Введение к работе
Актуальность проблемы
РНК-интерференция (РНКи) представляет собой подавление экспрессии с помощью коротких РНК. Феномен РНКи был обнаружен в опытах на нематоде в 1998 году. Последующие исследования показали, что короткие РНК вовлечены в регуляцию экспрессии у большинства эукариот. Без понимания процесса РНКи невозможна сколько-нибудь полная картина регуляции генов. Например, у человека по некоторым оценкам каждый третий ген регулируется с помощью РНКи. В медицине РНКи может использоваться для создания противовирусных препаратов и высокоспецифичиой терапии ряда заболеваний. Изучение нарушений процессов РНКи, наблюдаемых во многих раковых заболеваниях, предоставляет удобный инструмент для распознавания типов опухолей и позволяет полнее понять механизмы канцерогенеза. В лабораторной практике РНКи широко используется для высокоспецифичного «нокдауна» генов, что позволяет, в частности, проводить систематичное определение их функций. За последние 11 лет выявлены основные механизмы РНКи, обнаружены разные типы коротких РНК и специфичные для этого процесса группы белков.
В основе механизма РНКи лежит функционирование репрессивных эффекторных комплексов RISC (RNA induced silencing complex), каждый из которых содержит короткую РНК, направляющую комплекс для сайленсинга комплементарных мишеней. К настоящему моменту у животных выделяют три основных класса репрессивных коротких РНК: siRNA (short interfering RNA), raiRNA (microRNA) и piRNA (PIWI interacting RNA). siRNA принимают участие в защите клетки от вирусов и, как недавно обнаружено в опытах на дрозофиле и мышах, могут защищать организм от транспозиций мобильных элементов в соматических тканях (endo-siRNA). miRNA являются широко распространённым регулятором экспрессии собственных генов организма и необходимы для процессов развития, дифференцировки и поддержания внутриклеточного гомеостаза. piRNA функционируют в составе эволюционно консервативной системы, направленной на репрессию мобильных элементов в терминальных тканях многоклеточных животных, а нарушение их функции приводит к транспозиционному взрыву и, как следствие, к утрате плодовитости.
Короткие РНК различаются не только функционально, но и по механизму образования. При заражении клетки РНК-вирусами может образовываться двухцепочечная РНК (дцРНК), из которой клеточная эндорибонуклеаза Dicer (от английского dice - резать на мелкие кусочки), относящейся к семейству РНКазШ, вырезает siRNA. siRNA также
вырезаются из введённой в клетку искусственно синтезированной дцРНК. miRNA вырезаются из закодированных в геноме РНК-предшественников в результате двух последовательных стадий процессинга, осуществляемых РНКазамиШ Drosha и Dicer. Длина piRNA больше (25-30 нт.), чем длина siRNA и miRNA (21-23 нт.). Механизм образования piRNA является в настоящий момент предметом активного изучения и, по-видимому, сильно отличается от механизма биогенеза siRNA и miRNA. Например, показано, что Dicer не принимает участия в образовании piRNA.
Образующиеся короткие РНК включаются в состав RISC, причём обычно каждому типу коротких РНК соответствует свой специализированный RISC. Ключевым компонентом этого комплекса является белок Argonaute (Ago), который специфично связывает короткую РНК. Семейство белков Ago включает подсемейство собственно Ago и подсемейство PIWI. siRNA и miRNA связываются белками Ago подсемейства. Если siRNA или miRNA, находящиеся в составе RISC, полностью комплементарны РНК-мишени, то Ago производит эндонуклеазное расщепление мишени, а при неполной комплементарности происходит подавление трансляции. В некоторых случаях, работающие в ядре эффекторные комплексы, могут связываться с новообразованными транскриптами и вызывать гетерохроматинизацию прилегающего хроматина. В настоящий момент не ясно, чем предопределяется выбор между транскрипционным сайленсингом или деградацией транскриптов в ядре и почему клетке «удобнее» использовать тот или иной механизм.
piRNA связываются белками подсемейства PIWI и механизм подавления экспрессии в этом случае изучен менее полно, чем для siRNA или miRNA. Существующие скудные данные указывают как на возможность деградации мРНК мобильных элементов, так и на возможность их транскрипционного сайленсинга. Белки подсемейства PIWI у дрозофилы (Aub, Ago3 и Piwi) и крысы (Riwi) обладают эндонуклеазной активностью. В яичниках и семенниках дрозофилы белки Aub и Ago3 локализуются преимущественно в перинуклеарных гранулах (структура, называемая «nuage», от франц. «облако»), что предполагает скорее посттранскрипционный механизм сайленсинга. С другой стороны, в яичниках дрозофилы белок Piwi локализуется в ядрах. Мутация в гене spn-E, который необходим для образования и/или стабилизации piRNA, приводит к «открыванию» хроматина мобильных элементов. В семенниках мышей показана роль piRNA в метилировании ДНК мобильных элементов. Таким образом, потенциально piRNA могут подавлять экспрессию как с помощью деградации мРНК, так и на транскрипционном уровне, посредством эпигенетических модификаций, но вклад каждого из этих механизмов в сайленсинг мобильных элементов не ясен.
