Содержание к диссертации
Введение
Обзорлитературы 5
Вирусы с тройным блоком транспортных генов 7
Транспорт вирусов с тройным блоком генов 22
Цитоскелет и транспорт макромолекул. Особенности растительного цитоскелета 26
Цитоскелет и вирусы растений 36
Материалы и методы 43
Результаты 55
Обсуждение результатов 81
Выводы 91
Список литературы 92
- Вирусы с тройным блоком транспортных генов
- Транспорт вирусов с тройным блоком генов
- Цитоскелет и транспорт макромолекул. Особенности растительного цитоскелета
- Цитоскелет и вирусы растений
Введение к работе
В геноме вирусов растений закодированы специальные транспортные белки (ТБ), играющие активную роль в процессе распространения вирусного генома. Используя систему молекулярного транспорта растения-хозяина, ТБ обеспечивают транспорт вирусного генома от места репликации к плазмодесмам, межклеточный транспорт и дальний транспорт по проводящей системе.
Имеющиеся данные о том, что для внутриклеточного транспорта вирусы используют цитоскелет, относятся преимущественно к вирусам животных. В случае вирусов растений участие микротрубочек и актиновых филаментов во внутриклеточном транспорте вирусного генома активно изучается на модели тобамовируса ВТМ. Показано, что ключевую роль в этом процессе играет единственный ТБ ВТМ - ЗОК белок, который с одной стороны взаимодействует с вирусной РНК, а с другой стороны - с компонентами цитоскелета. Данные о взаимодействии вирусных белков или вирионов вирусов растений других групп с цитоскелетом клетки малочисленны, хотя предположение об участии цитоскелета в транспорте вирусных РНП (вирусных частиц) в растениях представляется весьма вероятным.
Объектом настоящей работы является типовой представитель рода Potexvirus - Х-вирус картофеля (ХВК). Транспортная система потексвирусов состоит из трех ТБ (ТБГрІ, ТБГр2 и ТБГрЗ), кодируемых специальным генным модулем - тройным блоком генов. Кроме того, известно, что белок оболочки ХВК является небходимым компонентом транспортной системы и несет специфические транспортные детерминанты. Согласно современным представлениям транспортной формой ХВК является вирион, нитевидная частица со спиральной симметрией, возможно модифицированный ТБГрІ белком (25К белком). Показано, что 25К белок ХВК in vitro способен взаимодействовать с одним из концов нитевидных вирусных частиц (предположительно содержащим 5 -конец геномной РНК), индуцируя конформационные изменения в концевых субъединицах вириона, приводящие к ремоделированию нуклеокапсида ХВК и кооперативной трансляционной разборке вирусных частиц. Учитывая НТФ-азную и РНК-хеликазную активности 25К белка ХВК, можно предположить, что подобное ремоделирование вирионов имеет отношение и к транслокации вирионов ХВК
через плазм одесмы (ПД). Однако взаимодействие вирионов ХВК с 25 К белком до сих пор не было обнаружено in vivo.
Целью данной работы было изучение взаимодействий вириона как предполагаемой транспортной формы Х-вируса картофеля с транспортным 25К белком in vivo и элементами цитоскелета in vitro.
Поскольку распространение вирусов, видимо, является частным случаем транспорта макромолекул в растениях, изучение молекулярных механизмов транслокации вирусного генома представляется актуальным как для решения фундаментальных проблем фитовирусологии и физиологии, так и ддя разработки эффективных способов защиты растений от вирусной инфекции.
