Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 7
PIC (Preinitiatory complex) 8
РНК-пол имераза II , 8
РНК полимераза II и его CTD 10
Холофермент РНК-полимеразы П 10
Свойства коровых промоторных элементов РНК полимеразы II 11
TATA бокс 12
ТАТА-связывающие факторы 13
Инициаторный элемент (Inr) 14
DPE (Downstream promoter element) 15
TFIIB распознающий элемент 16
Проксимальный элемент (proximal sequence element - PSE) 16
Другие коровые промоторные элементы 17
Семейство TRF (ТВР-подобных факторов) 39
TRF1 40
TRF2 необходим для эмбрионального развития и дифференцировки 43
TRF2 мыши необходим для сперматогенеза 44
TRF2 управляемая промотор-селективная генная экспрессия у дрозофилы 45
TRF3 46
Ретуляторный ген Drosophila leg-arista-wing complex (lawc) 47
Объект и задачи исследования 49
3. Материалы и методы 50
1. Реактивы 50
2. Программное обеспечение Базы данных 50
3. Работа с ДНК 50
Приготовление компетентных клеток и трансформация. Вьщеление плазмидной ДНК . Рестрикция, лигнрование, переосаждение ДНК, гель-электрофорез 50
ПЦР 51
Введение радиоактивной метки в ДНК-зонд 52
5. Работа с РНК 52
Выделение тотальной РНК 52
Очистка polyA+ РНК 53
Получение кДНК, ОТ-ПЦР, 5'-, З'-RACE 53
Нозерн анализ 53
6. Генетические скрещивания, фенотипический анализ trf2 мутантов 54
7. Работа с белками 55
Экспрессия и очистка рекомбинантных белков .55
Получение антител и их очистка 55
Белковый гель-электрофорез 56
Иммуноблоттинг 56
Dot-blot 57
Выделение эмбрионального ядерного экстракта 57
Хроматография 57
Получение белковых экстрактов из эмбрионов 57
8. Гибридизация in situ 58
Гибридизация семенников in situ 58
9. Иммуноокрашивание 58
Иммуноокрашивание политенных хромосом 58
Иммуноокрашивание эмбрионов , 59
Иммуноокрашивание яичников и семенников 59
10. Работа с эмбриональными клетками D.melanogaster 59
4.Результаты 60
1. Изучение структуры гена trf2 , , 60
Картирование мутации lawc 60
Исследование влияния мутации lawc на уровень экспрессии гена trfl 60
Клонирование кЩ1К trfi 61
2.Изучение белков, кодируемых геном tr/2 63
3. Иммуноокрашивание хромосом и хроматография 66
Локализация на политенных хромосомах слюнных желез Drosophila melanogaster 66
Хроматографическое исследование 67
3. Анализ гомологов TRF2 у различных видов Drosophila... 69
4. Анализ экспрессии гена trf2 73
Иозерн развития 73
Нозерн тканей 73
Вестерн блот гибридизация тканей 73
Иммуноокрашивание яичников 74
Иммуноокрашивание семенников антителами к TRF2 и ТВР 79
Гибридизация семенников in situ 80
Вестерн блот анализ семенников мутантных мух 80
5. Обсуждение результатов. 83
6. Выводы 89
Благодарности 90
Список литературы. 91
- Свойства коровых промоторных элементов РНК полимеразы II
- TRF2 управляемая промотор-селективная генная экспрессия у дрозофилы
- Приготовление компетентных клеток и трансформация. Вьщеление плазмидной ДНК
- Локализация на политенных хромосомах слюнных желез Drosophila melanogaster
Введение к работе
Инициация транскрипции у эукариот нуждается в наборе определенных общих факторов транскрипции. Ключевую роль в инициации транскрипции всех классов PIIK-полимсраз играет TATA-binding protein (ТВР) [18, 22, 24, 57]. Этот белок входит в состав мультибелкового комплекса TFIID и отвечает за распознавание и связывание комплекса TFIID с TATA боксом, коровым элементом, общим для многих промоторов. Связывание TFIID с промотором инициирует формирование преинициаторного комплекса. Кроме ТВР в этот комплекс входят дополнительные ТВР ассоциированные факторы (TAFs). С-концевой домен ТВР высоко консервативен среди эукариот и содержит два симметричных повтора, которые складываются в «седловидную» структуру, необходимую для взаимодействия с последовательностью промотора [80, 83].
Второй ген, кодирующий белок с высокой гомологией к коровому домену ТВР, TBP-related factor (TRF2), также называемый TBP-like factor (TLF) или TBP-like protein (TLP), был обнаружен во всех многоклеточных [31, 77,102, 111, 122, 123,136,178]. Как и ТВР, большинство членов TRF2 семейства имеют высоко консервативный С-концевой коровый домен, содержащий два симметричных повтора, и вариабельный N-концевой домен. Как было показано, TRF2 активирует транскрипцию РНК-полимеразой II и взаимодействует с TFIIA и TFIIB, компонентами преинициаторного комплекса РНК-полимеразы П. Однако несмотря на структурное сходство с ТВР, TRF2 не связывает классический TATA бокс и, возможно, контролирует транскрипцию определенного набора генов, отличного от такового у ТВР [31,111,124,136,173].
Показано, что у С. elegans и Xenopus TRF2 необходим для эмбриогенеза, в то время как у мыши TRF2 не нужен для раннего развития, но необходим для сперматогенеза [30, 107]. У D. melanogaster была изолирована кДНК tr[2, содержащая открытую рамку считывания (ОРС) для белка длиной 632 ак [136]. Данный белок был охарактеризован на молекулярном уровне. Однако структура гена trfl и функция TRF2 у D. melanogaster осталась не исследованной.
Целью данной работы было изучение функции TRF2 в развитии Drosophila melanogaster.
Использовались разнообразные физико-химические методы работы с ДНК, РНК, белками, методы биоинформатики. Исследована экспрессия гена, показано, что в дополнение к TRF2 полипептиду, описанному ранее, trfl ген кодирует более длинный полипептид, размером 175 кДа. Продемонстрировано, что TRF2 является ткане-специфичным фактором и необходим на разных стадиях развития Drosophila melanogaster.
2. Обзор литературы
Регуляция транскрипции является ключевым шагом в контроле экспрессии генов, В данном процессе происходит комбинаторное взаимодействие си-регуляторных элементов ДНК и многих транскрипционных факторов. Недавние исследования показали, что многоклеточные организмы обладпют специализированными комплексами инициации транскрипции и промоторными последовательностями, которые координирование управляют регуляцией генов.
Регуляция транскрипции намного более сложна у эукариот, нежели у микроорганизмов. У микроорганизмов регулируются 800-6000 генов, их промоторы находятся в пределах 100-200 п.н. в области начала транскрипции, каждый промотор контролируется только 1-4 сиквенс-специфическими ДНК-связывающими белками. В то же время, животные имеют 14000-80000 генов, множество промоторов, распространяющихся на десятки тысяч нуклеотидов, которые могут регулироваться 40 или более сиквенс-специфическими ДНК-связывающими белками. Кроме того, животные имеют 80-250 типов клеток. Однако этим сложность регуляции транскрипции эукариотических организмов не исчерпывается. Изучение экспрессии выбранных случайным образом генов в эмбрионах дрозофилы показало, что даже среди клеток одного клеточного типа, большинство мРНК экспрессирутотся на различном уровне [87, 94]. Так, в сущности, каждая клетка у животных может иметь уникальный уровень транскрипции генов. В дополнение к этому, происходят постоянные изменения в транскрипции в течение развития организма и в ответ на перемены в окружающем пространстве. Drosophila melanogaster, в настоящее время является наиболее удобной моделью для изучения. Трансгенный анализ в этих организмах быстр и дешев [5, 163]. Для биохимических исследований, имеют значение белковые экстракты, которые можно получить из мух и эмбрионов в большом количестве, что позволяет осуществить очистку регуляторов и общих транскрипционных факторов [162]. Несмотря на высокую сложность, модель Drosophila проще, чем Veriebrata. Результатом этого является глубокое изучение механизмов транскрипции эукариот на примере DrosophНа melanogaster. PIC (Preinitiatory complex)
Для инициации транскрипции белок-кодирующих генов необходимо образование преинициаторного комплекса (РІС), состоящего из матрицы ДНК, РНК-полимеразы II и 5 общих транскрипционных факторов. Образование РІС происходит посредством связывания ТВР, субъединицы TFIID, с ТАТА боксом, последующего согласованного привлечения TFIIB, комплекса нефосфорилированной РНК-полимеразы П с TFTEF, TFIIE и TFIIH. После изменения промотора и инициации транскрипции, CTD домен большой субъединицы РНК-полимеразы II фосфорилируется. Это событие приводит к началу элонгации транскрипции. Последующая терминация (фосфатазное возвращение РНК-полимеразы II в ее нефосфорилированную форму) позволяет GTFs и РНК-полимеразе II инициировать следующий раунд транскрипции.
РНК-полимераза II
РНК-полимераза II является ферментом, ответственным за транскрипцию белок-кодирующих генов у эукариот. РНК-полимераза П катализирует ДНК-зависимый синтез мРНК, но не способна инициировать промотор-зависимую транскрипцию или отреагировать на действие регуляторных белков транскрипции в отсутствие других факторов. Современное представление о механизме инициации транскрипции изменилось после открытия возможности транскрипции в бесклеточных системах. Оказалось, что очищенная РНК-полимераза II млекопитающих может избирательно инициировать транскрипцию с матрицы ДНК при добавлении ее в клеточный экстракт грубой очистки. Этот факт позволил в дальнейшем идентифицировать GTFs, факторы, необходимые для аккуратной инициации транскрипции РНК-полимеразой II in vitro.
Хотя присутствия GTFs достаточно для осуществления базальной транскрипции РНК-полимеразой П, активация транскрипции в ответ на связывание промотор-специфических активаторов нуждается в дополнительных факторах, называемых транскрипционными коактиваторами. Большинство этих «необщих» факторов необходимы для экспрессии всех генов, транскрибируемых РНК-пол имеразой II [192].
РНК-полимераза П была локализована только в пределах кодирующих областей экспрессируемых генов. РНК-полимераза II (Mw 500-600 кДа) имеет консервативную мультисубъединичную структуру. Показано, что 40-50% аминокислотной последовательности этого белка идентичны в различных эукариотических организмах [149].
Особенно хорошо исследована РНК-полимераза П дрожжей, которая состоит из 12 субъединиц, кодируемых генами от RPB1 до RPB12 соответственно [191]. Интересно, что шесть субъединиц РНК-полимеразы II человека могут функционально заменять их гомологи в дрожжах [108]. Две самые большие субъединицы РНК-полимеразы II, Rbpl (~200 кДа) и Rbp2 (~150 кДа), являются наиболее консервативными субъединицами. Кроме того, Rpbl и Rpb2 являются гомологами р' и р субъединиц соответственно, бактериальной РНК-полимеразы. Белок Rpb3 родственен а субъединице бактериальной РНК-полимеразы [191]. Ни одна из субъединиц РНК-полимеразы II не является родственной бактеральной а-субъединичной семье, хотя найдено структурное и функциональное сходство между а и определенными GTFs. Rpbl, Rpb2, Rpb3 и Rpbll субъединицы РНК-полимеразы II гомологичны субъединицам РНК-полимераз I и III. Кроме того, пять субъединиц: Rpb5, Rpb6, Rpb8, RpblO и Rpbl2 являются общими для всех трех РНК-полимераз. Только Rpb4, Rpb7 и Rpb9 уникальны для РНК-полимеразы II. Десять генов дрожжей, кодирующих субъединицы РНК-полимеразы II являются необходимыми для жизнеспособности клеток [51].
РНК полимераза II и ее CTD
Все известные клеточные РНК-полимеразы, включая эукариотические РИК-полимеразы I, II и III и прокариотические РНК-полимеразы, удивительно схожи между собой по составу, аминокислотной последовательности и функции. Большая субъединица РНК-полимеразы П имеет С-концевоЙ домен (CTD), содержащий гептадный повтор с консенсусной последовательностью Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. CTD специфичен для РНК-полимеразы П, высоко консервативен среди эукариотических организмов, и играет ключевую роль в регуляции инициации транскрипции и координации котранскрипционных событий процессинга [192]. Длина этого повтора варьирует. Например, Rpbl дрожжей включает 26 или 27 повторов, у Celegans - 34, у Drosophita - 43, и CTD человека содержит 52 повтора. Существует предположение, что длина повтора увеличивается с увеличением сложности генома. Извесны две формы РНК-полимеразы II: 110, в которой CTD домен фосфорилирован и ПА, в которой он не фосфорилирован. Чаще всего IIA форма входит в РІС, в то время как 110 форма обнаруживается в комплексах элонгации. События процессинга РНК, вызываемые фосфорилированием СТО, включают кэпирование 5' конца, сплайсинг и присоединение 3-ро1у(А) [192].
