Введение к работе
Актуальность темы
Вакцинация является одним из наиболее эффективных способов профилактики инфекционных заболеваний. «Классические» вакцины предполагают использование для иммунизации ослабленного или инактивированного возбудителя заболевания. Преимуществами вакцин, основанных на «целом» патогене, является высокая иммуногенность, поскольку они представляют патоген иммунной системе в его естественной форме, но они имеют и серьезные недостатки, в том числе возможность реверсии к патогенной форме или неполной инактивации, аллергические реакции и нежелательные побочные эффекты, обусловленные сложным составом препарата, содержащего полный набор белков патогена, а не только основные иммуногенные белки. Следующим этапом в разработке вакцин стало создание белковых вакцин, использующих только один или несколько основных высокоиммуногенных белков патогена (антигенов), как правило, поверхностных, или даже их коротких участков (эпитопов), распознающихся антителами. Белковые вакцины могут быть получены на основе патогена в результате выделения из него отдельного белка(ов); альтернативой является получение рекомбинантного белка в стандартных организмах-продуцентах. Однако вследствие отличий в генерации иммунного ответа против целого патогена и против отдельных белков, подобные вакцины в большинстве случаев вызывают более слабый иммунный ответ.
Решением этой проблемы может являться направленное конструирование наноструктур, имитирующих структуру патогена и содержащих отдельные высокоиммуногенные белки патогена на своей поверхности («нановакцины»). Такой подход позволяет использовать преимущества белковых вакцин и нивелировать их недостатки, имитируя структуру патогена и, следовательно, его взаимодействие с иммунной системой.
Грипп является одним из наиболее распространенных инфекционных заболеваний человека и животных. Используемые в настоящее время противогриппозные вакцины основаны на получаемых в куриных эмбрионах вирусе гриппа или его компонентах. Однако, высокая изменчивость основных поверхностных антигенов вируса гриппа, гемагглютинина и нейраминидазы, приводит к возникновению нового эпидемического штамма каждые 1-2 года, что требует столь же частого обновления состава вакцины. Кроме того, возможна рекомбинация между вирусами гриппа человека и животных, при этом возникают вирусы с новыми антигенными свойствами, не узнаваемые иммунной системой человека и,
следовательно, обладающие пандемическим потенциалом. Создание и наработка традиционной вакцины, специфичной к новому штамму, занимает, как правило, несколько месяцев, в течение которых распространение инфекции может привести к гибели большого количества людей.
Поэтому актуальной является задача создания рекомбинантных противогриппозных вакцин широкого спектра действия, которые «перекрывают» антигенные свойства различных актуальных штаммов гриппа за счет использования консервативных белков вируса. Перспективным объектом для создания такой рекомбинантной «универсальной» вакцины является внеклеточный домен трансмембранного белка М2 вируса гриппа, М2е. Особенностью М2е, имеющего длину всего 23 а.о., является его консервативность: у абсолютного большинства вирусов гриппа, выделенных у человека начиная с 1933г., последовательность М2е практически неизменна, у штаммов животного происхождения она отличается по нескольким аминокислотам. Однако, задача создания вакцины на основе М2е осложняется тем, что этот белок низкоиммуногенен и при инфекции иммунный ответ против него практически не активируется. Решением этой проблемы является присоединение М2е к вирусоподобной наноразмерной частице-носителю.
Способность биологических макромолекул к самосборке и самоорганизации предоставляет широкие возможности для использования биомолекул для направленного создания новых наноархитектур с заданными пространственными и функциональными свойствами. Одним из наиболее ярких примеров таких структур, обладающих четкой симметрией и возможностями направленной модификации являются вирусные частицы и имеющие сходную структуру вирусоподобные частицы (ВПЧ), образуемые в результате самосборки капсидных белков вирусов. Представление антигенов на поверхности ВПЧ обеспечивает их высокую иммуногенность за счет высокой плотности и упорядоченного симметричного расположения эпитопов.