Вирусы с тройным блоком транспортных генов
В состав группы вирусов, кодирующих транспортный модуль, состоящий из трех частично перекрывающихся генов (ТБГ), включают представителей сборного семейства Tubiviridae (роды Pomovirns, Pecluvirus, Hordeivirus и Benyvirus) и представителей семейства Potexviridae (роды Potexvirus, Foveavirus, Carlavirus nAllexvirus) (Morozov and Solovyev, 1999). Оба семейства относятся к супергруппе альфа-подобных вирусов. Геном этих вирусов представляет собой одну или несколько (+)онРНК, содержащих кэп-структуру на 5!-конце и поли-А-последовательность и/или тРНК-подобную структуру на З -конце. В нем закодирован консервативный набор белковых доменов, включающий РНК-зависимую РНК-полимеразу, относящуюся к супергруппе 3 (домен ПОЛ), хеликазу, относящуюся к суперсемейству I ДНК-РНК-хеликаз (домен ХЕЛ), и метил/гуанилил-трансферазу (домен MET) (Koonin and Dolja, 1993). Матрицей для экспрессии 5-проксимальных генов является геномная РНК, а для экспрессии 3 -проксимальных генов - субгеномные РНК. ТБГ состоит из трех частично перекрывающихся открытых рамок трансляции (ОРТ). Хотя у разных групп вирусов положение ТБГ в геноме может меняться, три составляющие его ОРТ не меняют своего взаимного расположения и характера кодируемых ими белков, составляя, таким образом, единый независимый транспортный модуль. Для большинства групп вирусов, кодирующих ТБГ, показано, что именно белковые продукты ТБГ, обозначаемые как ТБГрІ, ТБГр2 и ТБГрЗ (Solovyev et al., 1996а), отвечают за транспорт вирусов в растениях (Petty et al., 1990; Beck et al., 1991; Gilmer et al., 1992; Herzog et al, 1998; Solovyev et al., 1999; McGeachy and Barker, 2000; Lawrence and Jackson, 2001a). В семействе Potexviridae наиболее многочисленным и хорошо изученным является род Potexvirids, чьим типичным представителем является Х-вирус картофеля (ХВК).
Его геном представляет собой однонитевую (+)РНК, длиной 6435 нуклеотидов, несущую на 5 -конце кэп-структуру, а на З -конце - полиА последовательность, и кодирующую пять ОРТ (рис. 1). ОРТІ расположена следом за 5 -нетранслируемой областью и транслируется с геномной РНК с образованием 165 кДа белка (рис. 1), содержащего три репликативных домена, характерных для альфа-подобных вирусов: метил/гуанилилтрансферазу (домен МЕТ), НТФазу-хеликазу (домен ХЕЛ) и РНК-зависимую РНК-полимеразу (домен ПОЛ) (Huisman et al., 1988; Morozov et al., 1989; Koonin and Dolja, 1993). Продукт ОРТІ выполняет функцию вирусной репликазы (Longstaff et al., 1993; Davenport and Baulcombe, 1997) ОРТ 1 других представителей Potexviridae (Foveavirus, Carlavirus и Allexvirus) кодирует также и протеиназный домен, расположенный между доменами МЕТ и ХЕЛ, в результате чего продукт ОРТІ способен подвергаться автопротеолитическому процессингу (Jelkmann, 1994; Martelli and Jelkmann, 1998; Meng et al, 1998; Zhang et al, 1998; Morozov and Solovyev, 1999). OPT2, 3 и 4 у всех Potexviridae представляют собой тройной блок генов, кодирующий ТБ (Morozov et al., 1989) с молекулярной массой, соответственно, 25-28 кДа, 11-13 кДа и 7-8 кДа. Их свойства подробно описаны ниже. У представителей рода Allexvirus инициация трансляции ОРТ4 происходит на неканоническом инициаторном кодоне (Kanyuka et al., 1992; Song et al., 1998), что, по-видимому, должно приводить к крайне низкому содержанию белка (ТБГрЗ) в клетке: продукт ОРТ4 до сих пор не был идентифицирован.
Геном Allexvirus имеет дополнительную, следующую после ТБГ ОРТ (ОРТ5), кодирующую белок с молекулярной массой 42 кДа. Функция этого белка не ясна. Продукт следующей ОРТ (ОРТ5 у всех Potexviridae, кроме представителей рода Allexvirus) - белок оболочки (БО), необходимый для ближнего и дальнего транспорта всех представителей Potexviridae (Beck et al., 1991; Forster et al., 1992; Angell et al., 1996; Morozov et al., 1997; Lough et al, 1998; 2000; Santa Cruz et al, 1998; Fedorkin et al, 2000, 2001; Nicolaisen and Nielsen 2001). В геноме представителей Carlavirus и Allexvirus следом за ОРТ БО имеется дополнительная ОРТ, кодирующая цистеин-богатый белок, способный связывать РНК (Rupasov et al, 1989; Kanyuka et al, 1992; Cavileer et al., 1994; Jelkmann 1994; Rohde et al, 1994). Геном семейства Tubiviridae описан на примере рода Hordeivirus (рис. 1), чьим типичным представителем является полулатентный вирус мятлика (ПЛВМ). Геном гордеивирусов состоит из трех молекул РНК длиной от 3800 до 3100 нуклеотидов, обозначаемых как РНКа, РНКР и РНКу. Все три геномных РНК содержат на 5 -конце кэп-структуру, а на 3!-конце - тРНК-подобную структуру, способную акцептировать тирозин, как показано для вируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) и ПСЛВ (Agranovsky et al, 1992; Barker et al, 1983; Savenkov et al, 1998). При этом тРНК-подобная структура отделена от кодирующей области поли-А трактом (Jackson et al, 1989; Agranovsky et al, 1992; Savenkov et al, 1998).