Холофермент РНК-полимеразы II
До сих пор остается открытым вопрос о том, может ли холофермент РНК-полимеразы II сам индуцировать транскрипцию in vitro или требует присутствия белков из клеточного экстракта, т.к. бывает довольно трудно решить, можно ли считать тот или иной полипептид, участвующий на определенных стадиях транскрипции, составной частью РНК-полимеразы или же дополнительным компонентом. Из ядерного экстракта печени млекопитающих с помощью моноклональных антител к киназе M015/CDK7 С-РНК-полимеразы П был выделен комплекс, содержащий все компоненты, требующиеся для эффективной промотор-специфической инициации транскрипции на линейной и кольцевой ДНК [128]. Холофермент состоял из 12 субъединиц и, в отличие от дрожжевых компонентов, полученных ранее в других опытах, не требовал добавления факторов ТВР и TFIIE для успешной транскрипции, т.к. уже содержал эти компоненты. Предположили, что фракция РНК-полимеразы II содержит большой комплекс, который назвали "РНК-полимераза II холофермент". Этот большой белковый конгломерат содержит кор РНК-полимеразы II (мультибелковый фермент, который традиционно обозначают как РНК-полимераза II), субпопуляцию общих транскрипционных факторов (таких как TFIIB, TFIIE, TFIIF и/или ТРПН), 9 SRB белков (супрессоров РНК-полимеразы В) и другие известные (такие как GAL11, SIN4, RGR.1 и ROX3) и неизвестные белки [74].
Свойства коровых промоторных элементов РНК полимеразы II
Транскрипция белок-кодирующих генов эукариот включает в себя ряд событий, таких как, деконденсацию локуса, ремоделинг нуклеосом, модификации гистонов, связывание транскрипционных активаторов и коактиваторов с энхансерами и промоторами и взаимодействие основного молекулярного аппарата транскрипции с коровым промотором. Внутренний промотор содержит: коровый регион, проксимальный промотор и дистальную энхансерную область. Коровый промотор - это последовательность ДНК, которая располагается на расстоянии -35 п.н. upstream и/или downstream от сайта инициации транскрипции. В основной молекулярный аппарат транскрипции входят: РНК-полимераза II и факторы, которые минимально необходимы для транскрипции in vitro с изолированного корового промотора (основные/общие факторы транскрипции). ТАТА бокс является основным, наиболее изученным коровым промоторным элементом. Стабильный комплекс преинициации транскрипции на ТАТА-зависимых коровых промоторах формируется ассоциацией основных факторов транскрипции в следующем порядке: TFIED/TFIIA, TFIIB, РНК-полимераза II/TFIIF, TFIIE, TFIIH. Свойства основных факторов транскрипции и механизм, по которому они действуют достаточно хорошо изучены.
Хотя ранее считалось, что коровые промоторы РНК-полимеразы П неизменны, было обнаружено, что они имеют значительные структурные и функциональные различия. Оказалось, что различные коровые промоторы вносят важный вклад в комбинаторную регуляцию генной экспрессии. TATA бокс TATA бокс является первым коровым промоторным элементом, обнаруженным в белок-кодирующих генах. Фактически во всех генах, транскрибируемых РНК-полимеразой П, последовательность ТАТААА присутствует на расстоянии 25-30 п.н. upstream от сайта старта транскрипции. Было показано, что мутации в TATA последовательности обычно уменьшают активность клеточных и вирусных промоторов или делают их неактивными [14, 68]. Если инициация транскрипции с мутантного промотора остается заметной, то смещается старт инициации транскрипции, В Saccharomyces cerevisiae, TATA бокс также необходим для инициации транскрипции, но в этом организме данный элемент располагается на расстоянии 40-120 п.н. upstream от сайта старта [165].
Компьютерный анализ базы данных генов Drosophila melanogaster показал, что ТАТААА последовательность или последовательность с одной нуклеотидной заменой в ней представлена в 43% из 205 коровых промоторов или, по другим исследованиям, в 33% из 1941 потенциальных промоторов [89,126].
Было показано, что последовательность 5'-TATATAAG-3* является оптимальной для распознавания основным фактором транскрипции ТВР (TATA binding protein) [190]. Однако в других экспериментах было выявлено, что широкое число А/Т-богатых последовательностей могут функционировать как TATA боксы, и взаимодействовать с ТВР. Результаты структурного анализа и статистические данные показали, что для активности TATA бокса три нуклеотида (в позициях 2, 4 и 5) должны оставаться неизменными [161].
Хотя большинство исследований TATA бокса было проведено на дрожжах, дрозофиле и человеке, аналогичные элементы были найдены и в более древних эукариотах, например у архея. TATA боксы или АТ-богатые последовательности на фиксированном расстоянии upstream от старта начала транскрипции, были найдены практически во всех животных, растениях и грибах, которые были исследованы. Кроме того, ТАТА-подобные последовательности обнаружены у простейших [135]. Однако, несмотря на существование TATA боксов и ТВР у архея, ТАТА-подобные последовательности не выявлены в таких эукариотах, как большинство древнейших паразитов простейших [98].
Механизм, который определяет расстояние от TATA бокса до сайта старта транскрипции, является объектом большого числа исследований [39]. Было найдено, что на изменение расстояния влияют TFITB и РНК-полимераза П [93]. Механизм, по которому ТПГВ и РНК-полимераза П определяют расстояние, неизвестен. Однако было показано, что мутации TFIIB, вызывающие изменение старта транскрипции, меняют также конформацию TFIIB [39]. Возможно, что конформационные изменения сдвигают локализацию каталитического центра РНК-полимеразы II на промоторе. Или, по другой гипотезе - мутации TFIIB вызывают конформационные изменения РНК-полимеразы II, которые мешают правильному позиционированию РНК-полимеразы П на промоторе [199].
ТЛТА-связывающие факторы
Хотя ТВР, по-видимому, является главным ТАТА-связывающим фактором, многоклеточные животные от нематод до человека экспрессируют дополнительные ТАТА-подобные факторы - TRF1 (TBP-related factor 1) и TRF2 (TATA-related factor 2) или TLF (TATA-like factor) [31]. Первый TRF - TRF1, был обнаружен у дрозофилы и является ткане-специфичным регуляторним белком [28]. Этот белок способен связывать консенсус ТАТА бокса, взаимодействует с TFIIA и TFIIB (два основных фактора транскрипции, взаимодействующие с ТВР). У дрозофилы TRF1 является также основным компонентом транскрипционного комплекса РНК-полимеразы HI, TFIIIB, в то время как ТВР является компонентом этого комплекса в других эукариотах [52, 170]. TRF1 образует мультибелковый комплекс с факторами, не входящими в TF1ID комплекс [52]. Эти исследования показали, что TRF1 может быть функционально сходен с ТВР, и вызывает активацию определенного набора белок-кодирующих генов.
Хотя TRF1 был найден только у дрозофилы, второй TRF, TRF2 (также известный как TLF, TLP и TRP) был идентифицирован у нескольких многоклеточных организмов, но не у растений и грибов [31]. TRF2 более сильно отличается от ТВР, чем TRF1, но, вероятно, укладывается в сходную «седловидную» структуру. Взаимодействие с TFIIA и TFIIB сохраняется, но фенилаланины, которые (в ТВР) отвечают за расплетание и выпетливание нити ДНК, в составе TRF2 не обнаружены [31]. В связи с отличием в ДНК-связывающей поверхности, TRF2 не способен связывать TATA боксы [31,77], Цницнаторный элемент (Inr)
Инициаторный элемент является дискретным коровым промоторным элементом, который функционально схож с TATA и может функционировать независимо от TATA бокса [159, 160]. Транскрипция с этого промотора инициирует единственный сайт старта транскрипции. Было показано, что последовательность между -3 и -5 необходима и достаточна для аккуратной транскрипции и in vitro и in vivo [73, 159].
Был выявлен консенсус Inr: Ру Ру А (+1) N Т/А Ру Ру [73, 99]. Для активности Inr оказалось достаточно набора пиримидинов в позициях -2, +4 и +5, но активность этого промотора повышается с увеличением числа пиримидинов [73, 99]. Функциональный консенсус сходен, но не идентичен у млекопитающих и у дрозофилы (у млекопитающих: Ру С А(+1) N Т Ру Ру; у дрозофилы: Т С A(+l) G/T Т Ру) [161]. Компьютерный анализ последовательности (идентичной Inr или содержащей одну нуклеотидную замену) у дрозофилы показал, что Inr представлен у 69% из 205 промоторов или, по другим исследованиям, у 69% из 1941 коровых промоторов [89,126].
Было найдено, что TFIID (коактиваторный комплекс) специфично взаимодействует с Inr [161]. Анализ связывания TFIID с коровым промотором, содержащим и Inr и DPE элемент, показал, что Inr важен для стабильного связывания ТРІШ. Хотя стабильное связывание TFIID комплекса с изолированным Inr, в отсутствие TATA или DPE, не показано, Verrijzer и коллеги определили стабильное связывание Inr с комплексом, состоящим из двух TAFs: TAFnl и TAFn2 [180]. Также было показано, что TFIIA необходим для связывания TFIID с Inr элементом [37]. Возможно TFIIA может вызывать конформационные изменения TFIID комплекса [21,66, 67].
Кроме TFIID, три других белка распознают Inr элементы: РНК-полимераза П, TFII I, YY-1. РНК-полимерза II неэффективно инициирует транскрипцию с Inr элементов в отсутствие других транскрипционных факторов [161]. DPE (Downstream promoter element) DPE был идентифицирован как downstream коровый промоторный мотив, который необходим для связывания TFIID с ДНК определенных генов [75]. DPE является консервативным элементом и работает вместе с Inr. Последовательность DPE локализована точно от +28 до +32 относительно А+і нуклеотида Inr мотива [89]. Типичный DPE-зависимый промотор содержит Inr DPE. Мутация и DPE и Inr приводит к потере связывания TFIID и базальной активности транскрипции [17]. В базе данных с 205 коровыми промоторами, было найдено около 29% промоторов, содержащих TATA, но не DPE, 26% обладают DPE, но не TATA, 14 % содержат и TATA и DPE, 31% не содержат ни того ни другого [89]. Компьютерный анализ консенсуса DPE человека показывает, что он сходен, но не идентичен DPE дрозофилы [16]. Существует активность, которая стимулирует DPE-зависимую транскрипцию и репрессирует ТАТА-зависимую транскрипцию. Эта активность опосредуется белком NC2/Drl-Drapl, который был найден как репрессор ТАТА-зависимой транскрипции. Исследования показывают, что NC2/Drl-Drapl активирует DPE-зависимую транскрипцию, и, что его функции различны в DPE- и ТАТА-зависимых промоторах [161]. TFIIB распознающий элемент TFIIB распознающий элемент (BRE) является единственным хорошо охарактеризованным элементом в коровых промоторах белок-кодирующих генов, который распознается фактором другим, чем TFIID (или TRF1 или TRF2). Этот элемент находится сразу upstream от TATA бокса, что впервые было выявлено у архея [129, 140]. Х-гау кристаллическая структура TBP-TFIIB-TATA комплекса показьгаает, что TFIIB взаимодействует с главным желобком ДНК сразу upstream от TATA бокса и с малым желобком ДНК downstream от TATA бокса [120], Была найдена консенсусная последовательность BRE человека: G/C G/C G/A С G С С [90]. BRE распознается НТН мотивом на С-конце TFIIB [90, 120, 177]. Этот мотив отсутствует у дрожжей и растений. Существует предположение, что BRE не участвует в регуляции транскрипции у этих Организмов,
Проксимальный элемент (proximal sequence element — PSE)
Это высоко консервативный элемент корового промотора генов мяРНК. PSE элемент локализован между -45 и -60 относительно старта транскрипции генов мяРНК. Этот элемент необходим для базальной транскрипции и определяет локализацию сайта старта транскрипции [29, 56, 58, 100, 151, 157]. Консенсусная последовательность PSE была найдена у различных организмов [29,100]. У человека: TCACCNTNA C/G Т N A A A A G T/G [100]. PSE распознается уникальным мультибелковым комплексом, назваемым SNAPc, РВР или PTR [56, 58,115, 145, 151,182]. У человека SNAPc комплекс необходим для активности промоторов генов мяРНК, транскрибируемых и РНК-полимеразой II, и РНК-полимеразой III [56]. SNAPc-направленная транскрипция также нуждается в ТВР, который связывает ДНК промоторов генов мяРНК, которые кроме PSE содержат TATA бокс [56, 58, 151].
