Введение к работе
Актуальность проблемы.
Транспорт вирусной инфекции в зараженном растении является одной из наиболее интенсивно изучаемых проблем современной фитовирусологии. Процесс межклеточной транслокации вирусного генома представляет собой частный случай общей физиологической функции транспорта макромолекул в растениях
В момент заражения растения вирусом только небольшое количество клеток оказывается инфицированными. Для развития инфекции необходимо перемещение вируса от зараженных клеток к здоровым. Ранее считалось, что межклеточный транспорт вирусов -процесс пассивный, теперь совершенно очевидно, что в нем играют важнейшую роль специфические вирусные транспортные белки (ТБ). Они обеспечивают как внутриклеточный транспорт вирусного генома от места репликации к плазмодесмам, так и его межклеточный транспорт из зараженной клетки в соседние здоровые..
Объектом нашего исследования являлся X вирус картофеля (ХВК) - типовой представитель рода Potexvirus, содержащий геномную одноцепочечную «плюс» РНК.
Предложены две модели транспорта потексвирусов из клетки в клетку через плазмодесмы: а) перемещение генома в составе вириона (Chapman et al., 1992; Oparka et a/., 1996;.Santa Cruz et a/., 1998), либо 6) транспорт генома вируса в составе рибонуклеопротеида, содержащего РНК, белок оболочки (БО) и транспортный белок 1 (ТБ1) (Lough et al, 1998, 2000) В составе транспортной формы РНК должна исключаться из процессов трансляции/репликации и становиться вновь доступной для рибосом при проникновении в здоровую клетку
Ранее в нашей лаборатории было показано, что РНК ХВК, в отличие от РНК вируса табачной мозаики (ВТМ, Tobamovirus), не способна транслироваться in vitro в составе вирусных частиц, но может быть трансляционно активирована двумя разными способами: (і) в результате фосфорилирования белка оболочки ХВК in situ или (іі) в результате взаимодействия вируса с транспортным белком 1 (ТБ1) (Atabekov et al., 2000, 2001).
РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С. Петербург '
Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы было дальнейшее изучение механизмов конверсии в транслируемую форму вирусной РНК в составе нетранслируемых вирионов ХВК. В ' процессе работы решались следующие задачи:
-
Исследование условий конверсии вирионной РНК ХВК в транслируемую форму при взаимодействии транспортного белка 1 (ТБ1) ХВК с вирусной частицей.
-
Изучение условий образования и структуры комплекса ТБ1-ХВК с помощью электронной и атомно-силовой микроскопии.
3. Исследование роли 5'-концевой области в сборке in vitro тройных комплексов (РНК-БО-ТБ1 ХВК) и изучение их способности к трансляционной активации.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Впервые показано, что РНК в составе комплекса ТБ1-ХВК становится доступной для рибосом не путем котрансляционного раздевания (характерного для ряда фитовирусов), а в результате быстрой и кооперативной разборки нуклеокапсида, индуцируемой рибосомами на начальном этапе трансляции РНК ХВК.
Передача индуцированного транспортным белком сигнала линейной дестабилизации вдоль полярно ориентированного спирального нуклеокапсида, приводящего к кооперативной трансляционной разборке частиц ХВК, представляет собой неизвестный до сих пор способ регуляции трансляции вирусных РНК.
Методами иммуноэлектронной (ИЭМ) и атомно-силовой микроскопии (АСМ) обнаружено, что РНК-белковое взаимодействие не является определяющим фактором в формировании комплекса ТБ1-ХВК. Значительную роль в этом процессе играют белок-белковые взаимодействия. Образование этого комплекса сопровождается конверсией вирионов ХВК в транслируемую форму и является процессом обратимым и АТФ-независимым.
Показано, что в условиях реконструкции in vitro тройных комплексов РНК-БО-ТБ1 образуются промежуточные «хвостатые» частицы, содержащие спирально упакованные субъединицы на 5'-конце
РНК ХВК; в составе «хвостатых» частиц молекулы ТБ1 ХВК селективно взаимодействуют с субъединицами БО.
Результаты работы могут быть использованы в практике научных исследований в области молекулярной биологии и вирусологии Материалы работы используются при чтении курсов лекций на Биологическом факультете МГУ им М.В.Ломоносова.
Апробация работы.
Материалы диссертации долкладывались и обсуждались на XI международном конгрессе «Molecular Plant-Microbe Interactions» (Санкт-Петербург, 2003).; XII Международном вирусологическом конгрессе (Париж, 2002); XIII конгрессе Федерации европейских обществ физиологов растений (Греция, 2002), конференции "Использование достижений современной биотехнологической науки при разработке технологий в агрономии, зоотехнии и ветеринарии" (Брянск, 2002); Международном симпозиуме «Сигнальные системы растительной клетки» (Москва, 2001)
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ.
Структура работы.
Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы».