Транспорт вирусов с тройным блоком генов
Транспортной формой вирусов, принадлежащих к семейству Tubiviridae, является специализированный РНП, образованный ТБГрІ белком и вирусной РНК, предназначенный для переноса в соседние клетки. Такие РНП были выделены из тканей, зараженных ВШМЯ (Brakke et al., 1988). Структура транспортной формы вирусов, к принадлежащих к Potexviridae, обсуждается. Согласно имеющимся данным эта структура представляет собой вирион, модифицированный для прохождения через ПД благодаря взаимодействию с ТБГрІ белком (Santa Cruz et al., 1998; Atabekov et al., 2000). Однако существует мнение, что функцию транспортной формы могут выполнять невирионные РНП, в состав которых помимо БО входит ТБГрІ белок (Lough et al., 1998). Роль белка оболочки в транспорте представителей Potexviridae Для ближнего и дальнего транспорта вирусов, входящих в состав семейства Potexviridae, помимо белков ТБГ, необходим белок оболочки (БО). Этот вывод основан на многочисленных экспериментальных данных. Вирусы ХВК и ВМБК с дефектным геном БО были неспособны к ближнему транспорту в растениях (Beck et al., 1991; Chapman et al, 1992; Forster et al., 1992; Oparka et al., 1996; Santa Cruz et al., 1998), причем транспорт дефектного ХВК восстанавливался в растениях, трансгенных по БО ХВК (Oparka et al., 1996). БО ВМБК и БО ХВК в комплексе с РНК транслоцировались из клетки в клетку в присутствии всех белков ТБГ (Lough et al., 1998; Santa Cruz et al., 1998; Lough et al.,2000). В клетках растений, инфицированных потексвирусами, БО локализуется в цитоплазме в виде вирусных частиц и в районе ПД (главным образом в центральной полости) в виде фибриллярного материала, сходного по размеру с вирионами и взаимодействующего с антителами, специфичными к вириону, но не к БО (Oparka et al., 1996; Rouleau et al., 1995; Santa Cruz et al., 1998). Следует отметить, что локализация БО в ПД обусловлена не его собственными свойствами, а некими иными вирусными факторами, так как в растениях, трансгенных по БО ХВК, он не обнаруживался в районе ПД (Oparka et al., 1996). Исходя из вьппеприведенных данных, сделан вывод о том, что вирионы являются транспортной формой потексвирусов.