Другие коровые промоторные элементы
Первый, downstream core element - DCE был идентифицирован в промоторе р~ глобинового гена человека [92]. DCE расположен между +10 и +45. Этот элемент способен вызывать активацию транскрипции и связывать TFED. Второй, найденный в гене глпального фибриллярного белка (gfa), downstream promoter element (от +11 до +50) также необходим для связывания TFIID и активации транскрипции [118]. Третий, multiple start site downstream element (MED-l) был найден в ТАТА-не содержащих промоторах, которые имеют некластеризированные множественные сайты старта [69]. Было показано, что MED-1 элемент способствует транскрипционной активации с двух из трех исследованных промоторов. CpG островки (islands)
Несмотря на широкое распространение промоторов, ассоциированных с CpG, элементы, ответственные за их функцию корового промотора остаются не исследованными. CpG-ассоциированные промоторы обычно не содержат консенсус ТАТА бокса, DPE элемент или Inr элементы [10, 158]. Одна общая черта CpG-промоторов -присутствие множественных сайтов связывания для транскрипционного фактора Spl [10, 13, 101]. Сайты старта транскрипции локализованы на расстоянии 40-80 п.н. downstream от Spl сайтов. Скорее всего Spl может управлять базальной транскрипцией через формирование преинициаторного комплекса внутри определенного свободного «окна». [10, 158]. Есть также возможность, что субъединицы TFIID, которые способны распознавать промотор, затем взаимодействуют с последовательностью внутри этого «окна». Согласно этой гипотезе, распознавание корового промотора внутри CpG зависит от тех же факторов и элементов, описанных выше. Ключевым отличием является то, что связывание основных факторов транскрипции более строго зависит от активаторных белков, связанных с дистальними промоторными элементами [161].
После изменения промотора и инициации транскрипции, CTD домен большой субъединицы РНК-полимеразы II фосфорилируется, это событие способствует началу элонгации транскрипции. Последующие терминация и фосфатазное возвращение РНК-полимеразы И в ее нефосфорилированную форму позволяют GTFs и РИК-полимеразе II инициировать следующий раунд транскрипции. ТВР
Первоначально, TATA-binding protein (ТВР) был найден в Saccharomyces cerevisiae, где белок был выделен как одиночный полипептид. Белковая последовательность, найденная у дрожжей, привела к изоляции кДНК клонов ТВР у нескольких видов эукариот. Рекомбинантный ТВР может связывать и общие, и регул яторные факторы, а также управлять сборкой PIC in vitro и базальной транскрипцией. В отсутствие ДНК, консервативный кор ТВР кристаллизован как димер так, что закрывает ДНК-связывающую поверхность. Мутация вдоль выпуклой ДНК-связывающей и димеризационной поверхности в различной степени ингибирует самоассоциацию ТВР, в то время как способность ТВР связывать TATA бокс одинаково уменьшается [192].
Гомологи дрожжевого ТВР, у дрозофилы и человека, как было показано, являются ТАТА-связывающими субъединицами мультисубъединичного TFHD комплекса. ТВР также является компонентом других мультисубъединичных комплексов, которые способствуют инициации транскрипции РНК-полимеразами I и III.
Анализ ТВР-ТАТА кристаллов показал новый механизм связывания ДНК. ДНК-связывающий регион ТВР складывается в структуру, похожую на «седло». Это молекулярное «седло» состоит из двух квази-симметричных доменов, каждый из которых содержит 89-90 аминокислот. N-концевой домен белка взаимодействует с 3'-половиной TATA последовательности, в то время как С-концевой домен взаимодействует с 5'-половиной. Каждая половина большой вогнутой поверхности «седла» состоит из 5 складок антипараллельных р-слоев. Восемь из десяти р-слоев взаимодействуют с малым желобком двойной спирали ДІЖ. Связывание ТВР с малым желобком предполагает обширные гидрофобные взаимодействия. ТВР также вызывает выпетливание ДНК и на 5'-и на 3'- концах ТАТА бокса и частично разматывает дуплекс, благодаря инсерции фенилаланиновых остатков. Связывание ДНК осуществляется изогнутыми антипараллельными р-слоями, которые подготавливают большую вогнутую поверхность малого желобка и обратной стороной контактируют с 8 п.н. ТАТА элемента. 5'-конец стандартной В-формы ДНК входит в нижнюю часть молекулярного «седла», в то время как ТВР вызывает частичное раскручивание правозакрученной двойной спирали, вызванное инсерцией двух фенилаланиновых остатков в первые Т:А основания. После этого, расширенная поверхность малого желобка, раскрученной, ровно изогнутой ДНК приближается к нижней части молекулярного «седла», вызывая направленные взаимодействия между цепями белковой стороны и концами малого желобка центральных 6 п.н.. Вторая большая петля образуется благодаря инсерции двух фенилаланиновых остатков между последними двумя парами оснований ТАТА элемента, что приводит к возврату к В-форме ДНК [119].
Несмотря на это большое изменение, уотсон-криковское образование пар сохраняется во всех отношениях, так как частичное разматывание компенсируется правым суперскручиванием двойной спирали.
Искаженная структура ДНК делится на область, которая напрямую взаимодействует с ТВР и фланкирующую ДНК, большей частью неизмененную. Связанная ДНК защищена вогнутой стороной «седла», в то время как выпуклая (или «место «седла»») располагается на поверхности, и связывает различные компоненты молекулярного аппарата транскрипции.
Была определена структура взаимодействия ТВР с различными TATA элементами растений, дрожжей и человека. Эти три кокристаллические структуры очень похожи и демонстрируют общий индуцибельный механизм распознавания белком ДНК [119].
Долгое время ТВР рассматривался как универсальный фактор, необходимый для инициации транскрипции РНК-полимеразами I, II, III. Это мнение изменилось после открытия у многоклеточных TLF/TRF2 семейства, представители которого связывают последовательность ДНК отличную от классического TATA бокса.
Альтернативные ТВР-содержащие комплексы также играют важную роль в инициации транскрипции РНК-полимеразой II.
Другая форма ТВР-содержащего комплекса, B-TFIID человека (или TBP/MotI комплекс у дрожжей), не содержит классические TAFs, но вместо них имеет единственную SnO/Snf-родственную АТФазу, BTAFI (ранее TAF170) человека (или Motl у дрожжей) [133, 175]. Motl является необходимым регулятором РНК-полимераза II-зависимой транскрипции in vivo [32] и диссоциирует ТВР-ДНК комплекс in vitro [1]. In vitro, B-TFIID человека опосредует базальную транскрипцию РНК-полимеразой II, но не помогает в стимуляции транскрипции факторами, содержащими кислые или глутамин-богатые мотивы активации [176].
Другим примером может служить NC2 содержащий комплекс. NC2 является гетеродимером двух, субъединиц (Bur67DRAPl и NC2alfa/DRl), каждая из которых содержит две гистоновые складки, NC2 связывает и стабилизирует ТВР/ТАТА комплексы, ингибируя связывание TFIIA и TFIIB. NC2 занимает область сразу под ТВР/ТАТА поверхностью, содержащей ДНК с двух сторон от ТВР. Домен NC2 подтягивается и контактирует аминокислотными основаниями вдоль выпуклой поверхности ТВР, что вызывает стерическую преграду для связывания TFITB. Мутация ТВР в дрожжах вдоль этой поверхности нарушает TBP/NC2 взаимодействия in vitro и вызывает повышенную экспрессию определенного набора генов, не имеющих энхансера in vivo. Также NC2 играет и позитивную роль в транскрипции (природа этого явления не выяснена) [27]. Т.е. NC2/TBP комплекс является бифункциональным основным транскрипционным фактором, который, сходным с Motl/TBP комплексом образом, дифференцированно регулирует инициацию транскрипции РНК-полимеразой II.
Недавно, в эмбриональных клетках карциномы был описан другой ТВР-содержащий комплекс, ТАС (TBP-TFIIA-содержащий комплекс) [110]. ТАС содержит TFIIAy субъединицу и непроцессируемую форму TFIIAap, и опосредует инициацию транскрипции РНК-полимеразой II в отсутствие TAFs. TFIIB TFIIB входит в РІС после формирования ТВР-ДНК комплекса и является необходимым условием для связывания РНК-полимеразы П. TFIIB является единственным полипептидом, который включает: N-концевой Zn-связывающий домен (nTFIIIB); коровый домен, в который входит С-концевые две трети молекулы (cTFIIB); и филогенетически консервативную последовательность, которая соединяет эти два домена. cTFIIB человека включает helix-turn-helix (НТН) мотив, который связывает BRE -последовательность, присутствующую в некоторых промоторах сразу upstream от TATA бокса [90]. BRE может репрессировать базальную транскрипцию с активатор-опосредованным разрушением взаимодействия TFIIB-BRE [38]. X-ray структуры для cTFIIB в ДНК-TBP-TFIIB тройных комплексах определили специфичные контакты TBP-TFIIB и TFIIB с ДНК промотора [9, 177]. cTFIIB связывает промотор через специфичные контакты между основаниями в большом желобке upstream (BRE) и в малом желобке downstream TATA бокса. Это асимметричное связывание TFIIB, вероятно, служит для однонаправленной сборки РІС и направления транскрипции. Показано что TFIIB, входя в РІС, претерпевает конформационные изменения [54]. Структура N-концевого Zn-связывающего домена TFIIB архея оказалась сходной со структурой, найденной у фактора элонгации TFIIS [200].
Мутации гена TFIIB дрожжей смещают сайт старта; сходные дефекты у TFIIB человека также смещали старт инициации [53]. Критичный для сборки PIC, TFIIB также играет большую роль в дальнейшей транскрипции [23,139].
Электронная кристаллография TFlIB-PHK-полимераза II комплекса, и структура ДНК-ТВP-TFIIB тройного комплекса показывают механизм выбора сайта старта: TFIIB является мостом для взаимодействия между ТВР и РНК-полимеразой II, и матрице ДНК нужно только проследовать от TATA бокса к позиции сайта старта в активном центре РНК-полимеразы II [91]. В рамках данной модели можно посчитать консервативное расстояние между TATA и стартом сайта у многих промоторов. Однако из нее неясно, как мутации и в TFIIB, и в РНК-полимеразе II влияют на выбор сайта старта или как РНК-полимераза II дрожжей способна инициировать транскрипцию с множественных стартов специфичных промоторов. Несмотря на критическую важность соединения TFIIB-PHK-полимераза Ы, ни домены, ни специфичные основания, которые определяют это взаимодействие, не были найдены [192]. TFIIF TFIIF фактор был выделен на основании его физического связывания с РНК-полимеразой П. Связывание РНК-полимеразы П с TFIIF стабилизирует ДНК-TBP-TFIIB тройной комплекс и является предпосылкой для входа в РІС основных факторов транскрипции TFIIE и TFIIH . TFIIF является гетеродимером, состоящим из двух больших (TFIIFa/RAP74) и двух малых (TFIIFpYRAP30) субъединиц. Обе субъединицы являются многодоменными полипептидами, которые играют различные роли в инициации, элонгации и регуляции CTD фосфатазной активности.
