Содержание к диссертации
Оглавление 2
Введение , 5
Список использованных сокращений 7
Обзор литературы 9
Часть I. Аппарат транскрипции у эукариот 9
Глава 1.1. Транскрипция у эукариот, РНК-полимеразы 9
Глава 1.2. РНК-полимераза II 11
Глава 1.3. Области контроля транскрипции (TCR) 12
Промотор , , .„12
ТАТА-элемент. 13
Инициатор , 13
DPE 13
BRE 14
CpG-остроеки 14
Глава 1.3. Проксимальные и дистальные элементы,
энхансеры 16
Глава 1.5. LCR, MAR 18
Глава 1.6. Инициация транскрипции РНК-полимеразой II 19
Часть II. Факторы транскрипции 22
Глава 2.1. Компоненты транскрипционного аппарата 22
Глава 2.2. Общие факторы транскрипции (GTF) 24
ТЕР 24
TFIIB:.^..C 27
TFIIF. 27
TFIIHuTFIIE 27
Глава 2.2. Активаторы и репрессоры 28
ДНК-сеязывающие домены активаторов (DBD) 31
Домены активации и репрессии 31
Глава 2.4. Корегуляторы .....32
TF11D 34
TAF. 35
USA 39
Медиатор 40
Глава 2.5. Посттранскрипционные события 42
Часть III. Разнообразие мобильных элементов 43
Глава 3.1. Краткая характеристика и классификация
мобильных элементов 43
Глава 3.2. ДНК-транспозоны или мобильные элементы
класса II 44
IS прокариот 45
ДНК-транспозоны. . 45
Глава 3.3. Общая характеристика ретроэлементов 46
Глава 3.4. Ретроэлементы, не содержащие LTR 48
Ретроинтроны. 48
Группа LINE 49
SINE-элементы 51
Псевдогены 54
Процессированиые псевдогены 54
Псевдогены, возникшие при дупликации геномной ДНК. 56
Судьба псевдогеиов 56
Экспериментальная часть 58
Объект и задачи исследования 58
Гены enhancer of yellow 58
Общее описание 58
Белок Enhancer of 'yellow 2 (Е(у)2) 60
Влияние мутации e(y)T! на транскрипцию 61
Белок Е(у)2 эволюционно консервативен 61
Активация транскрипции in vitro и взаимодействие с хроматином 61
Е(у)2 входит в состав белкового комплекса и взаимодействует с
белками-компонентами комплекса TFIID 62
Цели работы 63
Материалы и методы 64
Реактивы 64
Работа с Drosophila melanogaster 64
Программное обеспечение, базы данных 64
Работа с ДНК 65
Приготовление компетентных клеток и трансформация. Выделение плазмидной ДНК, Рестрикция, лигирование,
переосаждение ДНК, гель-электрофорез.. 65
ПЦР. 65
Секвенирование ДНК 66
Введение радиоактивной метки в ДНК-зонд 66
Клонирование гена е(у)2Р 66
Работа с РНК 67
Выделение тотальной РНК 67
Очистка поли(А) РНК 67
Получение кДНК, обратный ПЦР. 67
Нозерн-блот-анализ 68
Работа с белками 68
Экспрессия и очистка рекомбшшнтных белков ,68
Получение антител и их очистка 69
Белковый гель-электрофорез..,.. 69
Иммуноблоттинг (вестерн-блот-анализ) 70
Дот-блот 70
Выделение эмбрионального ядерного экстракта 70
Выделение белкового экстракта из семенников, 71
Детекция активности р-галактозидазы 71
Результаты 71
Геномная характеристика е(у)2Р 71
Поиск белков Drosophila melanogaster, гомологичных Е(у)2 71
Клонирование и структура е(у)2Р. 72
Анализ экспрессии е(у)2Р у Drosophila melanogaster 72
Нозерн развития 72
Нозерн-блот-анализ тканей 73
Экспрессия е(у)2Р в тестисах 74
Экспрессия е(у)2Р под контролем промотора гена Su(Hw) 77
Для того, чтобы проверить, являются ли функции белков Е(у)2Р и Е(у)2 идентичными, была создана конструкция, в которой кДНК е(у)2Р находится под контролем конститутивного промотора гена Su(Hw) и получена траисгенная линия мух, несущая данную
конструкцию 77
Анализ прилегающих областей гена е(у)2Р D. melanogaster 78
Анализ гомологов е(у)2 79
е(у)2 в различных организмах 79
Гены е(у)2, е(у)2Р у Drosophila pseudoobscura и Drosophila
melanogaster 81
Ген е(у)2 является ретрокопией гена е(у)2Р. 83
Обсуждение результатов 83
Структура гомологов белка Е(у)2 у различных организмов 83
Ген е(у)2Р D. melanogaster экспрессируется в семенниках 85
Белок Е(у)2 функционально заменил белок Е(у)2Р 85
Предсказанный промотор гена е(у)2 находится в районе
встраивания МЭ Stalker в линии е(у)2и1 86
Уникальность примера генов е(у)2 и е(у)2Р 86
Выводы 90
Благодарности 91
Список литературы 92
Введение к работе
Геном организма содержит всю необходимую для его жизнедеятельности информацию. Процессы реализации генома включают в себя множество механизмов, основная цель которых - перевод информации с «архивного» уровня нуклеиновых кислот на уровень активных белковых молекул.
Точное и слаженное действие всего организма достигается при правильной работе его частей — клеток, функционирование которых, в свою очередь, зависит от корректной внутриклеточной деятельности и регуляции деятельности различных белковых комплексов. Одним из активно изучаемых в настоящее время клеточных процессов является транскрипция генов.
В соматических клетках транскрипция достаточно хорошо изучена, тогда как процессы происходящие в клетках зародышевой линии изучены гораздо меньше.
С точки зрения обычной транскрипции геномы организмов содержат множество неинформативного материала: повторы, последовательности мобильных элементов и др. Такие последовательности накапливаются в ходе эволюции и служат одним из защитных механизмов организма от возникновения мутаций. Часто посредством Р-элементов возникают «молчащие» гены, которые получаются при ретропозиции активных генов. Однако из-за попадания в траискрипционно неактивные районы, накопления мутаций, усеченности рамок считывания они утрачивают функциональность.
Целью работы являлось изучение паралога гена enhancer of yellow 2 (е(у)2) у Drosophila melanogaster и других организмов. Как показано в работе, паралог (e(y)2F) является исходным геном, а е(у)2, кодирующий фактор транскрипции РНК-полимеразы II и экспрессирующийся во всех тканях Drosophila, является его ретрокопией. Оказалось, что ген е(у)2Р экспрессируется в апикальной части семенников самцов взрослых мух, где происходит ряд клеточных делений образующихся сперматоцитов, а также переключение программ клеточного цикла с митотической на меиотическую.
Исследована экзон-интронкая структура гомологов е(у)2 у других организмов, найдена общность в строении генов. На основе сравнения белковых последовательностей и филогенитеческого анализа приблизительно оценено время расхождения е(у)2 и е(у)2Р у Drosophila.
Предложена модель, по которой белок Е(у)2 заменил функции белка Е{у)2Р. Представленная гипотеза объясняет тканеспецифичность действия Е(у)2Р и убиквитарность Е(у)2.
Таким образом, в работе исследован и описан уникальный случай, когда ретрокопия гена вытеснила и во многом заменила исходный ген.
