобразную «иммунную систему», действующую на уровне нуклеиновых кислот (Waterhouse, et al., 2001).
Умолкание генов у растений может происходить как на посттранскрипционном, так и на транскрипционном уровне (Fagard and Vaucheret, 2000). Транскрипционное умолкание генов (ТУГ) вызвано в первую очередь метилированием остатков цитозина в промотерных областях генов. Это, вероятно, препятствует взаимодействию промотера с транскрипционными факторами или привлекает белки, изменяющие укладку хроматина (chromatin remodeling factors), что может приводить к тому, что определенный ген не будет транскрибироваться (Wang and Waterhouse, 2000). С ТУГ связано метилирование не только промотерных областей, но и последовательностей самих генов (Mette et al., 1999, 2000; Wang et al., 2001; Wassenegger et al, 1994).
Несмотря на то, что исследованию специфической деградации РНК (RS) в последние годы уделяют большое внимание и многие аспекты этого явления уже достаточно хорошо изучены, остается неизвестным, чем обеспечивается распознавание последовательностей, предназначенных для деградации. Установлено, что необходимым условием для RS во всех организмах является наличие двунитевой РНК (днРНК), которая может как индуцировать RS, так и выступать в качестве промежуточного продукта на определенных стадиях этого процесса (Vance and Vaucheret, 2001).
Необходимость наличия днРНК для эффективного развития RS подтверждается в ряде экспериментов, в ходе которых растения трансформировали последовательностями, несущими инвертированные повторы, а их транскрипты имели комплементарные участки, т.е. участки днРНК (Stam et al., 1997; Hamilton et al., 1998; Waterhouse et al., 1998; Wang and Waterhouse, 2000). В таких растениях эффективно развивалось умолкание генов. В контрольных экспериментах, когда растения трансформировали последовательностью гена в прямой или обратной ориентации, явление умолкания генов возникало не всегда (Waterhouse et al., 1998).
С другой стороны, как уже упоминалось, ПТУГ может быть вызвано трансгенами, кодирующими ген в прямой или обратной ориентации (van der Krol et al., 1990; Napoli et al., 1990). Предполагается, что в таких случаях транскрипты некоторых генов, например, гена халконсинтазы или нитрит редуктазы, несут в себе комплементарные последовательности, т.е. участки днРНК (Metzlaff et al., 1997; Berthome et al., 2000), хотя данные о том, возможна ли инициация RS с помощью однонитевых РНК (онРНК), обогащенных участками днРНК, противоречивы (Elbashir et al., 2001b; Szittya et al., 2002). Образование днРНК на основе онРНК может также происходить с участием эндогенной РНК-зависимой РНК полимеразы (РзРп) растений (Dalmay et al., 2000; Mourrian et al., 2000). днРНК, образующаяся в ходе репликации вирусов, может также вызывать RS. Эта разновидность RS называется вирус-индуцированным умолканием генов (ВИУГ). С помощью рекомбинантных вирусов, несущих участки или целые последовательности клеточных генов, можно вызывать ВИУГ этих генов у растений (Baulcombe 1999; Peele etal.,2001).
Таким образом, последовательность трансгена, транскрипт которой содержит протяженные участки днРНК из-за того, что этот трансген содержит инвертированные повторы, является фактором инициации RS. Вирусы, имеющие двунитевую репликативную форму, также способны индуцировать RS. Кроме того, RS может быть вызвана последовательностью, несущей непротяженные участки днРНК, например, трансгенов, кодирующих ген в прямой или обратной ориентации. Экспериментальные данные указывают на то, что в последнем случае RS развивается не всегда, а если развивается, то с меньшей эффективностью, чем в первом случае. В связи с этим, факторы инициации RS, т.н. индукторы, подразделяют на «сильные» и «слабые» (Dalmay et al., 2000; Voinnet et al., 2000; Johansen and Carrington, 2001).
днРНК, необходимая для инициации RS, может также вызывать метилирование последовательностей ДНК. Так, у табака, несущего последовательность вироида веретеновидности клубней картофеля, репликация этого вироида вызывает метилирование последовательности трансгена (Wassenegger et al., 1994). Потеке- и потивирусы (Jones et al., 1998; Jones et al., 1999), вирусная сателлитная РНК (Wang et al., 2001), и транскрипты трансгенов, несущие инвертированные повторы (Mette et al., 1999, 2000), также приводят к метилированию соответствующих трансгенных последовательностей в ядре, к т.н. РНК-зависимому метилированию ДНК. Т.к. днРНК может вызывать как ПТУГ, так и РНК-зависимое метилирование ДНК в растениях, предполагают, что процессы транскрипционного и посттранскрипционного умолкания генов связаны (Sijen et al., 2001).