Эксперименты по определению сайт-специфических бело к-ДНК взаимодействий выявили точки контакта TFIIF с матрицей ДНК. RAP30 взаимодействует с матрицей ДНК с каждой стороны от TATA бокса, в то время как RAP74 взаимодействует только downstream от TATA [82]. Результаты нескольких независимых исследований говорят о сходных контактах, исключая исследование, где RAP74 также связывал промотор ДНК upstream от TATA [42]. Электронные микрофотографии TBP-TFIIB-TFIIF-RNAPII-матрица комплекса подтверждают обе версии связывания, и показывают, что промоторная ДНК заворачивается вокруг РНК-полимеразы II в РІС. Сомнительный upstream контакт RAP74 интегрируется в модель о возможной TFIIF-опосредованной изомеризации РІС [141]. Микрофотографии высокого разрешения TBP-TFIIB-TFIIF-RNAPII-матрица комплекса, описывающие топологию TFIIF, недоступны. X-ray кристаллическая структура гетеродимера, состоящего из N-концевых фрагментов TFIIF определена как новый димеризационный фолд «тройной бочонок» [45]. Сруктуры С-концевых доменов RAP30 и RAP74 соответственно, оказались схожи в третичной структуре, несмотря на ограниченное сходство между двумя субъединицами [49, 78]. Эти структуры формируют разветвленные петли, сходные с таковыми у гистона Н5. И линкерный гистон, и RAP30 связывают ДНК без специфичной последовательности, но с предпочтением к нелинейным конформациям ДНК. Это может объяснить зависимость ТВР от связывания RAP30 с промоторной ДНК, Следовательно, две разветвленные петли RAP30 внутри TFIIF гетеротетрамера могут считаться паттерном RAP30 с каждой стороны от TATA бокса. По существу, RAP30 является «фактором конденсации» [49], который может объяснить компактизацию промоторной ДНК вокруг РНК-полимеразы П, исследованную на электронных микрографиях РІС [42, 82]. Электростатические свойства расплетенной петли RAP74 отличаются от таковой у RAP30. Предположительно, RAP74 взаимодействует с Fcpl CTD фосфатазой [78]. TFIIE
Первоначально TFIIE фактор был выделен из ядерного клеточного экстракта клеток HeLa. Биохимический анализ показал, что TFIIE человека состоит из 56 кДа (TFIIE-a) и 34 кДа (TF1IE-P) субъединиц, которые формируют аг Рг гетеротетрамер. Таким образом, подобно TFIIF, TFIIE является гетеродимером, содержащим две большие (TFIIEa) и две малые (TFIIEJ3) субъединицы. Однако двумерная кристаллография комплекса TFHE-РНК-полимеразы ЇІ показала, что дрожжевой TFIIE существует как <*Р димер [91]. Гены человека, кодирующие обе субъединицы, были клонированы [125, 131, 166]. Обе субъединицы высоко заряжены, со значениями рН 4,5 и 9,5 для TFIIE-a и TFI1E-р соответственно. Не найдены близкородственные белки, хотя обе субъединицы включают определенные структурные мотивы, такие как zink-ribbon motif (С-Х2-С-Х2-С-Хг-С), протеинкиназная последовательность в TFIIE-a и консенсус нуклеотид-связывающего сайта в TFIIE-p\ Обе субъединицы обнаруживают определенное сходство с о фактором бактерий. Дрожжевой фактор также необходим для аккуратной транскрипции in vitro [150]. Анализ очищенного о фактора определил, что в его состав входят две субъединицы 66 кДа и 43 кДа. Этот фактор, возможно, является дрожжевым аналогом и TFIIE и TFIIF [150]. Связь этого фактора с GTFs многоклеточных стала ясной после клонирования генов дрожжей, кодирующих эти две субъединицы. TFIIE вызывает поздние события в сборке РІС, включая вовлечение TFITH и последующую регуляцию TFITH активности. TFIIE направленно взаимодействует с нефосфорилированной формой РНК-пол имеразы II, а также обеими субъединицами TFIIF и TFIIH. TFIIE и TFIIH необходимы для формирования АТФ-зависимого открытого промоторного комплекса перед образованием первой фосфатной связи. TFIIE, TFIIF и TFIIH также кооперируются для перехода РНК-полимеразы II к продуктивной элонгации. Кроме того, TFIIE вовлечен во взаимодействие некоторых генно-специфических активаторов [51].
Коровый домен TFIIEp человека формирует мотив расплетенной петли, третий пример расплетенной петли в молекулярном аппарате транскрипции РНК-полимеразы II [127]. В отличие от расплетенной петли RAP74, расплетенные петли TFIIEp и RAP30, как предполагается, принимают участие в неспецифическом связывании ДНК. TFIIE формирует промоторные контакты downstream от транскрипционной «пузырьковой» области, не видоизменяясь под действием белок-ДНК взаимодействий, РНК-полимеразы II или других GTFs [81]. Эти контакты TFUE-промотор подтверждаются снимками электронной кристаллографии TFIIE с РИК-полимеразой II, где TFIIE находится около активного центра фермента [91]. TFIIH GTFs TFIIB, TFIID, TFIIE и TFIEF с TFIIA достаточно для аккуратной инициации транскрипции РНК-полимеразой II in vitro. TFIIH наибольший и наиболее сложный комплекс GTFs, состоящий из девяти субъединиц, по молекулярному весу сравнимый с РНК-полимеразой II. TFIIH является GTF с определенными эязиматическими свойствами и включает: ДНК-зависимую АТФазу, две АТФ-зависимые хеликазы противоположной полярности (ХРВ и XPD) и циклин-зависимую протеинкиназу (cdk7-cyclinH). TFIIH может быть разделен на два субкомплекса: коровый-TFIIH и циклин-киназный комплексы. Коровый-TFIIH является не только компонентом основного молекулярного аппарата транскрипции, но также входит в состав NER (nucleotide excision repair). Этот дуализм показывает молекулярную связь между транскрипцией и репарацией, которая только подозревалась до идентификации TFIIH. Холо-TFIIH вызывает изменения до, в течение, и сразу после инициации транскрипции [192].
Недавние исследования выдвинули две различные модели того, как ХРВ катализирует изменение промотора. По первой модели, ХРВ взаимодействует с ДНК и upstream и downstream от сайта старта, приводя к заворачиванию матрицы вокруг РІС. Гидролиз АТФ затем вызывает конформационные изменения ХРВ, которые физически разделяют две цепи ДНК для формирования открытого промоторного комплекса [34]. Во второй модели, ХРВ делает более ограниченные контакты с ДНК, только downstream от сайта старта. Эти данные приводят к предположению, что ХРВ катализирует АТФ-зависимую ротацию ДНК downstream около неподвижного upstream сайта, и функционирует как молекулярный «раскручиватель» ДНК на сайте старта [81]. Несмотря на фундаментальные различия этих двух моделей ХРВ-опосредованного открытия промотора, никто не предполагает, что ХРВ функционирует как классическая хеликаза.
Была расшифрована трехмерная структура TFIIH частиц человека и дрожжей. TFIIH человека при разрешении 38 А оказалась кольцеподобной структурой с центральным отверстием, чьи размеры достаточны для размещения двуцепочечнои молекулы ДНК [152]. В дрожжах закрытое «кольцо» исчезает. Четвертичная структура TFIIH сходна с другими колецеподобными связывающими нуклеиновые кислоты комплексами [192]. TFIIA TF1IA был открыт как GTF, поскольку необходим для специфичной транскрипции in vitro. Однако недавние исследования установили, что TFIIA необязателен для ТВР-управляемой инициации, но стимулирует транскрипцию в TFIID-управляемой системе. TFIIA ассоциирует с РІС, взаимодействуя с ТВР, и стабилизирует связывание ТВР с ТАТА боксом. TFIIA также взаимодействует со специфичными активаторами, TAF4, и с коактиваторами РС4 и HMG2. Кроме того, TFIIA необходим для шага, определяющего скорость формирования открытого промоторного комплекса. Так, TFIIA не существенен для аккуратной инициации, но играет важную роль в активации транскрипции, функционируя и как антирепрессор и как коактиватор.
Гомолог TFIIA дрожжей у многоклеточных был идентифицирован в транскрипционной системе млекопитающих in vitro. Активностью TFIIA дрожжей обладают два полипептида с примерной молекулярным весом 32 и 13,5 кДа. Гены, кодирующие обе субъединицы, были клонированы и обозначены ТОА1 и ТОА2. И ТОА1, и ТОА2 необходимы для жизни клеток, что подчеркивает функциональную важность TFIIA, Структурный анализ Toal и Тоа2 определил домены обеих субъединиц, которые необходимы для их ассоциации, ТВР-ДНК взаимодействий и транскрипционной активности.
Сходно с ТАР субъединицами TFIID, TFIIA не является необходимым для активации транскрипции in vitro фактором. Однако, мутанты ТВР, не способные связываться с TFI1A, дефектны в активации in vivo. Это очевидное несоответствие может быть объяснено тем, что взаимодействие TBP-TFIIA блокирует эффекты общих транскрипционных репрессоров, отсутствующих в системах in vitro, которые или вызывают TBP-TFIIA диссоциацию или ослабляют TBP-TFIIA ассоциацию. TFIIA человека и TFIIA дрозофилы состоят из трех субъединиц с примерным молекулярным весом 35/30, 19/20 и 12/13 кДа. В обоих организмах две наибольшие субъединицы кодируются одним и тем же геном и, возможно, являются посггрансляционно модифицированными формами белка предшественника. N-концевые 54 аминокислоты и С-концевые 76 аминокислот белка предшественника обнаруживают структурное сходство с ТОА1-кодируемой субъединицей TFILA дрожжей. Следовательно, неконсервативный центральный регион Toal несущественен для функции. Наименьшая субъединица TFI1A является гомологом ТОА2-кодирующей субъединицы TFIIA дрожжей. Так, три субъединицы TFIIA многоклеточных кодируются двумя генами, которые гомологичны ТОА1 и ТОА2 дрожжей.
Была получена кристаллическая структура двух форм дрожжевых TFIIA-TBP-ДНК трехкомпонентных комплексов. В обоих случаях, структуры были определены с наименьшей формой TFIIA, которая поддерживает биологическую функцию. Согласно этим исследованиям, наибольшая из субъединиц TFIIA несущественна, центральный регион полипептида делегируется, Были идентифицированы два главных структурных элемента: шестинитевой р-сэндвич и четырехпетлевой узел. С-конец обеих субъединиц вносит вклад в виде трех нитей в р-сандвич и N-конец каждой субъединицы вносит вклад в виде двух петель в каждый петлевой узел. TFIIA ассоциирует со стороной ТВР-ДНК, обратной TFIIB. В отличие от TFIIB, который связывается и upstream и downsream от TATA бокса, TFIIA локализуется исключительно upstream от TATA бокса и, вероятно, контактирует с другими общими факторами, которые связываются downstream от TATA [51]. TFIID
В большинстве случаев, синтез мРНК начинается с распознавания и плотного связывания с TATA элементом TFIID комплекса. Роль TFIID комплекса оказалась в фокусе значительных биохимических и генетических исследований с момента его открытия в клетках человека в 1980 году. TFIID состоит из более чем десяти различных полипептидов, масса которых варьирует от 15 до 250 кДа. Большинство этих субъединиц TFIID очень консервативны между различными видами такими как: дрожжи, дрозофила и человек. Эксперименты по нокауту генов 4 TFIID субъединиц дрожжей, показали, что они необходимы для жизнеспособности клеток. TFIID является фактором, специфичным для РНК-полимерзаы II и включает: ТВР и от 8 до 11 других полипептидов.
Связывание TFIID человека с ДНК сначала было продемонстрировано на примере аденовирусного промотора (AdMLP). Другие исследования AdMLP с использованием ДНКазы I и промоторов генов человека показали сиквенс-специфическое взаимодействие между TFIID человека и TATA элементом, которое было обусловлено ТВР субъединицей TFIID комплекса. Примечательно, что связывание TATA бокса и TFIID и ТВР нарушает укладку корового промотора с нелинкерными гистоновыми белками (Н2А, Н2В, НЗ и Н4). Наоборот, укладка корового промотора с гистоновым октамером в нуклеосомы предотвращает связывание TFIID и ТВР с TATA элементом, эффективно репрессируя транскрипцию. In vivo, хроматин-опосредованная репрессия транскрипции преодолевается различными АТФ-зависимыми макромолекулярными аппаратами, которые ремоделируют хроматин в районе корового промотора.
Разнообразный спектр ТВР- и TAF- факторов позволяет эукариотическим клеткам формировать множество комплексов, распознающих промотор, различающихся по составу и функции. В самом деле, большое количество исследований in vitro сообщает о том, что одиночная клетка человека содержит TFIID комплексы с или без TAF10, которые обладают функционально различными свойствами [15, 71]. Также были найдены TFIID комплексы, включающие в себя коровые TAFs и клеточные ткане-специфичные TAFs. Например, было показано, что TAF4b обогащены дифференцирующиеся В лимфоциты человека, и из этих клеток был изолирован уникальный ТАР4Ь-содержащий TFIID [33]. Позднейшие исследования показали, что TAF4b имеет избыточные функции в В клетках по сравнению с другими родственными факторами, и что TAF4b опосредует транскрипцию определенного набора генов, необходимых для правильного образования фолликул в яичниках [43]. Кроме того, были найдены, участвующие в процессе сперматогенеза ТАР7Ь-содержащие TFIID комплексы [132]. Другой пример недавних исследований: апоптотический стимул может приводить к альтернативному сплайсингу TAF6, превращающегося в TAF65, который является частью TFIID-подобного комплекса без TAF9 [8]. Эти исследования говорят в пользу того, что различные TFIID комплексы играют специфическую роль в: (1) распознавании различных промоторов, (2) взаимодействии с различным набором общих транскрипционных факторов и (3) опосредовании различных ответов от транскрипционных активаторов к РІС. Существование разных TFIID комплексов также согласуется с открытием, что различные TAFs регулируют только определенный набор специфичных генов.
