Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Геномная организация вируса гепатита С 11
1.1.1. Нетранслируемые области 14
5 UTR 14
3 UTR 14
1.1.2. Белки ВГС 14
1.1.2.1. Структурные белки 15
Кор белок ВГС, структурный белок капсида 15
Белки оболочки ВГС 17 р7 19
1.1.2.2. Неструктурные белки 19
NS2 19
NS3HNS4A 19
NS4B 20
NS5A 20
NS5B 21
1. 2. Жизненный цикл вируса 22
1.2.1. Проникновение вирусных частиц в клетку 22
1.2.1.1. Прикрепление и проникновение 23
CD-81- рецептор LDLR - рецептор 24
SR-BI - рецептор мусорщик 24
Гликозаминогликаны 25
1.2.1.2. Выход в цитоплазму и раздевание РНК вирусного генома 25
1.2.2. Трансляция ВГС и протеолитический процессинг 27
1.2.3. Репликация ВГС 29
1.2.4. Сборка вирусной частицы 31
1.3. Морфогенез вируса гепатита С 36
1.3.1. Биогенезис гликопротеинов оболочки вируса гепатита С 36
Посттрансляционный процессинг белков 38
1.3.2. Гликозилирование гликопротеинов в клетках насекомых 42
1.3.3. Гликозилирование гликопротеинов в клетках млекопитающих 50
1.3.4. N-гликаны гликопротеинов ВГС и их роль в функционировании белков оболочки вируса 52
1.4. Методы исследования гликозилирования белков оболочки ВГС 55
1.4.1. Сайт-направленный мутагенез ДНК 55
1.4.2. Получение вирусоподобных частиц ВГС в клетках насекомых 59
1.4.3. Использование ВасМат системы в клетках млекопитающих 64
1.5. Модельные системы для изучения вирусного морфогенеза 67
1.5.1. Ретровирусные псевдочастицы (HCVpp) 68
1.5.2. Вирусоподобные частицы (HCV-LP) 69
1.5.3. Система репликонов ВГС
1.5.3.1. Системы репликации с использованием самореплицирующихся РНК. JFH-1 репликоныВГС 72
1.5.3.2. Использование бакуловируса для доставки и капсидирования JFH-1 РНК в клетках Huh-7 73
2. Экспериментальная часть 77
2.1. Бактериальные клетки, клеточные культуры и плазмиды 77
2.2. Сайт-направленный мутагенез и создание рекомбинантных конструкций 77
2.3. Анализ суммарной клеточной ДНК 79
2.4. Получение микросом 79
2.5. Электронная микроскопия 80
2.6. Анализ РНК ВГС с помощью ОТ-ПЦР 80
2.7. Вестерн-блот и иммуноосаждение 81
2.8. Анализ гликозилирования - обработка эндогликозидазой Н (Endo Н)...82
2.9. Получение и очистка вирусоподобных частиц (ВПЧ) 2.10. Центрифугирование в сахарозном градиенте 83
2.11. Анализ связывания ВПЧ с рецептором CD-81 83
2.12. Флуоресцентная микроскопия и проточная цитофлуориметрия 83
2.13. Моделирование трехмерной структуры 84
3. Результаты и обсуждение 85
3.1 Создание набора векторных конструкций, содержащих точечные мутации в сайтах N-гликозилирования белков Е1 и Е2 вируса гепатита С, для экспрессии мутантных белков в клетках насекомых и млекопитающих 85
3.2. Экспрессия мутантных белков Е1 и Е2 вируса гепатита С в клетках эукариот с использованием бакуловирусной системы экспрессии 87
3.2.1. Влияние N-гликанов гликопротеинов Е1 и Е2 ВГС на экспрессию генов мутантных белков в клетках насекомых и млекопитающих 87
3.3. Исследование роли гликозилирования белков оболочки ВГС в вирусном морфогенезе в клетках насекомых и млекопитающих
3.3.1. Влияние N-гликанов гликопротеинов оболочки вируса гепатита С на образование продуктивного комплекса Е1Е2 в клетках 5/9 95
3.3.2. Влияние N-гликанов гликопротеинов оболочки вируса гепатита С на образование вирусоподобных частиц в клетках насекомых и млекопитающих 98