Супрессия умолкания генов вирус-специфическими белками
Поскольку RS является защитным механизмом эукариот, и, в первую очередь, растений, против вирусной инфекции, фитовирусы, принадлежащие к различным таксономическим группам, кодируют белки, с помощью которых они подавляют основанные на ПТУГ защитные механизмы растений-хозяев (Anandalakshimi et al., 1998; Brigneti et al., 1998; Dunoyer et al., 2002; Guo and Ding, 2002; Pfeffer et al., 2002; van Wezel et al., 2003; Bucher et al., 2003). Сначала предполагали, что ПТУГ растений направлено только на вирусы с однонитевым (+)РНК геномом, т.к. к ним относятся около 90% известных фитовирусов, реплицирующихся с помощью вирус-специфической РзРп, и репликативная форма, представленная днРНК, способна индуцировать ПТУГ (см. выше). В подтверждение этой гипотезы у многих (+)РНК-содержащих вирусов были найдены супрессоры ПТУГ (Voinnet et al., 1999; Carrington et al., 2001). Однако недавние исследования показали, что ДНК-содержащие геминивирусы (Voinnet et al., 1999; van Wezel et al., 2003) и (-)РНК-содержащие тоспо- и тенуивирусы (Takeda et al., 2002; Bucher et al., 2003) также кодируют супрессоры ПТУГ и, следовательно, ПТУГ у растений направлено на вирусы, принадлежащие к различным группам.
Более того, было показано, что RS могут подвергаться не только вирусы растений, но и насекомых. Так, если в культуру клеток или в организм комара с помощью экспрессионной системы на основе вируса синдбис доставить участки генома буньявируса La Crosse, для которого комар является естественным хозяином, а затем инфицировать эту культуру клеток или насекомое вирусом La Crosse дикого типа или другим представителем буньявирусов, в культуре клеток и в организме насекомого будет индуцирована интерференция, которая приведет к понижению накопления вируса в инфицированных клетках по сравнению с обычной инфекцией, а также к развитию антивирусной устойчивости (Powers et al., 1996). Кроме того, был обнаружен Flock house нодавирус насекомых, который вызывает и подвергается RS в клетках Drosophila (Li et al., 2002). Подтверждением антивирусной функции RS у насекомых явилось обнаружение у Flock house нодавируса белка В2, способного подавлять RS в клетках насекомых, тем самым обеспечивая развитие вирусной инфекции (Li et al., 2002). Следовательно, RS у насекомых является механизмом антивирусной защиты. Было также показано, что белок В2 способен подавлять ПТУГ в трансгенных растениях, т.е. этот белок затрагивает некую стадию RS, общую как для насекомых, так и растений, что указывает на консервативность RS у далеких организмов (Li et al., 2002). Таким образом, способность вызывать и подавлять RS является, по-видимому, общим свойством вирусов, инфицирующих различные эукариотические организмы.
Вирусы растений, способные подавлять ПТУГ
Чтобы определить, какие из известных фитовирусов обладают способностью подавлять ответ растения-хозяина, основанный на ПТУГ, была разработана следующая экспериментальная система. В растениях Nicotiana benthamiana, которые экспрессировали трансген зеленого флуоресцирующего белка (green fluorescent р rotein, GFP) Aequorea victoria, часто используемого в качестве репортерного гена, вызывали локальное, а затем системное умолкание этого трансгена (Voinnet and Baulcombe, 1997). Для этого в листья N. benthamiana с помощью инфильтрации штаммом агробактерии Agrobacterium tumefaciens (агроинфильтрации) вводили бинарный вектор Ті, в который была встроена кассета, несущая ген gfp под контролем 358-промотера вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК, cauliflower mosaic virus, CaMV), что обеспечивало высокий уровень экспрессии этого гена в клетках. Таким образом, ПТУГ в этой системе вызывали с помощью «слабого» индуктора - последовательности трансгена в прямой ориентации (Dalmay et al., 2000; Voinnet et al., 2000; Johansen and Carrington, 2001). Далее эти растения инфицировали различными вирусами, которые предположительно могли подавлять ПТУГ. Если вирус обладал этой способностью, экспрессия подвергнутого ПТУГ трансгена восстанавливалась, что можно было определить визуально, т.к. флуоресценция GFP возобновлялась, а также с помощью молекулярных методов анализа мРНК р (Brigneti et al., 1998).