Корегуляторы
Инициация транскрипции у эукариот нуждается во многих белках, включая генно-специфические транскрипционные факторы, белковые кофакторы и общие факторы транскрипции. Генно-специфические транскрипционные факторы (или активаторы) необходимы для включения специфичной экспрессии генов путем привлечения общих факторов транскрипции, таких как, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH и РНК-полимеразы II, а также хроматиновых кофакторов, таких как АТР-зависимые хроматин ремоделирующие комплексы и гистон ацетилтрансферазы. Эта связь между активаторами и общими факторами транскрипции также нуждается по крайней мере в одном из трех общих кофакторов: Медиаторе, TATA-binding protein (TBP)-associated factors (TAFs) в ТРІЮ или в upsteam stimulatory activity (USA)-BT0pH4Hbix белковых компонентах, таких как положительный кофактор 4 (РС4).
ТВР является транскрипционным фактором, необходимым для всех трех полимераз. В каждом случае ТВР ассоциирован с различным набором факторов. Несколько различных комплексов ТВР были описаны в системах многоклеточных. TFHD является комплексом, специфичным для РНК-полимеразы II и включает ТВР и от 8 до 11 других полипептидов. SL1 комплекс (человек) является специфичным для РНК-полимеразы I и состоит из ТВР и трех TAFs. TFIHB комплекс является специфичным для РНК-полимеразы III и состоит из ТВР и по крайней мере двух дополнительных полипептидов. SNAPc, другой РНК-полимераза Ш ТВР комплекс, необходим для транскрипции генов малых ядерных РНК (snRNA) [51].
Хотя фактора ТВР достаточно для распознавания промотора и последующей сборки других факторов в функциональный РІС, активация транскрипции в системах многоклеточных исследовалась только когда РІС собирался на мультисубъединичном комплексе TFIID. Эти исследования привели к открытию TAFs и гипотезе, что TAFs являются необходимыми медиаторами активации транскрипции [134]. В соответствии с этой гипотезой, одни TAFs напрямую контактируют с активаторными белками, в то время как другие напрямую связываются или с GTFs или с промоторной ДНК. Таким образом, TAFs передают информацию от активатора к основному молекулярному аппарату транскрипции [51].
Биохимические свойства TAFs включают распознавание корового промотора, ацитилтрансферазную активность, которая использует гистоны и другие белки как субстраты, киназную активность, убиквитиновуго активацию, а также коактиваторную функцию, обусловленную белок-белковыми взаимодействиями с гено-специфичными транскрипционными факторами.
Эксперименты in vitro показали, что TAFs необходимы для активации транскрипции некоторыми классами активаторов, но не для базальной транскрипции. TAFs в TFHD действуют коллективно как транскрипционный коактиватор для увеличения активатор-зависимой транскрипции с хроматина [117, 195], для контакта активаторного домена или ДНК-связывающего домена активатора, для привлечения инициированной формы РНК-полимеразы II к промоторной области [193], или чтобы вызвать закручивание ДНК в ТПШ-связывающем промоторном регионе [121]. TAFs также увеличивают вероятность распознавания промотора путем множественных бело к-ДНК взаимодействий с Inr и DPE [16, 181]. Однако TAFs не являются необходимыми ни для активаторной функции, ни для транскрипционной репрессии некоторыми генно-специфическими транскрипционными репрессорами [156].
Хотя сейчас достаточно доказательств для того, чтобы отнести TAFs к посредникам активатор-зависимой транскрипции, некоторые исследования приписывают TAFs другие функции. Например, было найдено, что TAFs стабилизируют связывание TFIID с промотором, посредством специфических контактов с ДНК Inr и DPE, которые присутствуют рядом с сайтом старта транскрипции у определенного числа промоторов. Эти TAF-ДНК взаимодействия могут иметь место у большинства промоторов, но особенно важны у промоторов, не содержащих каноническую TATA последовательность. Недавние исследования показали, что TAFs могут также способствовать активации транскрипции по-другому. Например, наибольшая субъединица TFIID, TAF1 обладает различными ферментативными активностями, включая протеинкиназную и гистон ацетилазную. Было также показано, что TAF1 имеет убиквитин-активирующую и сопряженную активности, которые необходимы для функционирования некоторых активаторов транскрипции в эмбрионах дрозофилы. TAFI также содержит два бромодомена, структурные модули, найденные во многих коактиваторах и факторах, которые вовлечены в ремоделинг хроматина [192].
Было показано, что ТАР дрожжей необходимы для клеточного роста, в то время как некоторые TAF оказались не обязательными для активации транскрипции in vivo. Кроме того, ТАР являются ткане-специфичными коактиваторами, участвующими в привлечении и стабилизации TFIID на коровом промоторе генно-специфическими активаторами.
Первичная структура нескольких TAF имеет определенное сходство с гистонами. Такая гомология последовательностей определяет и сходство структурное: кристаллическая структура TAF9 и ТАР6 дрозофилы обладает сходством с гистоновым тетрамером НЗ-Н4. Хотя гомолога гистона Н2А не было найдено, Н2В-подобный ТАР человека был обнаружен. Это позволяет предположить, что TFIID формирует гистон-подобный октамерный комплекс. ТАР7, ТАР9 и TAF6 дрожжей демонстрируют структурное сходство С гистонами Н2В, НЗ и Н4 соответственно. Несколько других дрожжевых ТАР также содержат мотив гистоновой складки. Кроме того, воссозданный экспериментально ТАР октамер, состоящий из центрального TAF9-TAF6 тетрамера, фланкированного с каждой стороны TAF7-TAF4 димерами, схож с гистоновым октамсром. До сих пор остается неясным существует ли ТАР октамер в нативном TFIED, а также связывает ли ДНК, формируя структуру сходную с гистоновым октамером в нуклеосоме [192]. TAFs присутствуют в мулътибелковых комплексах, не содержащих ТВР
Только общее представление получено о гистоно-подобных TAF. Эти TAF не специфичны для TFIID, но являются компонентами SAGA гистон ацетилтрансферзного комплекса. SAGA включает: TAF9, б и 7, но не двойника Н2А, TAF4. В SAGA комплексе, возможно, также имеется двойник TAF4, Adal; поскольку этот белок содержит мотив гистоновой складки и формирует гетеродимер с TAF7, формируя SAGA-специфичную гистоно-подобную структуру. У высших организмов также были найдены TAF-содержащие комплексы, отличные от TFIID, такие как TFTC, STAGA, PCAF. Гистоно-подобным TAF приписывают роль коровых компонентов множества комплексов [192].
Несколько TAF-содержащих мультибелковых комплексов, не содержащих ТВР, были выделены из дрожжей, дрозофилы и клеток человека [114]. ТВР-не содержащий TAF-coдержащий комплекс (TFTC), как было показано, перемещает TFIID или ТВР на ТАТА-содержащие и ТАТА-не содержащие промоторы in vitro [12, 188].
Ткане-специфичные TAFs и функционально специализированные TFIID комплексы
Полный геномный анализ дрозофилы, человека, C.elegans и дрожжей привел к идентификации многих ортологов и паралогов TAF. Некоторые из них показывают специфичные для клеточного типа паттерны экспрессии в различных тканях [4, 179]. Эти результаты показывают, что TAFs могут способствовать ткан е-специфич ной генной регуляции в организмах многоклеточных. Вопреки большому и еще растущему количеству сообщений о TAFs с различными паттернами экспрессии, только несколько вариантов TAFs изучены в деталях.
Ткане-специфичные свойства TAF4b Млекопитающих
Первая, специфичная для клеточного типа субъединица TFIID, hsTAF4b была открыта в высокодифференцированной человеческой линии В клеток [33]. Анализ первичной аминокислотной последовательности показал, что hsTAF4b близко родственен более широко представленному в организме человека hsTAF4 [172] и его гомологу у дрозофилы dmTAF4 [64]. Экспрессионный анализ выявил, что гомолог этого белка у мыши также экспрессируется ткане-специфично с наивысшим уровнем экспрессии в семенниках и яичниках [43]. Важно, что мышиный TAF4b, является внутренней субъединицей большого комплекса, содержащего и mTAFl и тТВР, обнаруженного в белковом экстракте из яичников. Этот эксперимент подтверждает, что TAF4b действительно является субъединицей специфичного для яичников TFiro [43]. Анализ нокаутных по TAF4b мышей показал, что самки, не имеющие TAF4b жизнеспособны, но стерильны, из-за дефекта фолликулогенеза яичников [43]. Таким образом, ТАР4Ь является специфичным для определенного клеточного типа компонентом транскрипционной машины млекопитающих, которая опосредует экспрессию набора генов, необходимых для корректного фолликулогенеза. Хотя нокаутные по TAF4b мыши не показали дефектов в развитии или функции В-клеток, В-клетки селезенки действительно экспрессируют повышенный уровень TAF4b [33]. Возможно ТАР4Ь функционирует в В клетках таким же образом, как и в гонадах. Кроме того, было показано, что TAF4b взаимодействует с регуляторами В-клеточной транскрипции, такими как: члены NFicB/Rel семейства транскрипционных факторов и ОСА-В, В-клеточного специфического коактиватора [189, 196, 197]. Данные результаты показывают, что функционально специализированный ТАГ4Ь-содержащий TFIID комплекс может взаимодействовать со специфичными коровыми промоторными элементами. Cannon ball необходим для сперматогенеза дрозофилы
Хотя TAF4b был первым обнаруженным ткане-специфичным TAF, который был найден, сейчас кажется очевидным, что существует большое количество специализированных TAFs. Систематические генетические исследования у дрозофилы идентифицировали по крайней мере четыре специфичных для семенников изоформ ТАР. No hitter (nht) родственен TAF4, cannonball (сап) родственен dmTAFS, ryan express (rye) -dmTAF12, meiosis I arrest (mid) - dmTAF6. Экспрессия cannonball является стадия- и ткане-специфичной и ограничивается первичными сперматоцитами, в то время как его прототип dmTAF5 экс пресс ируется повсеместно [60]. Cannonball необходим для экспрессии некоторых генов дифференцировки сперматид [187] и для развития зародышевых клеток у самцов мух [60]. В нуль мутантах cannonball, транскрипция специфичных генов мишеней значительно снижается и, следовательно, прогрессия мейотического клеточного цикла блокируется, что приводит в результате к прекращению дифференцировки сперматид [60]. Эти исследования показывают, что cannonball необходим для транскрипции стадия- и ткане-специфичных генов-мишеней, необходимых для нормального гаметогенеза самцов мух in vivo.
Пока неясно, взаимодействуют ли cannonball и другие специфичные для семенников TAF изоформы с прототипом TAFs для формирования функционально специализированного TFIID комплекса, который инициирует транскрипцию на выбранном наборе промоторов гаметогенеза. Замечательно, однако, что дрозофила имеет, по крайней мере, четыре специфичных для семенников изоформы dTAFs. Возможно, что дрозофила не только обладает ткане-специфичными TAFs, но, и имеет полностью новый функционально специализированный TBP/TAF изокомплекс, который мог бы быть составлен, большей частью, из специфичных для семенников компонентов. TAF1 и TAF10 млекопитающих необходимы для прогрессии клеточного цикла
Биохимическое фракционирование клеточных экстрактов млекопитающих показало различные популяции TFIID, которые отличаются по составу TAF [9]. Интересно, что hsTAFlO, присутствует только в 50% всех TFIID комплексов [71]. Последовательные эксперименты в клетках карциномы мышей показали, что клетки, не имеющие мышиного TAF10, блокируются в Gi/Go фазе клеточного цикла и подвергаются апаптозу [109]. Эти исследования показывают, что TAF10 необходим для экспрессии набора генов, важных для прогрессии клеточного цикла и жизнеспособности в эмбриональных клетках карциномы мышей; однако, специфичные гены-мишени TAF10 остаются неуловимыми и не ясно, служит ли TAF10 действительно как ткане-специфичная или специфичная для клеточного типа субъединица TFIID.