Предметом данной работы является дизайн и получение рекомбинантных вирусоподобных частиц - носителей М2е пептида вируса гриппа типа А. В качестве основы для создания рекомбинантных ВПЧ был использован ядерный (коровый) антиген вируса гепатита В (НВс антиген), мономеры которого собираются в наноразмерные вирусоподобные НВс частицы. Мы сконструировали рекомбинантные НВс частицы, представляющие на своей поверхности антигены вируса гриппа, разработали методы их получения и очистки. Иммунологические характеристики и протективность рекомбинантных НВс частиц были определены в экспериментах на лабораторных животных.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы является конструирование вирусоподобных наноразмерных частиц на основе НВс антигена вируса гепатита В и М2 белка вируса гриппа, разработка методов их получения и очистки. Для этого в работе решались следующие задачи:
-
Конструирование рекомбинантных вирусоподобных частиц на основе НВс антигена вируса гепатита В, содержащих вставку нескольких копий внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа (М2е) в район иммунодоминантной петли НВс антигена.
-
Разработка нового способа презентации чужеродных пептидов на поверхности НВс-частиц, основанного на специфическом нековалентном связывании чужеродных пептидов с НВс частицами in vitro, и получение белковых комплексов на основе НВс частиц и М2е пептидов двух различных штаммов вируса гриппа.
-
Оптимизация метода получения вирусоподобных НВс частиц в результате сборки из мономеров НВс белка in vitro.
-
Характеристика иммуногенности и протективного действия препаратов вирусоподобных частиц, содержащих М2е, на лабораторных животных.
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые получены рекомбинантные белки НВс, в район иммунодоминантной петли которых включено несколько копий М2е пептидов вируса гриппа. Установлено, что увеличение числа копий М2е в НВс с одной до четырех повышает как иммуногенность, так и протективность соответствующих вирусоподобных частиц. Эксперименты на лабораторных животных показали высокую иммуногенность и протективное действие полученных НВс частиц, одержащих 4 копии М2е пептида.
Разработан новый способ презентации чужеродных пептидов на поверхности
НВс частиц, основанный на специфическом нековалентном связывании целевого
пептида с немодифицированными НВс частицами in vitro за счет включения в состав
пептида специфической последовательности, взаимодействующий с
экспонированными на поверхности НВс частиц иммунодоминантными петлями. Получены белковые комплексы, содержащие М2е пептиды различных штаммов вируса гриппа и НВс частицы. Установлено, что иммунизация мышей этим препаратом обеспечивает 100% защиту от заражения штаммами вируса гриппа, М2е пептиды которых входят в его состав. Предлагаемый метод, с одной стороны, позволяет решить проблему возможного нарушения структуры частиц в результате вставки целевого пептида, поскольку он связывается с уже собранной немодифицированной частицей. С
другой стороны, он позволяет получать комплексы, в которых с одной НВс частицей могут быть связаны одновременно разные целевые пептиды, что может оказаться полезным для создания вакцин, основанных на нескольких эпитопах, а также для включения в состав препарата различных иммуномодуляторов.
Практическая значимость работы обусловлена перспективами использования рекомбинантных вирусоподобных частиц - носителей внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа в качестве основы новых рекомбинантных противогриппозных вакцин, эффективных в отношении различных штаммов вируса гриппа типа А, в том числе новых потенциально пандемических штаммов животного происхождения. Апробация работы
Полученные в диссертации результаты были представлены на следующих международных и российских конференциях: "Virus-Like Particle And Nano-Particle Vaccines - VLPNPV 2012" (Канны, Франция, 2012), Международной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина» (Московская область, 2011), Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2012), Научно-практической конференции «Грипп: эпидемиология, вирусология, профилактика и лечение» (Санкт-Петербург, 2012).
Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Иммунологические характеристики и протективность рекомбинантных НВс частиц определены в экспериментах на лабораторных животных в ФГБУ «НИИгриппа» Минздрава России. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Публикации
По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК РФ. Объем и структура диссертации
Материалы диссертации изложены на 120 страницах машинописного текста и включают 49 рисунков и 5 таблиц. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Цель и задачи работы", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", "Выводы", "Список публикаций по теме диссертации", "Список цитируемой литературы", который содержит 9 отечественных и 163 иностранных источников.