3.3.3. Влияние N-гликанов гликопротеина Е2 ВГС на связывание рекомбинантных вирусоподобных частиц ВГС, полученных в модельной бакуловирусной системе, с рецептором CD-81 в клетках Huh 7 105
4. Моделирование пространственной структуры мутантных белков Е1 ВГС 106
Заключение 109
Выводы 111
Список литературы 114
Благодарности
- Нетранслируемые области
- N-гликаны гликопротеинов ВГС и их роль в функционировании белков оболочки вируса
- Экспрессия мутантных белков Е1 и Е2 вируса гепатита С в клетках эукариот с использованием бакуловирусной системы экспрессии
- Влияние N-гликанов гликопротеинов оболочки вируса гепатита С на образование вирусоподобных частиц в клетках насекомых и млекопитающих
Нетранслируемые области
Семейство вирусов Flaviviridae делится на три вида: флавивирусы, пестивирусы и гепатовирусы. Представителями вида флавивирусов являются: вирус желтой лихорадки, вирус лихорадки Денге, японский энцефалит и клещевой вирусный энцефалит. К пестивирусам относят вирус диареи скота, вирус классической лихорадки и вирус пограничной болезни овец. К гепатовирусам, помимо вирусов гепатита А, В, D, Е, G относится и вирус гепатита С с семью генотипами и множеством субтипов [4]. О вирусе гепатита В известно с 1963 года, а о вирусе гепатита А - с 1973. Тогда же был обнаружен неизвестный, не относящийся к вирусам гепатита А и В, вирус, вызывающий посттрансфузионный гепатит у пациентов, которым переливали кровь от доноров, не зараженных известными вирусами, инфицирующими организм. Данный вирус был назван вирусом гепатита non-A-non-B (ни-А-ни-Б). В 1987 году Michael Houghton, Qui-Lim Choo и George Kuo использовали методы молекулярного клонирования для идентификации неизвестного вируса. У больных, зараженных гепатитом ни-А, ни-Б, было выявлено наличие вирусной РНК, характерной для флавивирусов. Последующие исследования позволили идентифицировать обнаруженную РНК и в 1989 году вирус гепатита non-A-non-B переименовали в вирус гепатита С [5,6].
HCV (ВГС) отнесли к роду Hepacivirus, семейства Flaviviridae. Члены семейства Flaviviridae имеют, близкую организацию генома и вирусные характеристики. Все они являются оболочечными вирусами, вирионы которых заключены в липидный бислой, в котором заякорены один либо два оболочечных протеина. Оболочка в виде липиднго бислоя с белками Е1 и Е2 окружает нуклеокапсид, состоящий из многочисленных копий небольшого белка кор (С или core) и геномной РНК. Геном вирусов Flaviviridae представляет собой положительную цепь РНК размером от 9.6 до 12.3 т.п.н. с открытой рамкой считывания (ORF), кодирующую единственный полипротеиновый предшественник, длиной от 3000 аминокислотных остатков, который под действием клеточных и вирусных протеаз расщепляется на зрелые функциональные вирусные белки. На N-конце полипротеина располагаются структурные белки, на С-конце -неструктурные. Консервативные последовательности РНК-зависимой РНК полимеразы среди всех вирусов семейства Flaviviridae, располагаются на аналогичных местах [7]. ORF на 5 и 3 концах фланкирована нетранслируемыми районами (UTR) длиной в 95-555 и 114-624 п.н. соответственно, играющими важную роль в трансляции полипротеина и репликации РНК (Рис. 1) [8].