С помощью этой экспериментальной системы удалось показать, что вирусы, принадлежащие к различным группам, способны восстанавливать экспрессию подвергнутого ПТУГ трансгена. К ним относятся (+)РНК-содержащие вирусы, Y-вирус картофеля (YBK), потивирус, вирус огуречной мозаики (ВОМ), кукумовирус, (Brigneti et al., 1998), вирус мозаики коровьего горошка (ВМКГ), комовирус, вирус мозаики нарцисса (ВМН), Х-вирус нандины (ХВН), вирус мозаики фиалки (ВМФ), потексвирусы, вирус табачной мозаики (ВТМ), тобамовирус, вирус погремковости табака (ВПТ), тобравирус, вирус кустистой карликовости томата (ВККТ) томбусвирус, (Voinnet et al., 1999), вирус скрученности арахиса (ВСА), пеклувирус, (Dunoyer et al., 2002); (-)РНК-содержащий тосповирус пятнистого увядания томатов (ВПУТ) (Bucher et al., 2003) и ДНК-содержащий геминивирус мозаики африканской маниоки (ВМАМ) (Voinnet et al., 1999). Инфекция, вызванная этими вирусами, приводит к восстановлению экспрессии подвергнутого ранее ПТУГ трансгена gfp по-разному. Некоторые вирусы, например,
YBK, ВМКГ, ВМН, ХВН, ВМФ, ВТМ, ВПТ, ВКА, ВПУТ, ВМАМ, восстанавливают экспрессию gfp во всех зараженных тканях растения, однако, ВОМ и ВККТ приводят в возобновлению экспрессии gfp только в листьях, образующихся после распространения вирусной инфекции (Brigneti et al., 1998; Voinnet et al., 1999; Bucher et al., 2003), a BCA восстанавливает экспрессию gfp во всех инфицированных тканях, но в листьях, образовавшихся до распространения вируса, флуоресценция GFP возобновляется не во всем листе, а в отдельных его участках и не сразу, а через значительный промежуток времени после инокуляции вирусом (Dunoyer et al., 2002). Т.е. ВКА по своему действию напоминает YBK, т.к. восстанавливает экспрессию подвергнутого ПТУГ трансгена, однако, с меньшей эффективностью (Dunoyer et al., 2002). BCA подавляет ПТУГ во вновь образующихся листьях, т.е. действует аналогично BOM (Dunoyer et al., 2002). Кроме того, ВККТ, ВТМ и ВМКГ восстанавливают экспрессию gfp не во всем инфицированном листе, а вблизи проводящей ткани (Voinnet et al., 1999). Такие различия говорят об отсутствии единого механизма действия белков-супрессоров ПТУГ, кодируемых этими вирусами.
Трансформация бактериальных клеток Е. coli плазмидной ДНК
Вектор для клонирования pUC19 содержал ген устойчивости к ампициллину. При клонировании использовались штаммы Е. coli XL-1 Blue (с устойчивостью к тетрациклину) и JM109 («Promega», США).
Вектор для экспрессии рекомбинантных белков в Е. coli, pQE-30 («Qiagen», Германия) имел ген устойчивости к ампициллину. Для экспрессии рекомбинантных белков использовался штамм Е. coli Ml 5, M15[pRep4], несущий плазмиду pRep4, имеющую устойчивость к канамицину.
Высококопийный бинарный вектор pLH7000, обладающий способностью реплицироваться в Е. coli и A. tumefaciens, нес ген устойчивости к стрептомицину/спектиномицину. При работе с этим вектором использовали штамм А. tumefaciens GV2269, С58/С1, имеющий устойчивость к карбенициллину и рифампицину.