С другой стороны Lough et al. (1998, 2000), основываясь на факте существования мутантных форм БО ВМБК, образующих вирионы, морфологические неотличимые от дикого типа, но неспособные транспортироваться из клетки в клетку, делают вывод о том, что формирование вирионов не обязательно для вирусного транспорта, или, во всяком случае, эти функции независимы. Возможный механизм транспорта вирусов с тройным блоком генов Основные этапы межклеточного транспорта ТБГ-содержащих вирусов совпадают со стадиями транспорта ВТМ: образование транспортной формы вируса, преремещение её от сайтов репликации вирусного генома к ПД, прохождение через ПД. Однако при детальном рассмотрении этого процесса выделяется множество особенностей и отличий. Поскольку представители Potexviridae не имеют дополнительного N-концевого домена в ТБГрІ белке (характерного для ТБГрІ белков Tubiyiridae) и при этом нуждаются для осуществления межклеточного транспорта в БО, предполагают функциональную эквивалентность N-концевого домена вирусов с ТБГрІ белками класса I (Tubiviridae) и БО вирусов с ТБГрІ белками класса II (Potexviridae). Тогда, исходя из данных Solovyev et al. (1996а) о том, что N-концевой домен ТБГрІ белков Tubiviridae отвечает за взаимодействие с ТБГр2 и ТБГрЗ белками, можно предположить, что и БО Potexviridae способен взаимодействовать с ТБГр2 и ТБГрЗ белками, С учетом этого предположения и вышеизложенных данных, предложена следующая модель транспорта ТБГ-содержащих вирусов. 1) В сайтах репликации вирусного генома, ассоциированных с ЭР, ТБГрІ белки Tubiviridae и ТБГрІ белки вместе с БО Potexviridae образуют комплексы с геномной (+)РНК, видимо, выводя её тем самым из репликативного и трансляционного пула. РНП, образуемые ТБГрІ белком ВШМЯ, и вирионы ХВК неспособны транслироваться. Возможно, на этой стадии необходима способность ТБГрІ белка расплетать вторичные структуры РНК с целью высвобождения геномной РНК из репликативных комплексов и придания ей расправленной, протяженной структуры, необходимой для прохождения через 2) ТБГр1-РНП или ТБГр1-БО-РНП (вирион-ТБГр1)э по-видимому, связываются с ТБГр2 белком (или ТБГр2/ТБГрЗ белковым комплексом), ассоциированным с мембранами ЭР, образующим в мембранах некие кластеры. Это происходит за счет взаимодействия ТБГр2 белка с белками, входящими в состав РНП, а не с РНК. В пользу этого предположения свидетельствуют данными о том, что перенос ТБГрІ белка вирусов семейства Tubiviridae к ПД с помощью ТБГр2 и ТБГрЗ белков осуществляется и в отсутствие вирусной РНК, т.е. белки, видимо, взаимодействуют непосредственно. Предположение, что с транспортной формой вируса связывается первоначально именно ТБГр2 белок, основано на том что для переноса ТБГрІ белка Tubiviridae к ПД необходимо наличие как ТБГр2 белка, так и ТБГрЗ белка.
Однако последний локализован в районе ПД (даже в отсутствие других вирусных белков), в то время как ТБГр2 белок в отсутствие ТБГрЗ белка рассредоточен по мембранам ЭР, т. е. в непосредственной близости от сайтов репликации вирусного генома и образования транспортного РНП. 3) Гипотетической, но, возможно, решающей стадией является накопление в клетке ТБГрЗ белка, который, локализуясь в ПД, "включает" особый путь внутриклеточной транслокации мембранных белков к периферии клетки. Это может обеспечивать, например, сигнал сегрегации таких белков в почкующиеся транспортные везикулы аппарата Гольджи. Возможно, в результате такого «включения» индуцируется транспортировка белков по мембранам ЭР (без отпочковывания в виде везикул) к специфическим субдоменам ЭР, расположенным у клеточной стенки, таким как десмотрубочки ПД или к другим субдоменам ЭР, образование которых индуцировано белком ТБГрЗ. Последнее наиболее вероятно, так как ТБГрЗ белок индуцирует усиленную пролиферацию кортикальных отделов ЭР в клетках. Роль ТБГрЗ белка как своеобразного триггера, не взаимодействующего напрямую с другими ТБ, подтверждается, во-первых, неспецифичностью его действия (он способен перенацеливать в сайты своей локализации не только гетерологичные ТБГр2 белки, но и несходные с ними по последовательности ТБ других вирусов), во-вторых, его гораздо меньшей консервативностью по сравнению с ТБГрІ и ТБГр2 белками и, в-третьих, ничтожно малым количеством этого белка в инфецированной клетке, обусловленным способом его экспрессии. Lough et al. (1998, 2000, 2001) предполагают, что лимитирующим фактором для транспорта вируса является не накопление в клетке вирионов, а наличие всех трех ТБ, БО и геномной вРНК. В данном случае ТБГрЗ белок, в силу своей низкой концентрации (в отличие от остальных необходимых компонентов) может служить сигналом к началу транспорта.