Несмотря на родственное сходство с представителями семейства Flaviviridae, ВГС обладает определенными различиями. Этот вирус имеет узкую специфичность к хозяину и ограниченный тканевый тропизм. Вирус гепатита С передается редко, не более, чем в 5% случаев. Основной механизм инфицирования вирусом - гематогенный, парентеральный (прямой контакт с помощью крови). Флавивирусы переносятся москитами и клещами и поражают позвоночных широкого спектра, в том числе людей, не участвующих в вирусном распространении. Ни один из известных пестивирусов не способен инфицировать человека. Инфекции, вызванные флавивирусами, являются преходящими у позвоночных, тогда как инфекции, вызванные вирусом гепатита С, имеют высокий процент трансформации в хронику у людей. Флавивирусы и пестивирусы вызывают сильный адаптивный гуморальный и клеточный иммунный ответ на инфекцию, в то время как гепатит С вызывает иммунный ответ, который не в состоянии предотвратить хроническое заболевание и, в большинстве случаев, не способен защитить от повторного заражения [9]. Flaviviridae транслируются с помощью кэп-последовательности 5 UTR(m7GpppAmp), расположенной после консервативной AG последовательности и относительно коротким участком перед полипротеин-кодирующей области [10]. 5 UTR ВГС не содержит последовательности кэпа и, также как и пестивирусы, формирует комплекс РНК с частью кор-кодирующего домена, образуя внешний сайт посадки рибосомы (IRES), который является непосредственным местом прикрепления 40 S субъединицы рибосомы и клеточных факторов трансляции. В то время как 3 UTR флавивирусов высоко структурирован, 3 UTR ВГС менее структурирован, относительно короткий и содержит полиуридиновый участок варьирующейся длины. На рис.2 представлена схема геномной организации ВГС. высокоструктурированные домены, включающие различные петли и псевдоузлы [12,13]. Определенные домены вместе с нуклеотидами кор-кодирующей области (с 12 п.н. по 30 п.н.) образуют IRES [14]. IRES геномной РНК ВГС формирует стабильный инициирующий комплекс, непосредственно связывающий 40S субъединицу рибосомы без дополнительных трансляционных инициирующих факторов. 5 UTR содержит сигналы репликации отрицательной цепи РНК, являющейся промежуточной РНК [15]. Показано, что микроРНК гепатоцитов MiR-122, характерная для клеток печени, связывается с 5 UTR, регулируя репликацию и трансляцию ВГС [16].
UTR Область 3 UTR РНК ВГС содержит 225 п.н., состоит из трех участков: вариабельного участка 30-40 п.н., протяженного poly(U)-poly(U/UC) и высококонсервативной области З Х, длиной 98 п.н. [17,18,19]. 3 UTR взаимодействует с NS5B RdRp и со структурами, расположенными на 3 конце последовательности NS5B [20]. С репликацией РНК связаны З Х-область и последовательность длиной 52 п.н., располагающаяся выше участка poly(U/C) [21].
N-гликаны гликопротеинов ВГС и их роль в функционировании белков оболочки вируса
Важное отличие процессинга в клетках насекомых от млекопитающих в том, что в насекомых присутствует фукозилтрансфераза, которая способна образовывать промежуточные гликаны GlcNAcMan3GlcNAc(al,6Fuc)GlcNAc, формируя a 1-3 фукозилированный N гликан [212]. а1,Зфукозилтрансферазе необходим предварительный катализ а1,6-фукозилтрансферазой, в результате которого образовавшийся N-гликан становится аллергеном для млекопитающих [213]. Также в некоторых клетках насекомых наблюдается активность P-N ацетилгликозаминтрансферазы (GlcNAcase), в результате действия которой возможно специфичное удаление N-гликозаминного остатка от GlcNAcMan3GlcNAc(+/-a3/6Fuc)GlcNAc [214]. Таким образом образуется промежуточный олигоманнозный N-гликан Man3GlcNAc(+/- (xFuc)GlcNAc, который в дальнейшем не достраивается.