Температура-чувствительная мутация ТАРІ также приводит к остановке клеточного цикла и апаптозу [153, 171]. Экспрессия генов, регулирующих клеточный цикл, таких как циклины A, Dl, D3 и cdc2 снижена, когда tsl3 клетки, несущие мутантный TAF1 растут при ограниченной температуре [168, 183, 184]. Интересно, что ацетилтрансферазная активность TAF1 также ослабляется при ограниченной температуре, и эта каталитическая активность ТАРІ, возможно, необходима для нормальной экспрессии генов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла и апаптоз [35].
Другим примером многообразия ТАР являются альтернативно сплайсированные транскрипты, кодирующие три изоформы hsTAF6 и обозначаемые TAF6a,b,c [185]. TAF6 человека и дрозофилы прямо взаимодействует с TFIID субъединицами [185]. Bell и коллеги [8] выделил другую сплайсоизоформу hsTAP6 (hsTAF6d), которая протеолитически распадается под апоптотическим стимулом. Интересно, что сверхэкспрессия hsTAF6d в HeLa клетках, также как hsTAF6a, вызывает клеточную гибель и, по-видимому, hsTAP6d является частью TFIID-подобного комплекса, не имеющего TAF6 и TAF9 [8]. Это подтверждается экспериментами, показывающими что снижение экспрессии TAF9 в DT40 клетках курицы вызывает апаптоз [20]. Эти исследования показали, что специфические изоформы TAF возможно образуются в результате альтернативного сплайсинга и пост-трансляционных модификаций в ответ на внеклеточные события, которые могут изменить состав и, предположительно, активность TFIID.
К USA относятся: негативный кофактор NC2 и положительные кофакторы, такие как РС1, РС2, РСЗ и РС4, модулирующие уровень транскрипции [76]. РС4, необычный одноцепочечный и двуцепочечный ДНК-связывающий белок с небольшим молекулярным весом около 15 кДа, может действовать как посредник в активатор-зависимой транскрипции [46, 88, 194]. Интересно, что РС4 также действует как репрессор для базальной транскрипции в отсутствие активатора [104, 186, 194]. Репрессия базальной транскрипции РС4 осуществляется путем формирования полного преинициаторного комплекса и может быть облегчена повышением количества TFIID, TFIIH и холоферментом РНК-полимеразы II [79, 104]. Эта двойная активность РС4 является доза-зависимой и может работать синергетически с другими USA-производными кофакторами, такими как РС2 и РСЗ [103].
Медиаторный комплекс
Наибольшим из универсальных кофакторов, которые служат для трансдукции регуляторной информации между ген-специфическими транскрипционными факторами и коровой машиной РНК-полимеразы П, является модульный комплекс, известный как Медиатор. Этот комплекс включает до 25 различных поли пептидных компонентов, которые взаимодействуют с активаторами и репрессорами и трансдуцирутот как позитивную, так и негативную информацию к общим факторам транскрипции. Медиатор может быть выделен в комплексе с РНК-полимеразой II, кроме того, специфичные субъединицы Медиатора взаимодействуют напрямую с различными транскрипционными белками [192].
Первоначально медиаторный комплекс был идентифицирован в дрожжах двумя различными методами. В первом использовали генетический скрининг для супрессоров CTD большой субъединицы дрожжевой РНК-полимеразы П. Эти исследования выявили SRB (suppressors of RNA polymerase В) компоненты, которые постоянно находились в 1-2 МДа комплексе, содержащем субстихиометрические количества РНК-полимеразы II [55, 86, 95, 174]. Во втором случае медиатор изолировали биохимически на основании его способности стимулировать активатор-зависимую транскрипцию in vitro на голых матрицах ДНК и идентифицировали различные белки, такие как Gall, Srb белки, Med белки и Rox3 [84, 116]. Другие эксперименты показали, что медиатор может коиммунопреципитироваться с различными активаторами, а также с CTD РНК-полимеразы II [55, 109].
Были идентифицированы два медиаторных комплекса человека: большой 2 МДа комплекс, обозначаемый как TRAP, DRIP, ARC, SMCC и NAT [11, 40, 41, 70, 117, 137, 138, 167] и малый 500-700 кДа, названный PC2/CRSP [105, 144]. Оба комплекса, как было показано, опосредуют активатор-зависимую транскрипцию in vitro. Кроме того, NAT и SMCC комплексы репрессируют активатор-зависимую транскрипцию, также как и базальную транскрипцию [2, 50, 167]. Tjian и соавторы показывают, что большой комплекс является трапскрипционно инертным, а малый CRSP комплекс является активным на промоторе [169], но эти выводы базируются на экспериментах in vitro и могут не отражать механизмов взаимодействия медиатор-промотор in vivo.
Информация о взаимодействии РНК-полимеразы П с Медиатором была получена из структуры дрожжевого РНК-полимераза П-Медиатор комплекса, в котором Медиатор свернут вокруг задней части РНК-полимерзы II и покрывает небольшую поверхность фермента, которая центрирована на субъединицах Rpb3 и Rpbll [6]. Согласно с этими исследованиями, мутация в Rpb3 затрагивает активатор-зависимую, но не базальную, транскрипцию; кроме того, смх' гетеродимер, который является бактериальным гомологом эукариотического Rpb3-Rpbll гетеродимера, вовлечен во взаимодействие с белками, которые способствуют бактериальной регуляции.
Результирующая модель минимального РІС, показывает, что upsteam промоторная ДНК, TFIIB и ТВР (и возможно другие компоненты ІЮ комплекса) должны быть локализованы между РНК-пол и меразой П и Медиатором, и формируют часть поверхности между этими двумя. Таким образом, РНК-полимераза П и Медиатор не могут достигать промотора как предсформированный комплекс, но должны рекрутироваться независимо
Семейство TRF (ТВР-подобных факторов)
Ранее считалось, что ТВР является универсальным и единственным транскрипционным фактором, необходимым всем трем РНК-полимеразам для распознавания промоторов и инициации транскрипции в эукариотических организмах [18, 62, 72], К процессам с участием ТВР относятся: транскрипция белок-кодирующих генов РНК-полимеразой II, а также рибосомальных РНК и малых ядерных РНК, транскрибируемых РНК-полимеразой I и РНК-полимеразой III соответственно. Кроме того, как было показано, у всех эукариот ТВР является компонентом трех различных мультисубъединичных комплексов инициации транскрипции: SL1, TFHD и TFIIIB, вовлеченных в направленную транскрипцию РНК-полимеразам и 1,11, III [18, 24, 36, 62, 154], В каждом классе инициаторных комплексов, ТВР специфически взаимодействует с ассоциированными белками и/или промоторной ДНК для образования ядра инициаторного комплекса РНК-полимеразы. В случае РНК-полимеразы II, ТВР наряду с TAFs входят в состав ТИП), который может связываться со специфичными коровыми промоторными элементами, такими как TATA бокс, Inr и DPE для формирования активного РІС, содержащего РНК-полимеразу II и общие транскрипционные факторы TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH и TFIIA [19]. Сейчас точно определено , что взаимодействия между инициаторными факторами и различными коровыми элементами определяют сайт старта транскрипции и могут также модулировать силу промотора [161]. Когда РІС был идентифицирован, казалось, что нет необходимости искать дополнительные генно-специфичные или специфичные для клеточного типа субъединицы основного молекулярного аппарата транскрипции. Однако у дрозофилы был найден новый ген, кодирующий белок, близко родственный, но отличающийся от ТВР, впоследствии он был назван TBP-related factor 1, TRF1 [28].
Как оказалось, TRF1 может играть роль ТВР у определенного набора генов, не регулируемых ТВР. Окрашивание эмбрионов дрозофилы in situ выявило, что TRF1 наиболее сильно экспрессируется в клетках нервной системы и гонадах [28, 52]. Биохимические исследования показали, что TRF1, как и ТВР, может специфично взаимодействовать с TFIIA и TFIIB, связываться с TATA боксом ДНК и направлять РНК-пол и меразаП-специфичную транскрипцию in vitro [52]. Как и ТВР, TRF1 является частью большого мультисубъединичного комплекса. Окрашивание политенных хромосом выявило, что в отличие от ТВР, TRF1 ассоциирован с локусами политенных хромосом, которые включают много генов, мутации в которых приводят к стерильности самцов и нарушении в функционировании нервной системы. Однако многие сайты также содержали гены тРНК и 5S РНК. [52]. Эти данные, а также ткане-специфичное распределение TRF1 показали, что TRF1 может быть функциональным гомологом корового транскрипционного фактора ТВР. И, возможно, необходим для управления ткане-специфичной или генно-специфичной транскрипцией у дрозофилы. В других экспериментах было выявлено, что скорее TRFT, чем ТВР ответственен за транскрипцию РНК-полимеразой Ш у дрозофилы. Эксперименты по иммунопреципитации хроматина (СЫР) идентифицировали несколько генов дрозофилы, содержащих промоторы, с которыми связывается TRF1 [65]. Биохимические исследования показали, что TRF1 предпочтительно связывается и направляет транскрипцию с одного или двух тандемных промоторов гена tudor, который вовлечен в регуляцию фертильности самцов дрозофилы. TRF1-связывающий регион был определен при помощи футпринтинга и оказался ТС-богатой областью (ТС box) [65]. Это исследование также показало, что ген tudor имеет второй TBP/TFIID-зависимый промотор, с которым TRP1 не связывается. Такая структура тандемных промоторов является интересным механизмом, по которому альтернативный коровы й промотор, такой как ТС box может управлять экспрессией определенного набора
, РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА генов. Эндогенный TRF1 был изолирован в комплексе с другими белками (предполагаемые TRF1 -ассоциированные факторы). Эти эксперименты показали, что способность TRF1 распознавать специфичные коровые промоторные последовательности происходит не только за счет ДНК-распознающих свойств TRF1. Вполне возможно, что промоторная специфичность TRF1 значительно зависит от ассоциированных с ним субъединиц. Поскольку TRF1 локализован на политенных хромосомах также в локусах тРНК и 5S РНК генов, возможно, что TRF1, как и ТВР, участвует в регуляции транскрипции и РНК-полимеразой II, и РНК-полимеразой III у дрозофилы. Чтобы подтвердить эту гипотезу, была использована транскрипционная система in vitro РНК-полимеразы III дрозофилы. Было показано, что TRF1, скорее всего, играет главную роль в транскрипции РНК-полимеразой ПІ [170]. Это было неожиданным открытием, поскольку у человека, дрожжей и у большинства других эукариот, которые были изучены, ТВР и BRF (TFIIB-related factor) являются необходимыми компонентами для инициации транскрипции РНК-полимеразой III [47]. Последующие эксперименты показали, что BRF является TRFl-ассоциированным фактором, который управляет транскрипцией РНК-полимеразой Ш в клетках дрозофилы. Транскрипция in vitro показала, что комплекс TRF1 :BRF участвует в регуляции транскрипции генов тРНК, 5S и U6 РНК. In vivo, TRP1 в большинстве случаев связан с BRF и эти два белка колокализуются на многих сайтах политенных хромосом, содержащих гены, транскрибируемые РНК-полимеразой III [170]. Однако, количество TRF1, связанного с BRF, отличается в развивающихся эмбрионах дрозофилы и в SL2 клетках дрозофилы. Скорее всего, TRF1 также может работать как промотор-селективный регулятор транскрипции РНК-полимеразой П [65]. Двойная функция TRF1, вероятно, зависит от его ассоциации с различными субъединицами, влияющими на свойства этого корового транскрипционного фактора. Таким образом, многоклеточные организмы, такие как дрозофила могут использовать гомолог основного транскрипционного фактора, такой как TRF1 для ткане-специфичной и/или генно-специфичной транскрипции. TRF2/TLF/TLP
Анализ ESTs привел к открытию еще одного члена семейства TRF - TRF2 (ТВР-related factor 2). Этот фактор был найден в человеке, мыши, дрозофиле, С. elegarts, крысе, Xenopus и у нематоды Brugia malayi [31, 136]. Однако TRF2 не был обнаружен ни в дрожжах ни у архея. Поскольку TLF/TRF2 был вьщелен из различных организмов, этот фактор имеет несколько названий: TBP-related factor 2 (TRF 2; [102]), TBP-like factor (TLF; [31, 77, 178]), TBP-like protein (TLP; [122, 123]). Первичная структура этого белка варьирует у различных видов, но все они содержат консервативный коровый домен, состоящий из двух повторов, общий у всего семейства ТВР подобных факторов. У TRF2 дрозофилы этот домен идентичен коровому домену ТВР на 39 %. Однако, несмотря на то, что ДНК-связывающий домен у всего семейства ТВР высоко консервативен (около 50% идентичности), детальное сравнение последовательностей ТВР и TRF2 показало, что ключевые аминокислоты, необходимые для взаимодействия ТВР с малым желобком ДНК ТАТА бокса, в TRF2 отличаются [30]. Эти данные подтверждаются тем, что рекомбинантный TRF2 не связывает канонический ТАТА бокс [111, 136, 173]. Хотя у TRF2 дрозофилы коровый домен гомологии с ТВР только на 39% идентичен, основания, ответственные за связывание с TFIIA и ТПГВ факторами гомологичны на 60% и на 75%. Таким образом, TRF2, скорее всего, может взаимодействовать с этими компонентами РІС [136,173] и принимать участие в инициации транскрипции РНК-полимеразой II,
Интересно, что когда было создано единое древо ТВР-подобных факторов, все TLF в результате сгруппировались в одну семью, отличную от ТВР. Некоторые виды имеют более одного гена, кодирующего ТВР. Например, архей имеет три гена, и многие, если не все растения имеют два гена tbp. Однако оказалось, что многоклеточные экспрессируют также по крайней мере три различных ТВР-подобных фактора. Дрозофила является единственным известным организмом, имеющим ТВР, TRFT и TRF2. Геном Celegans содержит только два ТВР-подобных фактора (сеТВР и ceTLF), что говорит о том, что TLF появился раньше в эволюции, нежли TRF1 или, что у Celegans произошла потеря TRF1 [31].