Трансформация бактериальных клеток Е. coli плазмидной ДНК Для приготовления компетентных клеток и трансформации бактерий Е. coli использовали методики, описанные в книге «Молекулярное клонирование» (Sambrook et al, 1989), с некоторыми изменениями. 5 мл ночной культуры клеток Е. coli (штамм XL-1) высевали в 400 мл среды LB (бакто-триптон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, NaCl 5 г/л), содержавшей тетрациклин в концентрации 10 мкг/мл, и выращивали при качании 200 об/мин около 3 ч при 37С до оптической плотности суспензии 0.5 о.е. (к 600 нм). Клетки выдерживали во льду в течение 15 минут, а затем осаждали центрифугированием при 3500 об/мин при 4С (ротор J-14, центрифуга JA-21, «Beckman», США). Далее все операции проводили во льду. Осадок ресуспендировали в 20 мл раствора TSS, приготовленного на основе среды LB и содержащего 10% (вес/объем) полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000, 5% диметилсульфоксида, 50 мМ MgCb, рН 6.5. Суспензию разделяли на аликвоты по 200 мкл, которые замораживали в жидком азоте и хранили при -70С.
Аликвоту суспензии клеток, обработанных таким образом, размораживали при 0С, смешивали с 1/2 объема лигазной смеси, инкубировали 30 мин при 0С и, после теплового шока (2 мин при 42С с последующим охлаждением во льду), прибавляли 0,4 мл среды LB и инкубировали в течение 30 мин при 37иС. Затем клетки высевали на чашки Петри с 1.5% агаром, приготовленным на среде LB, содержащим соответствующие антибиотики, которые использовали в следующих концентрациях: ампициллин (100 мкг/мл), тетрациклин (10 мкг/мл), канамицин (25 мкг/мл), и инкубировали при 37 С около 18 ч.
Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli
Для выделения от 1 до 20 мкг плазмидной ДНК использовали следующую методику. Бактериальную колонию высевали в 2 мл среды LB или 2YT (Маниатис и др., 1984, Sambrook et al., 1989), содержавшей соответствующие антибиотики в указанных выше концентрациях, и выращивали в течение ночи при 37 С в режиме 175 оборотов/мин. Для дальнейших операций использовалась настольная центрифуга фирмы «Eppendorf», Германия, и пробирки той же фирмы. Клетки осаждали центрифугированием в течение 5 мин (5000 об/мин), ресуспендировали в 250 мкл дистиллированной НгО и прибавляли 250 мкл раствора 2 (0.2 М NaOH, 1% SDS), осторожно перемешивали и выдерживали 5 мин при комнатной температуре. К лизату клеток добавляли 250 мкл 3 М ацетата калия (рН 4.8), перемешивали и центрифугировали 10-15 мин (14000 об/мин). Супернатант переносили в новые пробирки, прибавляли равный объем 96% этанола, и центрифугировали 10 мин. Тщательно высушенный осадок растворяли в 100 мкл дистиллированной воды, прибавляли равный объем 8 М хлорида лития, тщательно перемешивали и выдерживали 20 мин при -20С. После центрифугирования в течение 10 мин супернатант переносили в новые пробирки, прибавляли 96% этанол до конечного объема 1.5 мл, после чего ДНК осаждали центрифугированием в течение 10 мин (14000 об/мин), осадок промывали 70% этанолом, тщательно высушивали, а затем растворяли в 50-100 мкл воды. После этого к раствору, содержащему ДНК, прибавляли 5 мкл раствора панкреатической рибонуклеазы А (концентрация 1 мкг/мкл) и инкубировали в течение 30 мин при 37С. Затем к раствору прибавляли трис-ЭДТА буферный раствор (10 мМ трис-HCl, рН 7.6, 1 мМ ЭДТА) до конечного объема 0.3 мл и 0.3 мл раствора, содержащего равные объемы фенола и хлороформа. Смесь интенсивно встряхивали и центрифугировали в течение 4 мин (14000 об/мин). Супернатант переносили в другую пробирку, после чего к нему прибавляли 0.15 объема З М ацетата натрия (рН 4.8) и 96% этанол до конечного объема 1.5 мл. Смесь интенсивно встряхивали и инкубировали в течение 40 мин при -70С. После этого плазмидную ДНК осаждали центрифугированием в течение 10 мин (14000 об/мин), осадок промывали 70% этанолом, затем тщательно высушивали и растворяли в требуемом объеме дистиллированной Н20.