Цитоскелет и транспорт макромолекул. Особенности растительного цитоскелета
Актиновые филаменты на электронных микрофотографиях видны как однородные нити толщиной около 8 нм. Такая нить представляет собой плотную спираль, собранную из однотипно ориентированных мономеров актина. Причем концы этой нити различны, т.к. она обладает полярностью. В сильно разбавленном солевом растворе актиновые филаменты диссоциируют на глобулярные субъединицы. Каждая субъединица представляет собой одну полипептидную цепь дщиной в 375 аминокислотных остатков, с которой нековалентно связана одна молекула АТФ. Такой актин называют глобулярным или G-актином. При полимеризации актина связанный АТФ гидролизуется, образуются филаменты, называемые фибриллярным актином (F-актином). In vitro молекулы актина способны полимеризоваться в присутствии АТФ. Полимеризация актина развивается нелинейно - в начале наблюдается лаг-фаза, отражающая стадию нуклеации. Этот этап самый медленный, т.к. на нем три молекулы актина должны соединиться в определенной конформации. Дальнейшее присоединение молекул актина к концам филамента происходит быстро.
Процесс сборки обратим, в определенный момент времени концентрация мономеров падает до уровня, при котором скорости ассоциации и диссоциации мономеров являются равными (критическая концентрация). Из-за полярности актиновых филаментов кинетика полимеризации на + и — концах различна (на + конце в 5-10 раз быстрее). Так как критические концентрации для + и - концов различны, то существует такой диапазон концентраций, при котором будет происходить постоянный рост филамента на + конце и деполимеризация на - конце (процесс получил название тредмиллинг, мономеры непрерывно двигаются вдоль по полимеру). В клетке процесс нуклеации и полимеризации/деполимеризации актина регулируется различными актин-связывающими белками. Таким образом, определяется местоположение и длина актиновых филаментов. Во многих эукариотических клетках актин содержится в больших количествах, составляя до 5% от общей массы белка клетки. Он распределен по всей цитоплазме или формирует густую сеть из актиновых филаментов и ассоциированных с ними белков под плазматической мембраной. Эта сеть образует клеточный кортекс, который придает механическую прочность поверхностному слою клетки, а так же позволяет животным клеткам изменять форму и двигаться. В растительных клетках основную роль в поддержании механической прочности играет клеточная стенка. Именно из-за наличия клеточной стенки прямые взаимодействия между растительными клетками организованы иначе чем между клетками животных. Если у животных и грибов основные взаимодействия между клетками осуществляются через плотные контакты и септальные поры, то у растений существуют специальные структуры, по которым осуществляется транспорт веществ из цитоплазмы одной клетки в цитоплазму соседней, - ПД (Lucas, 1999; Aaziz R., 2001). Транспорт через ПД может быть направленным и ненаправленным (т.е. путем простой диффузии для низкомолекулярных веществ).
Направленный транспорт обеспечивает избирательность и для него необходимо взаимодействие между эндогенными и экзогенными (например, вирусными) факторами. На основе электронно-микроскопических исследований ультраструктуры ПД был сделан вывод, что простые ПД представляют собой коаксиальный мембранный тяж (диаметром 50 нм в клетках мезофилла), пронизывающий клеточную стенку. Внешняя мембрана этого тяжа является непрерывным продолжением плазматической мембраны, в то время как центральный трубчатый мембранный компонент (десмотрубочка) - это производное ЭР (рис.4). Десмотрубочка непрерывно связана с кортикальным эндоплазматическим ретикулумом. Вдоль полости между плазматической мембраной клетки и десмотрубочкой, по-видимому, и осуществляется транспорт. На внешней поверхности десмотрубочки и внутри на плазматической мембране тяжа находятся белковые глобулы. Компоненты ПД и их взаимодействия изучены недостаточно. В ПД были локализованы актин и миозин (Chaffey et al., 2002; Heinlein, 2002b; Blackmail et al., 2001), а так же некоторые другие белки (например, центрин и кальретикулин, соответственно кальций-связывающий и кальций секвестрирующий белки, а так же кальций-зависимая протеинкиназа) (Crawford and Zambryski, 2000). Цитоскелет, по-видимому, играет важную структурную роль