Сравнение трех членов ТВР семейства (ТВР, TRFI, TRF2) показало, что ТВР и TRF1 более схожи между собой, чем TRF2, и TRF2 имеет большую гомологию с ТВР , чем с TRF1. Исходя из этих данных можно предположить, что TRF2 дивергировал от ТВР раньше, чем TRP1, и TRF1 эволюционировал позже также от ТВР. Эта гипотеза подтверждается тем, что в дрожжах обнаружен только ТВР, в то время как Celegans содержит ТВР и TRF2, а у дрозофилы есть ТВР, TRF1 и TRF2.
Хотя TRF2 человека и дрозофилы оба содержат консервативный коровый повтор, они имеют различные размеры и доменную структуру. TRF2 человека включает только коровый домен, в то время как TRF2 дрозофилы имеет также N- и С-концевые домены. Коровый повтор у TRF2 человека и TRF2 дрозофилы имеет 55% идентичности. Несколько аминокислотных оснований, консервативных у всех TRF2 белков отличаются от консенсусной последовательности ТВР. Наиболее значимы последовательности DIXIXNVVC и TGSXTVT, располагающиеся около N- и С- концов, соответственно, корового повтора. Эти области участвуют в активации транскрипции в дрожжах. TRF2 необходим для эмбрионального развития и дифференцировки
Изучение TRF2 у С. elegarts и Xenopus привело к разгадке его биологической функции [30, 77, 178]. Нокаут TRF2 в червях и лягушках приводил к гибели организма на ранней стадии эмбрионального развития. Анализ паттерна генной экспрессии показал, что эти эмбрионы не способны экспрессировать обычные маркеры развития, и общий уровень транскрипции РНК-полимеразой П у них снижается. Интересно, что нарушение регуляции генов развития на ранних стадиях эмбриогенеза также приводит к уменьшению экспрессии TRF2 [30]. Дополнительные исследования у Xenopus и zebrajish выявили также, что ТВР и TRF2 необходимы для экспрессии различного набора генов. Эти данные подтверждают, что ТВР и TRF2 могут функционировать дифференцированно для контроля транскрипции специфичного набора генов в клетках животных [113, 178]. TRF2 мыши необходим для сперматогенеза
Нозерн блот анализ показал, что TRF2 человека экспрессируется ткане-специфично и наивысший уровень экспрессии гена наблюдается в семенниках [136]. Чтобы объяснить его потенциальную биологическую функцию был получен TRF2''" нокаут мыши [107, 198]. TRF2'" мыши были жизнеспособны; однако мутантные самцы оказались стерильны из-за позднего ареста в сперматогенезе. Эти данные показывают, что мышиный TRF2, в отличие от TRF2 лягушки или рыбы, возможно, не необходим для эмбрионального развития, но нужен для сперматогенеза. Нозерн блот и ОТ-ПЦР анализ подтвердили, что TRF2~'~ мыши показывают измененный паттерн экспрессии генов, участвующих в сперматогенезе. Таким образом, TRF2, возможно, специфично участвует в транскрипционной регуляции сперматозоидов [107,198].
Функция мышиного TRF2 не совпадает с сильным ранним эмбриональным фенотипом, видимым у Celegans, Xenopus и zebrafish. Хотя члены TRF2 семейства похожи и имеют общий высоко консервативный ДНК-связывающий домен, они значительно варьируют в размерах и доменной архитектуре [31, 136]. Например, человеческий TRF2 сравнительно небольшой и состоит, в основном, из двойного корового повтора, в то время как TRF2 С. elegans и дрозофилы имеют уникальные протяженные С-и N-концевые домены [31, 136]. Эта вариабельность, вероятно, необходима для осуществления специфичных биологических функций у различных видов организмов. Несмотря на все эти исследования in vivo, механизм, по которому TRF2 контролируют транскрипцию, остается не выясненным, и гены-мишени TRF2 пока не идентифицированы. TRF2 управляемая промотор-селективная генная экспрессия у дрозофилы TRF2 дрозофилы, как и ТВР, и TRFI, взаимодействует с общими транскрипционными факторами TFIIA и TFIIB, однако dTRF2 взаимодействует с ДНК, содержащей канонический TATA бокс. Хроматографические исследования показали, что TRF2 является частью макромолекулярного комплекса. TRF2 может быть ассоциирован с новым набором белков, который отличается от ТВР- и TRF1 -ассоциированных факторов [48, 52, 170]. Были идентифицированы TRF2-содержащие комплексы дрозофилы, в которые входят: компоненты NURF хроматин ремодулирующего комплекса, DREF (DNA replication-related element (DRE)-binding factor), и другие белки, которые могут взаимодействовать с хроматином [63]. Биохимический анализ TRF2-COдержащего комплекса выявил TRF2 -специфичные промоторы. Фактор DREF, связывающий промоторный проксимальный элемент ДНК — DRE и вовлеченный в регуляцию клеточного цикла и клеточную пролиферацию генов, оказался связанным с TRF2. [62].
Исследования in vitro показали, что DREF-содержащий TRF2 комплекс участвует в распознавании корового промотора гена PCNA (proliferating cell nuclear antigen) [63]. По механизму, напоминающему связывание TRF1 с тандемными промоторами, PCNA ген также использует два тандемных коровых промотора, которые разделены 63 п.и.. DREF/TRF2 комплекс селективно инициирует транскрипцию с промотора 2, который содержит DREF-связывающий сайт (DRE), в то время как промотор 1 стимулируется комплексом TBP/TFIID [63]. Генный анализ экспрессии идентифицировал несколько дополнительных генов-мишеней TRF2, вовлеченных в репликацию ДНК и клеточную пролиферацию, которые содержат промотор проксимальный элемент DRE [63]. Таким образом, промотор 2 PCNA гена может представлять класс промоторов, которые содрежат DRE элемент [63]. Компьютерный анализ коровых промоторных элементов в геноме дрозофилы определил DRE как один из консервативных потенциальных коровых промоторных элементов [126]. Более того, по имеющимся данным DRE вовлечен в контроль развития глаз, в частности, в переход от клеточной пролиферации к конечной дифференцировке [72]. Эти данные показывают, что TRF2 может функционировать как коровый промотор-селективный фактор, отвечающий за согласованно регулируемую транскрипцию определенного набора генов у дрозофилы.
Был исследован уровень экспрессии TRF2 человека (hTRF2) в различных тканях. Нозерн блот анализ показал наибольший уровень экспрессии гена в тканях семенников. Кроме того, среди остальных тканей большой уровень транскрипции был показан для мозга. TRF2 ассоциирован на хромосомах дрозофилы с локусами, отличными от мест связывания ТВР и TRP1. Иммуноокрашивание политенных хромосом слюнных желез личинки дрозофилы показало, что TRF2 окрашивает следующие сайты: 74EF, 75В, 45F-46А, 55Е, 71DE, 72D, 78D, 85EF, 88D, 93D. Также, более 40 других сайтов показали окрашивание, отличное от фона [136].
Хотя функция TRF2 не ясна, показано, что TRF2 необходим для эмбриогенеза и сперматогенеза. Также была исследована клеточная функция TRF2 на нокаутных клетках цыпленка DT40. TRF2 оказался негативным регулятором клеточного роста. Кроме того, было найдено, что TRF2 присутствует главным образом в цитоплазме и транслоцируется в яцро в G2 фазе. Также, TRF2 рассматривается как фактор, участвующий в регуляции клеточного цикла и при ответе на стресс [155]. TRF3 фактически идентичен С-концевому коровому домену ТВР, включая все основания, участвующие в связывании ДНК, и отвечающие за взаимодействие с другими общими факторами транскрипции. Как и у других членов ТВР семейства, N-концевая область TRF3 дивергировала. Ген trfi присутствует и экспрессируется в Vertebrata от рыб до человека, но отсутствует в геноме Urochordata Ciona intestinalis и у низших эукариот, таких как дрозофила и С. elegans. TRF3 является ядерным белком, который экспрессируется во всех тканях человека и мыши. Несмотря на высокую гомологию с С-концевым коровым доменом ТВР, гель фильтрационный анализ показал, что нативный молекулярный вес комплекса TRF3 меньше, чем ТПГО. Таким образом, TRF3 является высоко консервативным специфичным для позвоночных TRF, чей высоко консервативный паттерн экспрессии и другие свойства отличаются от таковых у ТВР и всех других TRF [130].
Регуляторный ген Drosophila leg-arista-wing complex (lawc)
Ген lawc имеет сложную молекулярно-генетическую структуру и плейотропный фенотип ический эффект. Его слабые мутации нарушают топологию механосенсорных органов (макрохет) у дрозофилы. Редкие более сильные проявления вызывают гомеозисные трансформации и другие дефекты различных органов. Взаимодействие гена lawc с основными пронейральными генами achaete и scute\ а также с гомеобокс-содержащим локусом cut, позволяет считать его одним из важных регуляторов эмбриогенеза дрозофилы [203].
Район локализации /awe-мутаций (7Е) несет инсерцию двух тандемно расположенных копий мобильного Р-элемента [202]. Полученная мутация оказалась слабой и не влияла на жизнеспособность мух, поэтому в этой же лаборатории была скомбинирована с phpl аллелью [7], которая, как было показано, увеличивает проявление мутации. Обе мутации были совмещены с помощью метода генетической рекомбинации. Фенотипический анализ Iawcplphp -компаундов показал, что все они имели очень сильное мутантное проявление гена lawc. У них были сильнотрансформированные аристы, искривленные ноги и слабая жизнеспособность. Слабая lawc мутация не приводит к гибели мух на ранних стадиях и таким образом позволяет исследовать вовлечение lawc в различные процессы развития дрозофилы. У гомозиготных мух выявляются гомеотнческие трансформации сегментов дистальной антенны в соответствующие элементы тарсуса, развитие эктопических щетинок на голове, торакс и скутеллиум, грубые глаза, вырезки крыла на внутреннем крае, и различные дефекты в сегментации ног (соединение сегментов или отсутствие). Мутация не влияет на жизнеспособность мух, однако наблюдается 0.1% пенетрантность для полной трансформации аристы в тарсус и полная пенетрантность для частичных трансформаций, которые проявляются в искривленной и утолщенной аристе. Гомозиготные ph^lawc^1 показывали строгое увеличение мутантного фенотипа: частота трансформаций экстремальной аристы была около 30%, жизнеспособность уменьшалась до 10%, наблюдалась полная стерильность гомозиготных самок и уменьшение фертильности гемизиготных самцов [201].
Объект и задачи исследования
В предыдущих работах у D. metanogaster была получена мутация lawc, вызванная инсерцией Р-элемента и обладающая плейотропным эффектом на фенотип мухи [201, 203]. Было показано, что инсерция Р-элемента произошла в район, расположенный на расстоянии 15 т.п.н. выше места локализации гена trf2, что позволило предположить, что мутация lawc, влияет на экспрессию гена trfl и, возможно, инсерция произошла в транскрибируемую часть гена trf2. Подтверждение данного предположения позволило бы исследовать функцию белка TRF2 у D. melanogaster.