Для выделения более 20 мкг плазмидной ДНК бактериальную колонию высевали в 30-400 мл среды LB (см. Маниатис и др., 1984, Sambrook et al., 1989), содержавшей соответствующие антибиотики в указанных выше концентрациях, и выращивали в течение ночи при 37С в режиме 175 об/мин. Клетки осаждали центрифугированием 5000 об/мин при 4С (ротор J-20, центрифуга JA-21, «Beckman», США). Далее использовали набор для выделения плазмидной ДНК производства «Qiagen» или «Macherey-Nagel», Германия. Все операции проводили, следуя методическому руководству производителя.
Экспрессия рекомбинантных белков в клетках Е. coli Культуру Е. coli штамма M15[pRep4], несущую вектор pQE-GFPC3, предназначенный для экспрессии белка GFPC3 в клетках Е. coli, высевали в 3 мл среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл канамицина, и выращивали до OD 0.8 (X 600 нм) при 37С и постоянном качании при 200 оборотах/мин. Аликвоту выращенной таким образом культуры разводили в 4 раза средой LB, содержащей ампицилин и канамицин в тех же концентрациях, и растили 2 ч при тех же условиях. Для индукции экспрессии белка добавляли IPTG до конечной концентрации 2 мМ/мл и инкубировали в течение 5 ч при постоянном качании 180 оборотов/мин и комнатной температуре. Клетки осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 5000 об/мин и комнатной температуре в настольной центрифуге фирмы «Eppendorf», Германия, после чего для детекции экспрессии GFPC3 осадок облучали ультрафиолетом (X 365 нм) при помощи ручной лампы UVL-56 производства UV Products, Upland, СА.
Изучение влияния экспрессии гена yb ПЛВМ на накопление вирусных белков и РНК ВШМЯ
Для экспериментальной проверки высказанных выше предположений было проанализировано накопление вирус-специфических белков и РНК в листьях N. benthamiana, инокулированных ВШМЯ и ВуР. Листовой материал отбирали на 5, 7, 11 и 15 дпи. Анализ накопления БО ВШМЯ осуществляли, как было описано выше. Иммунодетекцию транспортного белка ТБГ1, кодируемого первой ОРТ тройного блока генов (ТБГ), проводили с использованием специфической поликлональной антисыворотки, любезно предоставленной Н.О. Калининой (МГУ, Москва). Было показано, что вирусный БО можно детектировать в ткани растений, инокулированных ВШМЯ и ВуР, уже на 5 дпи (рис. 10А). К 15 дпи количество вирус-специфического БО увеличивалось, причем в растениях, инфицированных ВуР, количество этого белка превышало количество БО в растениях, инокулированных ВШМЯ (рис. 10А). Динамика накопления белка ТБГ1 отличалась от динамики накопления БО. Так, в растениях, инокулированных ВШМЯ, белок ТБГ1 накапливался в наибольших количествах на 5 дпи, после чего его содержание уменьшалось. На 15 дпи детектировать белок ТБП в инфицированных ВШМЯ растениях не удавалось (рис. 10В). Однако в растениях, инокулированных ВуР, белок ТБП накапливался на 5 дпи в больших количествах, чем в растениях, зараженных ВШМЯ. Затем количество этого белка оставалось неизменным до 7 дпи, после чего к 15 дпи снижалось, но в то же время оставалось достаточно высоким для детекции (рис. 10В).
Иммунодетекция вирус-специфических белков в листьях N. Ъ enthamiana, инокулированных ВШМЯ и ВуР. (А) Накопление БО ВШМЯ. (В) Накопление ТБП. Листовой материал отбирали на 5, 7, 11 и 15 дпи.