Считается, что у насекомых нет гликозилтрансферазы и сиаловой кислоты. Поэтому процессинг N-гликан заканчивается получением олигоманнозной структуры. Полная картина совсем не так проста, тем не менее, согласно обширным биохимическим, гистохимическим, структурным и молекулярно-генетическим данным, предполагается, что в некоторых клетках насекомых гликаны удлиняются и даже сиалируются. В частности, биоинформатический анализ генома Drosophila melanogaster выявил, что в клетках насекомых есть ген отвечающий за ветвление, удлинение и сиалирование гликан. Предполагаемые биохимические функции некоторых из этих генных продуктов были экспериментально подтверждены [215]. Причем экспрессия генов, в которую включена элонгация и сиалирование N-гликан, ограничивается специфичностью ткани и/или стадиями развития клеток насекомых. Геном Drosophila melanogaster кодирует три гомолога f$4GalT и гомологи GlcNAcI, II, ill, IV,Vn - TVI [216]. Предполагаемый ген /34GalT наиболее схож с человеческими fiGalT-VII (CGI 170 Генбанк №АЕ003750). 2 других предполагаемых члена семейства, /3GalT(CG8536 Генбанк №AAF58268 и CG14519 Генбанк № AAF56843), наиболее схожи с GalT-I и VI человека, которые учавствуют в гликопротеиновом и гликолипидном процессинге. Интересно, что экспрессия и биохимическая характеристика этих гомологов показала, что они предпочтительно перемещают N-ацетилгалактозамин, нежели галактозу, с соответствующих доноров Сахаров акцепторного субстрата [217]. Клонирование и характеристика гена /34GalT (C.elegans и Trichoplusia пі) показала, что эти генные продукты преимущественно перемещают N ацетилгалактозамин-галактозу-М-ацетилглюкозамин с доноров Сахаров к различным акцепторам in vitro [210].
До сих пор остается неизвестным, происходит ли сиалирование гликопротеинов в клетках насекомых с использованием бакуловирусной системы экспрессии (БЭС). По некоторым данным, в клетках насекомых нет сиаловой кислоты и какой-либо сиалтрансферазной активности, и N-гликаны на рекомбинантных гликопротеинах в бакуловирусной системе экспрессии не сиалированы. Однако, согласно другим данным, в тканях насекомых и на N-гликопротеинах, полученных в бакуловирусной системе экспрессии, наблюдается присутствие сиаловой кислоты [218,219].
В Drosophila melanogaster сиалирование N-гликан происходит лишь в клетках нервной системы и регулируется в соответствии с развитием [220]. Дальнейшие поиски гомолога выявили наличие в Drosophila melanogaster генов, потенциально вовлеченных в биосинтез и использование сиаловой кислоты. К этим генам относятся Neu5Ac фосфатная синтаза, CMP-Neu5Ac синтаза, CMP-Neu5Ac/CMP антипортер и сиалилтрансферазные гены. Биохимическая активность продукта гена Neu5Ac показывает, что он, возможно, участвует в биосинтезировании сиаловой кислоты в клетках насекомых [215]. В отличие от результатов, полученных с Neu5Ac фосфатной синтазой и сиалилтрансферазой, функциональный анализ предположительного CMP-Neu5Ac/CMP антипортерного генного продукта показал отсутствие этой функции и функции UDP-галактоз/ЦМР и UDP-N-ацетилгалактозамин/иМР антипортера [221].
Можно заключить, что в клетках некоторых тканей насекомых, N-гликаны могут потенциально сиалироваться. Данный факт важен для понимания гликобиологии насекомых. Однако стоит подчеркнуть, что в клетках, используемых в бакуловирусной системе экспрессии (sf21, S/9, BTI-Тп-5В1-4), сиалирование не происходит. Таким образом, используя БЭС, стоит учитывать несоответствие N-гликан конечного продукта с аналогичным продуктом, полученным в клетках млекопитающих. Таким образом, главный продукт N-гликозилирования в клетках насекомых состоит из 8 высокоманнозных или олигоманнозных структур (Рис.8). Олигоманнозный N-гликан является предшественником гибридного и комплексного N-гликанов, образующихся в высших эукариотах.
