Введение к работе
Актуальность проблемы.
Транспорт вирусной инфекции в зараженном растении является одной из наиболее интенсивно изучаемых проблем современной фитовирусологии
В момент заражения растения вирусом только небольшое количество клеток оказывается инфицированными Для развития инфекции необходимо перемещение вируса от зараженных клеток в здоровые Межклеточный транспорт фитовирусов является активным процессом, происходит через ппазмодесмы и для него необходимы кодируемые вирусом транспортные белки (ТБ) (Atabekov & Dorokhov, 1984, Atabekov & Taliansky, 1990)
Объект нашего исследования - X вирус картофеля (ХВК) - типичный представитель рода Potexvirus семейства Flexivmdae, содержащий геномную одноцепочечную «плюс» РНК
В литературе были предложены две модели транспортной формы при межклеточной транслокации генома потексвирусов нативные вирионы (Oparka ef al, 1996, Santa Cruz ef al, 1998) или комплексы невирионного типа, состоящие из вирусной РНК, белка оболочки (БО) и транспортного белка (ТБ1) (Lough et al, 1998, 2000) При изучении транспортной формы вируса Lough ef al (1998) инкубировали вирусную РНК с БО и ТБ1 и использовали смесь для микроиньекций Однако структура таких комплексов, используемых в опытах, изучена не была
Независимо от структуры транспортной формы, вирусная РНК в ее составе должна исключается из процессов репликации и трансляции и вновь становится доступной для рибосом в процессе развития инфекции
Ранее в нашей лаборатории было показано, что в отличие от ряда вирусов, РНК ХВК в составе вириона недоступна для рибосом Но она становится доступной в результате 1) фосфорилирования N- концевого полипептида БО вируса in situ протеинкиназами серинового типа или 2) при взаимодействи ХВК с ТБ1 (Atabekov et al, 2000, 2001, Rodionova ef al, 2003,)
Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы было изучение структуры рибонуклеопротеидов, собранных in vitro из РНК, БО и ТБ1 (возможной транспортной формы потексвирусов), а также выяснение возможности трансляционной активации РНК ХВК в составе тройных комплексов РНК-БО-ТБ1 В процессе работы решались следующие задачи
1 Анализ условий образования, порядка сборки и структуры рибонуклеопротеидных комплексов РНК-БО-ТБ1 ХВК
-
Изучение возможности подавления трансляции РНК в составе вирусного рибонуклеопротеида (вРНП) и перехода во вновь транслируемую форму путем фосфорилирования БО в составе вРНП или при образовании комплекса ВРНП-ТБ1
-
Исследование роли N-концевого полипептида БО ХВК при подавлении и активации трансляции инкапсидированной РНК в составе вРНП
Научная новизна и практическая ценность работы.
Показано, что при наличии в растворе ТБ1, РНК и БО ХВК, независимо от молярного соотношения и последовательности добавления компонентов, прежде всего образуется вРНП комплекс, состоящий из РНК и БО, имеющий спиральную «головку», идентичную по своей структуре белковой спирали вирионов ХВК и «хвост» - РНК, свободную от БО («однохвостые» частицы) И только затем ТБ1 взаимодействует с частично реконструированным вирусом, присоединяясь к концу спиральной «головки» «однохвостых» частиц, соответствующему 5'-концу РНК
В результате проведенных экспериментов при инкубации РНК, БО и ТБ1 ХВК рибонуклеопротеидов невирионной природы обнаружено не было
Показано, что РНК в составе вРНП, так же как и в составе вириона может исключаться из процесса трансляции, и вновь трансляционно активироваться путем фосфорилирования БО в составе вРНП или при взаимодействии вРНП с ТБ1
Вероятно, две модели транспортной формы не противоречат друг другу РНК ХВК может транспортироваться в виде частично (вРНП - «однохвостые» частицы) или полностью одетого вириона
Показана роль N-концевого полипептида БО ХВК как регулятора трансляции РНК в составе вРНП
Результаты работы могут быть использованы в практике научных исследований в области молекулярной биологии и вирусологии Материалы работы используются при чтении курсов лекций на Биологическом факультете МГУ имени М В Ломоносова
Апробация работы.
Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Международной конференции «Ломоносов» (Москва, 2005, 2007), 30-м конгрессе Федерации европейского биохимического общества (Будапешт, 2005), Международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (Москва,
2005), Заседании общества «In Vitro Biology» (Миннеаполис, 2006), 32-м конгрессе Федерации европейского биохимического общества (Венна, 2007), 10-м Симпозиуме по эпидемиологии вирусов растений (Хайдарабад, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008)
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ
Структура работы
Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы»