в организации ПД. Обсуждается и регуляторная роль цитоскелета в процессе макромолекулярного транспорта через ПД. Известен ряд абиотических и биотических факторов, влияющих на предельную пропускную способность плазмодесм (ППСП). ППСП уменьшается в присутствии высоких концентраций кальция (в результате инъекций или резкого охлаждения, которое приводит к выбросу Са в цитоплазму). Таким образом, кальций-зависимые белки (напр., миозин), ассоциированные с цитоскелетом в ПД, могут иметь регуляторную функцию. Важность актин-миозинового комплекса в изменении ППСП подтверждается наблюдениями, показывающими, что в результате обработки клеток цитохалазином D или при микроинъекции профилина (актин-связывающего белка, вызывающего деполимеризацию микрофиламентов), ППСП в клетках мезофилла табака увеличивается (Aaziz, 2001). Наоборот стабилизация микрофиламентов фаллоидином или добавлением в клетку негидролизуемого аналога АТФ приводит к резкому уменьшению ППСП. Микротрубочки - полые тубулярные полимерные структуры, состоящие из гетеродимеров тубулина В состав димера входят два родственных глобулярных белка: а- и Р-тубулин, длиной около 450 аминокислот каждый. Мономер тубулина представляет собой компактную элипсоидную структуру (46х 40х 65 А), в которой можно выделить три домена: N-концевой нуклеотид-связывающий, промежуточный домен в центре и С-концевой район, в основном состоящий из а-спиралей (Nogales et al, 1999). В ходе сборки микротрубочек (МТ) молекулы тубулина образуют линейные протофиламенты, в которых а-тубулин одного димера контактирует с Р-тубулином следующего (Nogales et al., 1999). В целой. МТ 13 таких протофиламентов уложены бок о бок друг с другом. Таким образом, в процессе полимеризации участвуют два вида взаимодействий: связывание димеров голова к хвосту (в результате образуются протофиламенты) и боковые взаимодействия между параллельными протофиламентами. Так как все протофиламенты уложены параллельно и имеют одинаковую ориентацию, МТ, подобно актиновым филаментам являются полярными структурами. Используя последние данные ренгено-структурного анализа , и полученную кристаллическую структуру тубулина, в группе Nogales в 1999 году составили карту МТ с высоким разрешением, по которой четко определили, что плюс
Цитоскелет и вирусы растений
Колокализация вирусных частиц или белков с цитоскелетом впервые была обнаружена в процессе электронно-микроскопических исследований. Так, в 1979 году была обнаружена колоколизация частиц полиовируса с сетью филаментов в инфицированных клетках (Lenk and Pelman, 1979). В 1987 году методом иммуноэлектронной микроскопии (с помощью технологии сорбированной на металлических сетках культуры клеток) было показано, что частицы вируса Голубого Языка локализуются на промежуточных филаментах и МТ в инфицированных клетках (Eaton et al., 1987). Так же с помощью иммуноэлектронной микроскопии была обнаружена колокализация с МТ таких вирусов как SV40 (Ben-ze ev et al, 1982 ), вирус герпеса (Ben-ze ev et al., 1983), вирус кори (Bohn et al, 1986).
Сегодня для многих животных вирусов установлено взаимодействие с элементами цитоскелета. Так, нуклеопротеидный и матриксный белки вируса гриппа, связываются, преимущественно с микрофиламентами (Avalos et al., 1997). Rev белок вируса иммуннодефицита HIV-1 человека способен деполимеризовать МТ in vitro, что согласуется с данными о том, что МТ разрушаются в результате вирусной инфекции (Watts et al., 2000). Возможным объяснением цитопатического эффекта вируса везикулярного стоматита может быть взаимодействие его матриксного белка с тубулином и МТ (Melki et al., 1994).
Учитывая роль элементов цитоскелета, и в особенности МТ, в создании ускоренного направленного движения макромолекулярных комплексов и мРНК в цитоплазме, предположили их участие во внутриклеточном и межклеточном транспорте аналогичных вирусных комплексов (Ploubidou, 2001). Для некоторых вирусов животных действительно была показана роль клеточных транспортных структур в распространении вируса внутри и между клетками. Так, установлено, что МТ необходимы для транспорта вируса осповакцины к клеточной поверхности (Hollmshead et al., 2001). Необходимость МТ, а также моторных белков, показана для перемещения аденовируса от ядра к периферии клетки и в обратном направлении (Suomalainen et al., 1999).