Тем не менее, существуют различные генно-инженерные методы для продления процессинга N-гликан в клетках насекомых при использовании БЭС. Одним из таких методов является дополнение генома клеток насекомых генами млекопитающих. Технически это может быть выполнено путем включения последних в геномный вектор вируса, либо в геном клетки хозяина. В любом случае, важно относительное время экспрессии белка, поскольку гены, кодирующие новые "процессирующие" функции, должны быть получены прежде, чем будет синтезирован целевой белок. В этом случае возможно эндогенное программирование процессинга N-гликан и получение наиболее аутентичных млекопитающим N-гликан. Были получены бакуловирусные векторы, кодирующие гены, продукты которых прецессировали N-гликаны в клетках насекомых под транскрипционным контролем одного или нескольких ранних бакуловирусных промоторов с геном интереса, помещенным под контроль позднего промотора [222,223]. Кроме того, исследования показывают, что данный тип бакуловирусных векторов может быть использован для трансфекции обычных клеток чешуекрылых и получения аутентичных млекопитающим N-гликан. Другой способ получения белкового продукта с такими N-гликанами -использование трансгенных клеточных линий с рекомбинантными генами, кодирующими ферменты млекопитающих под контролем одного или нескольких бакуловирусных промоторов iel. Такие клеточные линии могут поддерживать бакуловирусную инфекцию и синтезировать чужеродный белок с удлиненным N-гликаном [224].
Показано, что в клетках млекопитающих можно менять условия культивирования, которые способны влиять на получение белков с измененными N-гликанами. Добавление в среду с клетками СНО ManNAc приводит к удлинению сиалирования N-гликан [225]. Такие изменения условий культивирования могут быть использованы также для изменения состава N-гликан у белков, получаемых в бакуловирусной системе экспрессии. Добавление маннозамина в культуральную среду клеток чешуекрылых увеличивает количество N-гликан с концевым N-ацетилгликозамином [226]. Добавление ManNAc увеличивает сиалирование N-гликан в клетках Tn-4h [227]. А добавление в культуральную среду лимфы Bombix mori повышает сиалирование N-гликан в клетках Tn-4s [228].
Экспрессия мутантных белков Е1 и Е2 вируса гепатита С в клетках эукариот с использованием бакуловирусной системы экспрессии
Оказалось, что интенсивность синтеза Е2 ВГС в клетках млекопитающих зависит от присутствия гликанов в определенных сайтах гликозилирования. Для анализа влияния N-гликанов гликопротеина Е2 ВГС на эффективность экспрессии белков оболочки вируса в клетках млекопитающих, были сконструированы плазмидные ДНК pFastBacMamlGFP на основе бакуловирусного вектора с экспрессирующими кассетами под контролем промотора CMV, с последовательностями кДНК мутантных Е2. Полученными векторными ДНК pFastBacMam-CElE2mutGFP, кодирующими Е2 с точечными заменами в сайтах гликозилирования N1, N2, N4, N8, N10, mL(Nl-N7), mR(N8-Nll) и N(N1-N11) трансфицировали клетки НЕК293Т человека. Экспрессию генов мутантных белков Е2 ВГС и эффективность их гликозилирования в клетках оценивали по уровню синтеза полипептидов CElE2mutGFP, используя методы проточной цитофлуориметрии и электрофореза в ПААГ с последующим иммуноблоттингом (Рис.22 А, Б).