piRNA впервые были обнаружены в Лаборатории биохимической генетики животных Института молекулярной генетики РАН при изучении системы подавления экспрессии семенник-специфичных повторяющихся генов Stellate (Aravin et al. 2001; Aravin et al. 2004). Эти piRNA продуцируются повторами Su(Ste) (Suppressor of Stellate), которые расположены на Y-хромосоме и имеют 90% гомологии с генами Stellate, которые расположены на X-хромосоме и кодируют белок Stellate, гомологичный регуляторной р субъединице казеин киназы 2. piRNA Su(Ste) связываются белком Aub. Делеция повторов Su(Ste) или мутация в гене aub ведёт к исчезновению piRNA Su(Ste) в семенниках и значительному увеличению количества мРНК Stellate, что вызывает накопление белка Stellate в кристаллах, приводя к нарушению сперматогенеза и стерильности самцов. Было показано, что комплекс piRNA Su(Ste) и белка Aub способен деградировать мРНК Stellate in vitro (Nishida et al. 2007). Данная работа посвящена изучению Su(Ste) piRNA-зависимого механизма подавления экспрессии генов Stellate in vivo.
Цели и задачи работы
Целью настоящей работы являлось исследование особенностей механизма подавления экспрессии генов Stellate с помощью piRNA Su(Ste). Были поставлены следующие задачи:
Оценить вклад транскрипционного и посттранскрипционного сайленсинга в Su(Ste) piRNA-зависимую репрессию генов Stellate. Для этого следовало сравнить степень увеличения количества сплайсированных и несплайсированных транскриптов Stellate в семенниках дрозофилы при делеции повторов Su(Ste) или мутации в гене aub. Обнаружение сопоставимого возрастания количества сплайсированных и несплайсированных транскриптов будет свидетельствовать о транскрипционной регуляции, а возрастание только уровня сплайсированных транскриптов укажет на посттранскрипционную регуляцию экспрессии генов Stellate;
Разработать способ раздельной детекции транскриптов эу- и гетерохроматиновых генов Stellate и сравнить механизм их репрессии с помощью piRNA Su(Ste);
Определить, происходит ли деградация транскриптов Stellate в ядрах терминальных клеток семенников;
4. Сравнить особенности piRNA- и siRNA-зависимого подавления экспрессии
репортёрной конструкции Ste-lacZ.
Научная новизна результатов исследования
Показано, что piRNA Su(Ste) подавляют экспрессию генов Stellate в основном с помощью деградации мРНК, происходящей не только в цитоплазме, но и в ядрах
сперм ато цитов. Экспрессия эу- и гетерохроматиновых генов Stellate подавляется примерно в равной степени, что указывает на отсутствие влияния структуры хроматина на piRNA-зависимую регуляцию. Обнаружено сходство механизмов piRNA- и siRNA-зависимой репрессии репортёрной конструкции Ste-lacZ. Полученные данные позволяют предположить, что piRNA, подобно siRNA, вызывают деградацию только немаскированных трансляционно активных транскриптов.
Практическая ценность работы
Полученные данные позволяют прояснить особенности механизма подавления экспрессии с помощью эволюционно консервативной системы РНКи у дрозофилы, что может быть использовано в изучении процессов жизнедеятельности терминальных клеток человека, в регуляции которых РНКи играет существенную роль.
Апробация работы
Работа апробирована на лабораторном семинаре в отделе молекулярной генетики клетки ИМГ РАН. Данные, представленные в работе, докладывались на конференции, посвященной механизмам РНК-интерференции (Keystone Symposia, США, 2005), на конференциях для молодых учёных (Пущино, 2005, 2006; Киев, 2007), на конкурсе работ молодых учёных на соискание стипендий фонда «Будущее молекулярной генетики» (Москва, 2008).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ. Из них научных статей 3 и тезисов научных конференций 4.
Структура и объём диссертации
Диссертационная работа изложена на 109 страницах машинописного текста и содержит главы: общая характеристика работы, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы, список литературы. Диссертация содержит 19 рисунков, 1 таблицу и 230 литературных ссылок.