Взаимодействие с цитоскелетом описано также и для некоторых вирусов растений. В 1974 при помощи электронной микроскопии ультратонких срезов была показана ассоциация вирионов вируса штриховатой мозаики ячменя с МТ веретена деления, В инфицированных клетках на стадии митоза или мейоза вирионы располагались перпендикулярно к МТ (Mayhew, Carroll, 1974). В работе Karasev et al. (1992) описано взаимодействие 65К белка (родственого семейству белков теплового шока Hsp70) вируса желтухи свеклы (ВЖС) с очищенными МТ in vitro. Была показана специфичность этого взаимодействия -оно отсутствовало, если МТ обрабатывали субтилизином (фермент, отщепляющий экспанированный на поверхности МТ С-концевой фрагмент тубулина). Первые сведения о взаимодействии с цитоскелетом другого растительного вируса - ВТМ - были опубликованы в работах Heinlein et al. и McLean et al. в 1995 году. В протопластах, инфицированных диким типом ВТМ или модифицированным вирусом, кодирующим химерный ТБ — 30K.GFP, белки 30К (ТБ) или 30K:GFP были ассоциировании с кортикальными МТ. Для 30K;GFP так же отмечена локализация в точечных тельцах на периферии клеток листьев, инфицированных модифицированным вирусом (McLean et al.,1995, Heinlein et al.,1995). Кроме того, для ТБ ВТМ показана возможность напрямую взаимодействовать с тубулином и актином in vitro (McLean et al.,1995).
Позднее было обнаружено, что распределение ТБ ВТМ в протопластах непосредственно зависит от состояния МТ (Mas and Beachy, 2000). Охлаждение протопластов до +4С вызывало деполимеризацию МТ, при этом изменялась и локализация 30K:GFP, который обнаруживался в основном в перинуклеарном пространстве и тельцах включения. После восстановления нормальной температуры (25С) и восстановления МТ, 30K:GFP распределялся в клетке в виде длинных тяжей, а также на периферии (как и до охлаждения). При совмещении изображений флуоресцентно-меченных МТ и ТБ они полностью совпадали. Следует отметить, что аналогичный результат (совпадение изображений 30K:GFP и окрашенных флуоресцентными антителами МТ) был получен и на эпидермальных клетках инфицированного растения (Boyko et al., 2000с). На поздних стадиях обработка холодом не влияла на расположение 30K:GFP, который в любом случае располагался в основном в районе ПД. С помощью комбинации методов иммуно-цитохимического окрашивания и in situ гибридизации на протопластах было обнаружено, что вирусная РНК (вРНК) также локализуется на МТ совместно с ТБ ВТМ (Mas, Beachy,1999). Причем, эксперименты с мутантной формой ТБ (TAD5, Kahn et al., 1998), не взаимодействующей с МТ, но способной связываться с РНК, показали, что вРНК локализуется на МТ только в комлексе с ТБ (Mas and Beachy, 2000). Таким образом, было продемонстрировано взаимодействие с МТ транспортной формы ВТМ (комплекс вРНК-ТБ).
В работе Boyko et al., 2000с было исследовано функциональное значение таких взаимодействий с помощью штаммов ВТМ, экспрессирующих мутантные ТБ с делениями на N- и С-концах, сшитые с GFP. Благодаря экспериментам с мутантными формами ТБ удалось показать прямую корреляцию между способностью ТБ ВТМ взаимодействовать с МТ и транспортировать вРНК из клетки в клетку (Boyko et al., 2000с). Другая работа Boyko et al. (2002) посвящена исследованию локализации двух мутантов ТБ ВТМ. Один из них содержал точечную мутацию и был дефектным по транспорту, а в другой были введены еще две замены, компенсирующие первую. Дефектная форма белка не имела никакой четкой картины локализации в клетке, в то время как для функционального тройного мутанта она совпадала с таковой для белка дикого типа. Это доказывает важность четкой внутриклеточной локализации ТБ, ее связь с функциональной активностью белка.
Интересный результат был получен при заражении ВТМ 30K:GFP листьев трансгенных растений, экспрессирующих делеционный мутант N-конца ЗОК, дефектный по транспортной функции. Оказалось, что распространение вируса в таких листьях ограничено. Причем ассоциация 30K:GFP с МТ также не наблюдалась (Kotlizky et al., 2001). И хотя 30K:GFP локализовался в ПД в таких растениях, он по большей части был лишен возможности транспортироваться. Т.е. и в этом случае была выявлена корреляция между способностью ТБ ВТМ взаимодействовать с МТ и обеспечивать транспорт вирусного генома из клетки в клетку.