Согласно результатам проточной цитофлуориметрии, отсутствие сайтов гликозилирования N1 и N8 Е2 ВГС приводит к значительному снижению флуоресценции GFP, что свидетельствует о снижении синтеза Е2 в составе полипептидов CElE2MyTGFP в клетках НЕК293Т, по сравнению с исходным. К незначительному снижению синтеза гликопротеина Е2 ведет мутация в сайте N10. Электрофорез в ПААГ, с последующим иммуноблоттингом, показал, что мутантные варианты Е2 синтезируются в клетках млекопитающих, а интенсивность их синтеза зависит от присутствия гликанов в определенных сайтах гликозилирования белка. При этом, электрофоретическая подвижность белков возрастает пропорционально уменьшению числа сайтов гликозилирования.
Таким образом, согласно нашим результатам, удаление единичных сайтов гликозилирования гликопротеина Е1 и Е2 (за исключением сайта N6), не сказывается на эффективности синтеза этих белков в клетках насекомых S/9, а их электрофоретическая подвижность возрастает пропорционально снижению числа сайтов гликозилирования. Отсутствие углеводных цепей в сайтах N1 и N5 Е1 существенно уменьшает уровень его экспрессии в клетках млекопитающих НЕК293Т, а уровень синтеза гликопротеина Е2 ВГС в клетках НЕК293Т зависит от присутствия гликанов в сайтах гликозилирования N1, N8 и N10.
Известно, что N-гликозилирование в клетках Spodoptera frugiperda, в которых могут отсутствовать соответствующие гликозилтрансферазы, не всегда происходит в полной мере так, как в клетках млекопитающих. Проблемы неадекватности гликозилирования для разных гликопротеинов иногда приходится преодолевать. Мы показали, что в клетках насекомых S/9 происходит не только синтез белков оболочки ВГС, но и их эффективное посттрансляционное гликозилирование. Обработка мутантных гликопротеинов Е1 эндогликозидазой EndoH, с последующим вестерн-блот анализом, показала, что синтезированные в клетках насекомых мутантные гликопротеины, как и природный белок ВГС, чувствительны к последней (Рис. 17 Б). Анализ экспрессии генов гликопротеинов Е1 и Е2 ВГС, синтезированных в инфицированных бакуловирусом bv-ElE2 клетках насекомых в присутствии и отсутствии туникамицина, с помощью вестерн-блоттинга с антителами к Е2 ВГС (Рис. 23 А и Б) также демонстрирует, что в клетках S/9 происходит эффективное гликозилирование мутантных гликопротеинов ВГС.
Анализ экспрессии генов мутантных белков Е1 в составе Е1Е2 ВГС в клетках S/9. А - Вестерн- блоттинг в 10% ПААГ с антителами к кальнексину и Б - к кальретикулину после предварительного иммуноосаждения с антителами к Е2. Лизаты клеток, зараженных рекомбинантными бакуловирусами синтезирующих Е1: 1 - Е1 дикого типа; 2 - Е1 с мутацией в сайте гликозилирования N3; 3 - Е1 с мутацией в сайте гликозилирования N5; 4 - Е1 с мутациями в сайтах гликозилирования N1 и N5; 5 - Е1 с мутациями во всех пяти сайтах гликозилирования. кДа, маркеры молекулярной массы белков.
Оказалось, что сборка гликопротеиновых комплексов Е1Е2 ВГС в клетках насекомых зависит от нарушения сайтов гликозилирования N1 и N5 гликопротеина Е1, в то время как мутации остальных сайтов ее не нарушают.
Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 ВГС в составе гликопротеиновых комплексов Е1Е2 в клетках насекомых S/9 показал, что при нарушении одного из сайтов гликозилирования N3, N4, N7, или N8 формируется нековалентно связанный комплекс Е1Е2 также, как и в случае экспрессии Е2 дикого типа. Мутантные Е2, лишенные сайтов N9 и N11, проявляют промежуточный эффект на сборку гликопротеинов оболочки ВГС. По мере увеличения числа поврежденных сайтов (Nl-N7(mL) и N8-N11 (mR), взаимодействие гетеро димеров с кальнексином уменьшается и сборка продуктивного комплекса Е1Е2 нарушается. Агрегаты неправильно свернутых димеров Е1Е2, образованные белком Е2 с мутациями во всех сайтах гликозилирования, с кальнексином не взаимодействуют. Интересно, что сборка нековалентно связанного комплекса Е1Е2 нарушается также в результате повреждения одного из сайтов N1, N2 или N10. Мутации именно этих сайтов гликозилирования Е2, по видимому, препятствуют образованию правильной конформации белков, образующих функциональный комплекс Е1Е2 (Рис 25 А, Б и В).
Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 ВГС в клетках SJ9. А - Вестерн-блоттинг в денатурирующем 12% ПААГ с антителами к кальнексину после предварительного иммуноосаждения антителами к гликопротеину Е2 ВГС. Лизаты клеток, зараженных рекомбинантными бакуловирусами синтезирующих Е2: WT - Е2 дикого типа; Е2 с мутациями в сайтах гликозилирования N1; N2; N3; N4; N6; N7; N8; N9; N10; N11; Nl-N7(mL); N8-Nll(mR); Nl-Nll(EN) - во всех сайтах гликозилирования Е2; Б - Вестерн-блоттинг в денатурирующем 10% ПААГ с антителами к кальнексину и В - к кальретикулину. Лизаты клеток, зараженных рекомбинантными бакуловирусами синтезирующих Е2 с мутациями в составе Е1Е2; К - отрицательный контроль (Hsp90), кДа, маркеры молекулярной массы белков; Мутантные белки обозначены Е2 .
Влияние N-гликанов гликопротеинов оболочки вируса гепатита С на образование вирусоподобных частиц в клетках насекомых и млекопитающих
Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 ВГС в составе СЕ1Е2 в клетках насекомых S/9 показал, что нарушение сайтов гликозилирования в разных комбинациях (за исключением сайта N6), не влияет на их синтез, при этом электрофоретическая подвижность мутантных белков возрастает пропорционально уменьшению числа сайтов гликозилирования (Рис.28 А). Мутации, введенные в сайты гликозилирования N3, N4, N7, N8, N9, N11 Е2 не препятствуют укладке гликопротеинов в составе СЕ1Е2 ВГС в клетках S/9. В то же время, повреждение сайтов N1, N2 и N10 ее нарушает, приводя к образованию непродуктивных гетеродимеров Е1Е2 и, соответственно, их неправильной упаковке в составе ВПЧ (Рис.28 Б, В). Образование агрегатов неправильно свернутых гликопротеинов не препятствует образованию ВПЧ ВГС в клетках насекомых, но, по всей видимости, приводит к образованию дефектных вирусных частиц, отличающихся от природных.
Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 ВГС в составе СЕ1Е2 в клетках почки человека НЕК293Т показал, что при образовании белков Е2, лишенных одного из сайтов гликозилирования N4 или N8, не нарушается правильная упаковка гликопротеинов в составе СЕ1Е2 ВГС, также как и в клетках S/9. При этом, по мере увеличения числа поврежденных сайтов гликозилирования Nl-N7(mL) или N8-Nll(mR) Е2, взаимодействие образованных гетеродимеров с кальнексином уменьшается, а с кальретикулином увеличивается. С кальретикулином взаимодействуют димеры, образованные Е2 с мутациями во всех сайтах гликозилирования
Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 в составе СЕ1Е2 ВГС в клетках млекопитающих НЕК293Т. А - Вестерн-блот в денатурирующем 10% ПААГ с антителами к кальнексину и Б - к кальретикулину. Лизаты клеток, трансфицированные рекомбинантными плазмидными ДНК pFastBacMamCElE2GFP синтезирующими Е2 с мутациями в сайтах гликозилирования: N1; N2; N4; N8; N10; Nl-N7(mL); N8-Nll(mR); Nl-Nll(XN) - во всех сайтах гликозилирования; WT - Е2 дикого типа; К -отрицательный контроль (Hsp90). Маркеры молекулярной массы белков, кДа; Мутантные белки обозначены Е2 .