Анализ накопления вирус-специфических РНК проводили с помощью блот-гибридизации РНК. Тотальные препараты РНК, выделенные из листьев, инокулированных ВШМЯ или ВуР, разделяли с помощью электрофореза в денатурирующем агарозном геле, затем переносили на нейлоновую мембрану и проводили гибридизацию со специфическими радиоактивно-меченными ДНК-зондами. Детекцию РНКр осуществляли с помощью зонда, представляющего собой область, кодирующую второй и третий белки ТБГ, а также комплементарную ей последовательность. Такой зонд мог гибридизоваться с полноразмерной РНКр и субгеномными РНК белков ТБГ (рис. ПА). Для анализа накопления вирусной РНКу использовали смесь зондов, специфичных по отношению к 3 -концевой области гена белка уа, межцистронной области РНКу и последовательности гена yb ПЛВМ или ВШМЯ. С помощью такого смешанного зонда можно было одновременно детектировать полноразмерную РНКу ВШМЯ, ВуР и субгеномные РНК для выражения белков yb ВШМЯ и ПЛВМ (рис. 11В). Недостатком использования смешанного зонда было то, что разные его компоненты могли иметь различную удельную активность и по-разному реагировать с соответствующими РНК, что могло привести к получению искаженных результатов. Чтобы избежать такого рода ошибок, проводили дополнительный анализ накопления полноразмерной РНКу в тканях, зараженных ВШМЯ и ПЛВМ, с использованием зонда, специфичного к 5 -проксимальной области РНКу ВШМЯ. Этот зонд был универсальным и позволял одновременно детектировать полноразмерную РНКу как химерного вируса, так и вируса дикого типа (рис. ПС). В листьях растений, инокулированных ВШМЯ, РНК(3 и РНКу можно было детектировать на 5-15 дпи, при этом на 11 дпи количество РНК было максимальным (рис. ПА, В, С). В листьях, инокулированных ВуР, РНКр и РНКу можно было также детектировать на 5-15 дпи, при этом количество РНК было наибольшим на 5 и 7 дпи, а затем, на более поздних стадиях развития инфекции, т.е. на 11 и 15 дпи, снижалось (рис. 11А, В, С).
Помимо анализа накопления РНК обеих полярностей, образующихся в растениях, инокулированных ВШМЯ и ВуР, было проведено исследование накопления вирус-специфических (-)РНК с помощью зонда, специфичного к З -UTR ВШМЯ. Этот зонд позволял детектировать все полноразмерные (-)РНК, образующиеся в ходе инфекции как ВШМЯ, так и ВуР. Размеры РНКсс, РНКр, РНКу и РНК-ВуР близки, поэтому смеси РНКа, РНКр и РНКу, а также РНКсс, РНКр и РНК-ВуР мигрировали в денатурирующем агарозном геле в наших условиях в виде одной полосы. Оказалось, что во время инфекции ВШМЯ количество (-)РНК практически не изменялось на 5 и 7 дпи, затем увеличивалось на 11 дпи и уменьшалось на 15 дпи (рис. 1 ID). В листьях N. benthamiana, инокулированных ВуР, на 5 и 7 дпи (-)РНК было больше, чем в растениях, инфицированных ВШМЯ. На 11 дпи ее количество резко уменьшалось и оставалось постоянным до 15 дпи (рис. 1 ID).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что экспрессия белка yb ПЛВМ, вместо соответствующего белка ВШМЯ, приводит к изменению накопления вирус-специфических РНК и белков, что, вероятно, приводит к изменению развития вирусной инфекции ВуР по сравнению с ВШМЯ.
Развитие вирусной инфекции ВШМЯ, несущего делецию гена yb Чтобы получить дополнительное подтверждение того, что белки yb гордеивирусов оказывают влияние на развитие вирусной инфекции, а также осуществляют позитивную регуляцию экспрессии вирусных белков, было проведено сравнение развития инфекции ВШМЯ дикого типа и ВШМЯ, у которого делетирован ген yb, в растениях N. benthamiana. Для этого на основе кДНК копии РНКу ВШМЯ ВШМЯ
Детекция вирусных РНК в листьях N. benthamiana, инокулированных ВШМЯ и ВуР, с помощью блот-гибридизации препаратов тотальной РНК с использованием 32Р-радиоактивно меченных ДНК-зондов, специфичных к (А) РНКр, (В и С) РНКу, (D) (-)РНК. Пробы отбирали на 5, 7, 11 и 15 дпи. сгРНК, субгеномные РНК. Содержание равных количеств РНК в каждой дорожке подтверждено окрашиванием рибосомальной РНК (рРНК) бромистым этидием (нижняя панель). был получен клон с делецией гена yb, PHK-BSMVdelyb (рис. 12). PHK-BSMVdelyb линеаризовали с помощью рестриктазы Mlul и вместе с кДНК-копиями РНКа и РНКр, линеаризованными рестрикционными эндонуклеазами М1и\ и Spel, соответственно, использовали в качестве матриц для транскрипции, как было описано выше. Растения инокулировали смесью полученных транскриптов, что соответствовало инфекции мутантного вируса BSMVdelyb, а также смесью транскриптов, обеспечивавших инфекцию ВШМЯ дикого типа.