Оказалось, что сборка продуктивного комплекса Е1Е2 в составе СЕ1Е2 ВГС в клетках млекопитающих, также как и в клетках насекомых, нарушается в результате повреждения сайтов гликозилирования N1, N2 и частично N10 гликопротеина Е2. Отсутствие углеводных цепей в сайтах N1, N2 и, в меньшей степени N10, гликопротеина Е2, по видимому, играет существенную роль в нарушении конформации белков функционального комплекса ВПЧ ВГС, препятствуя образованию в клетках полноценных вирусных частиц.
Т.о., как следует из представленных результатов, введение мутаций в сайты гликозилирования не препятствует образованию ВПЧ ВГС в клетках, но, вероятно, ВПЧ, образованные мутантными E1N1, E1N5, E2N1, E2N2 и E2N10, могут содержать неправильно упакованные гликопротеины.
Мы показали образование ВПЧ ВГС в клетках насекомых с помощью вестерн-блоттинга с антителами к ВГС и электронной микроскопии. Для получения биофизических характеристик ВПЧ ВГС, полученных в клетках млекопитающих, проводили их очистку и концентрирование центрифугированием через 30% сахарозную "подушку" при 230000g, а осадок ВПЧ анализировали с помощью центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы. Собранные фракции оценивали по осаждению при плотности, типичной для частиц вируса гепатита С (1,14 до 1,16 г/смЗ) и анализировали с помощью вестерн-блоттинга с антителами к структурным белкам (Рис.30 А, Б и В). сахароза
Анализ вирусоподобных частиц ВГС, полученных в клетках НЕК293Т, с помощью центрифугирования в градиенте сахарозы. Вестерн-блоттинг ВПЧ десяти фракций, начиная с верхней, в денатурирующем 10% ПААГ с антителами к Кор и Е2 ВГС. Клетки НЕК293Т трансфицированы рекомбинантными ДНК pFastBacMamCElE2-GFP: А - исходная ДНК; Б - ДНК с мутацией в сайте гликозилирования N1 Е2; В - с мутациями во всех сайтах гликозилирования Е2; Фракции 1-10; Маркеры молекулярной массы белков, кДа.
Иммуноблоттинг с антителами к белкам core и Е2 показал, что ВПЧ содержатся во фракциях с плотностью 1.14-1.16 г/см , что может свидетельствовать о присутствии в них фрагментов РНК. 103 РНК клеток насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом Ьу-СЕ1Е2мут анализировали с помощью ОТ-ПЦР. Полученную кДНК амплифицировали методом ПЦР с праймерами к генам структурных белков core и Е2 ВГС (Рис.31 А и Б).
ОТ-ПЦР - анализ вирусной РНК клеток насекомых, инфицированных рекомбинантными бакуловирусами Ьу-СЕ1Е2мутВГС. Электрофоретическая подвижность кДНК в 1% агарозном геле: А - кДНК генов белка Е2 с мутациями в сайтах гликозилирования N1, N8-N1 l(mR) и Nl-Nl 1Q]N) - во всех сайтах гликозилирования для клеток и Nlm, mRm, XNm для среды, полученные с праймерами к нуклеотидной последовательности гена белка кор; Б - с праймерами к нуклеотидной последовательности гена белка Е2; WT и WTm - Е2 дикого типа; КГ - отрицательный контроль (Hsp90) К+ -положительный контроль (pFastBacHTB-CElE2); М - маркеры длины фрагментов ДНК(п.н)
ОТ-ПЦР на суммарной РНК с праймерами к последовательности генов core и Е2 ВГС, выявил фрагменты РНК структурных белков. Аналогичные результаты получены и для клеток НЕК293Т. Т.о., показано, что N-гликаны гликопротеина Е2 ВГС не влияют на синтез РНК структурных белков в клетках насекомых и млекопитающих и, возможно, на включение этих РНК в вирусоподобные частицы.