Ген trf2, как было показано ранее, кодирует транскрипционный фактор TRF2 (ТВР related factor 2), имеющий домен гомологичный ДНК-связывающему домену общего фактора транскрипции ТВР (TATA box binding protein). TRF2 имеет гомологов у многих видов эукариот [31, 136]. Локализация TRF2 на политенных хромосомах отличается от сайтов связывания ТВР, Кроме того, TRF2 и ТВР входят в состав комплексов, отличающихся друг от друга по своему белковому составу [136]. Таким образом, можно предположить, что TRF2 и ТВР обладают разными функциями в регуляции транскрипции.
Показано, что у С elegans и Xenopus TRF2 необходим для эмбриогенеза, в то время как у мыши TRF2 не нужен для раннего развития, но необходим для сперматогенеза (Dantonel, 2000; Martianov, 2001). У D .melanogaster была изолирована кДНК tr/2, содержащая открытую рамку считывания (ОРС) для белка длиной 632 ак [136]. Данный белок был охарактеризован на молекулярном уровне. Однако структура гена tr/2 и функция TRF2 у D. melanogaster осталась не исследованной.
Настоящая работа посвящена исследованию структуры гена trJ2 Drosophila melanogaster и функции кодируемого им белка. В ходе исследования предполагалось решить следующие экспериментальные задачи: - определить, является ли lawc мутацией гена tr/2; изучить структуру гена ttf2; изучить белок, кодируемый геном trf2 и исследовать его функции; найти гомологов белка TRF2 у различных видов Drosophila.
3. Материалы и методы
1. Реактивы
Были использованы реактивы фирм Amersham, Serva, Sigma, Fluka, Gibco BRL, Bio-Rad, Fermentas, Invitrogen, Pharmacia, Qiagen, Stratagene.
2. Программное обеспечение Базы данных
В работе была использована база данных дрозофилы FlyBase (www. flybase. org). Поиск гомологов осуществлялся с помощью программы BLAST на сервере NCBI (. ncbi. nlm. nih. gov) [26]. Выравнивание аминокислотных последовательностей проводилось при помощи программы MultAIign (. toulouse. inra. fr/multalin/multalin. html) [147]. Для анализа аминокислотной последовательности были использованы различные сервисы с сервера Atelier Biolnformatique (. up. univ-mrs. fr/~wabim/english/logligne. html).
Для анализа полученных последовательностей также использовалась программа Vector NTI (InforMax).
3. Работа с ДНК
Приготовление компетентных клеток и трансформация. Выделение плазмидной ДНК. Рестрикция, лигирование, переосаждение ДНК, гель-электрофорез
Были использованы методики, описанные в [147] и на сайте . ш. Элюцию ДНК из геля проводили с использованием GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham) по протоколу производителя.
Использовались ферменты фирм Feimentas, Gibco, Promega, Сибэнзим с соответствующими буферами. Для промежуточного клонирования использовали плазмиду pBlueScript SfC (Stratagene).
Для экспрессии рекомбинантных белков использовали вектор рЕТ-28а (Invitrogen) и pQE30, 31 (Qiagen), в которые по сайтам Ncol и Hindlll и по сайтам BamHI и Hindlll соответственно клонировали соответствующие фрагменты белка, кодирующие Ат1 и Атб в рамке с последовательностью, кодирующей б остатков His. ПЦР
Для ПЦР (Полимеразная Цепная Реакция) использовали 10х PCR-буфер следующего состава: 0.1 М Tris-HCI, рН 8,6, 0,5 М KCI, 25 мМ MgCl2, 1 % Triton Х-100. Реакцию проводили в 1х PCR-буфере с добавлением dNTPs до ОД мМ, праймеров до 0,2 мкМ, полимеразы Taq/Pfu (5:1) до 0.05 ед/мкл, 50нг ДНК.
Были использованы следущие праймеры на последовательность гена tr/2, Р- элемента, кодирующую область генов (Ьр и тубулин:
Введение радиоактивной метки в ДНК-зонд
В пробирку помещали 20-100 нг ДНК, 1,5 мкл (dN)u (С~1,7 мкг/мл) и воду из расчёта суммарного объёма 15 мкл. Кипятили 3 мин, охлаждали во льду. Добавляли: 1,5 мкл dA w смесь,0х (0.5 мМ d (С, G, Т) ТР), 1,5 мкл lOxRP-буфера (0,5 М Tris-HCl, рН 7,5, 0,1 М MgCt2, 10 мМ DTT), 1,5 мкл BSA 0.5 мг/мл, 10 мкКю а[Э2Р] dATP, 2 ед. ДНК-полимеразы (Клёнов). Инкубировали при 37С 30-45 мин. Реакцию останавливали введением 5мкл стоп-раствора (50 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 0.5 % SDS, 50 мг/мл ДНК спермы лосося). Меченую ДНК очищали от невключившихся нуклеотидов на Sephadex G-50 колонке.
5. Работа с РНК
Выделение тотальной РНК
Выделение производили с помощью тризола по рекомендациям производителя (Gibco BPvL). Образец ткани гомогенизировали в 1 мл тризола (на 50-100 мг ткани). Добавляли 1/5 хлороформа/объем тризола. Перемешивали и центрифугировали при 12000 g, 15 мин. Отбирали верхнюю фазу. Осаждали РНК из водной фазы 'Л/объема тризола.Осадок отмывали раствором 75% этанола. Осадок высушивали и растворяли в воде.
Очистка polyA+РНК
Тотальную РНК инкубировали в воде 5 мин при 65С, затем быстро охлаждали до комнатной температуры. Добавляли к раствору равный объём 2xCLB (їх: 20 мМ Tris-HCl рН 7,6; 0,5 М NaCl; 1 мМ EDTA; 0,1 % SDS). Полученную смесь наносили на колонку с oligo-dT целлюлозой из расчёта 1 мл на 10 мг РНК. Колонку промывали 5 объемами lxCLB, прогревали колонку 5 мин при 70С и элюировали polyA+ РНК 2 объёмами горячего (70С) ЕВ (10 мМ Tris-HCl рН 7,6; 1 мМ EDTA; 0,05 % SDS). Фракции, содержащие polyA+ РНК, определяли спектрофотометрически (OD26o) и объединяли. РНК переосаждали.
Получение кДНК, ОТ-ПЦР, 5'-, 3 '-RACE
Для получения кДНК брали 1 мкг тотальной РНК и 0,3 мкл ЮмкМ олиго-dT праймера, добавляли воду до 5 мкл, нагревали до 65С, помещали в лёд на несколько минут. Добавляли 2 мкл 5xFSB (їх: 50 мМ Tris-HCl, рН 8,3, 75 мМ КС1, 3 мМ MgCI2), 1 мкл ОД М DTT, 1 мкл 10 мМ dNTPs, 0,3 мкл rRNAzin и 200 ед. Superscript П RT (Invitrogen) и инкубировали 1ч при 42С.
Для проведения 5'-, 3VRACE использовали Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech). Продукты ПЦР были клонированы в pBlueScript SK+ вектор и секвенированы с использованием BigDye Terminator (Applied Biosystems). Нозерн анализ
Проводили электрофоретическое разделение в геле из 0.8 % агарозы в буфере lxFGRB (50х: 1.0 М MOPS рН 7,0; 0.5 М AcONa2; 50 мМ EDTA) с добавлением формальдегида рН 4,0 до 2,2 М. polyA+ РНК (0.5 мкг) смешивали буфер для внесения РНК 1 (на одну пробу 0,2 мкл 50xFGRB; 1,75 мкл 12.3 М формальдегид; 5 мкл 100% формамид; EtBr), инкубировали 15 мин при 65С, помещали в лёд на несколько минут. К каждому образцу добавляли 1/10 объема буфера буфера для внесения РНК 2 (50% глицерин; 1 М EDTA; 0,1 % бромфеноловый синий, 0.1 % ксиленцианол). Проводили 5- минутный префорез при напряжении 5 В/см, наносили образцы и производили дальнейший форез в тех же условиях.
После электрофореза гель отмывали 30 мин., инкубировали гель 30 мин. в том же объёме 20xSSC. Далее ставили 12-часовоЙ капиллярный перенос в SSC той же кратности на мембрану Hybond N (Amersham). Затем фиксировали РНК на мембране ультрафиолетом.
Помещали мембрану в раствор HSB (Ґ) (7 % SDS^ 50 % формамид; 5х SSC; 2 % сухое обезжиренное молоко; 50 мМ NaPi рН 7,0; 0,1 % N-Lauroylsarcosine Na; 50 м кг/мл ДНК спермы лосося) и проводили предгибридизацию 30 мин. при 50С. Затем добавляли в буфер меченный зонд и гибридизовали в течение ночи при 50С. Отмывали мембрану от неспецифически связавшейся метки два раза по 15 мин при 68С в I буфере для отмывки (lxSSC, 0,1 % SDS) и два раза по 25 мин во П буфере (0,3х SSC, 0,1 % SDS) для отмывки при той же температуре.
Для гибридизации использовали соответствующие зонды.
Для визуализации использовали Cyclone Storage Phosphor System (Packard Instrument Company). Для последующих гибридизаций мембрана опускалась на 1 мин в кипящий раствор 0,5 % SDS.
6. Генетические скрещивания, фенотипический анализ trf2 мутантов
Последовательность, содержащая ОРС р!75 (геномная копия, содержащая последовательность, начинающуюся 66 н.п. upsteam от ATG кодона белка р175 и до 184 н.п. downsteam от стоп кодона) была клонирована в pCaSpeR-З вектор по сайтам Nhe I и Xho I. Конструкция была инъецирована в ylwl эмбрионы, как описано в [143, 163]. Количество встроенных копий определяли Саузерн блот анализом, с использованием Р-элемента в качестве зонда. Спасение мутантного фенотипа определялось в скрещивании php,cflawcpl/FM4 самок с y*w' самцами, несущими P{trf2J75) трансген. Были исследована фертильность самок и самцов, а также эмбриональный фенотип phplctntawcPI/FM4-t P{trf2_l 75}/P{trf2_l 75}.
7. Работа с белками
Экспрессия и очистка рекомбинантных белков
Для экспрессии рекомбинантных белков соответствующими конструкциями трансформировали клетки Е, colt BL2I и XL-2, Выросшими колониями инокулировали среду 2YT (с ампицилином 50 мг/мл) и растили клетки до оптической плотности СЮйнрО-б с покачиванием при температуре 30С. Затем индуцировали экспрессию белка добавлением в среду 1PTG до концентрации 1 мМ. Экспрессию проводили в течение 4-6 часов. Клетки осаждали центрифугированием, осадок хранили при -20С.
Из клеточных лизатов при помощи Ni-NTA агарозы выделяли рекомбинатные белки с гистидиновым эпитопом. Сначала клеточный осадок, полученный из 500 мл среды, ресуспендировали в 25 мл LB (50 мМ NaP, рН8,0, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол). Затем добавляли лизоцим до 0,4 мг/мл, инкубировали 30 мин во льду, обрабатывали ультразвуком, центрифугировали 30 мин. на 12000 об/мин, супернатант наносили на колонку с 1 мл Ni-NTA агарозы, инкубировали 1 ч при 4С, Отмывали смолу от несвязавшихся белков 10 мл WB (50 мМ NaPj рН 8,0, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол). Элюировали связавшиеся с Ni-NTA агарозой белки в подходящем объеме ЕВ (50 мМ NaP; рН8,0, 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазол). Фракции, содержащие белок диализовали против раствора, содержащего PBS (1,7 мМ КН2Р04, 5,2 мМ Na:HP04, 150 мМ NaCl) + 20% глицерин.
Получение антител и их очистка
Для получения антител иммунизировали каждые две недели кроликов интердермально смесью 1:1 адъюванта Фрейнда (Sigma) и рекомбинантного белка (0.5 мг). Кровь сливали через 6-8 мес. и получали из нее сыворотку.
Антитела из сыворотки очищали аффинно. Для этого с BrCN-активированной сефарозой (Pharmacia) ковалентно сшивали антиген по методике производителя, полученную матрицу инкубировали с сывороткой, промывали PBS (1,7 мМ КН2Р04, 5,2 мМ Na2HP04, 150мМ NaCl), антитела элюировали раствором, содержащим 0,1 М глицин, рН 2,8. Необходимые фракции объединяли и диализовали против раствора PBS + 20% глицерин.
Белковый гель-электрофорез
Свойства коровых промоторных элементов РНК полимеразы II
Транскрипция белок-кодирующих генов эукариот включает в себя ряд событий, таких как, деконденсацию локуса, ремоделинг нуклеосом, модификации гистонов, связывание транскрипционных активаторов и коактиваторов с энхансерами и промоторами и взаимодействие основного молекулярного аппарата транскрипции с коровым промотором. Внутренний промотор содержит: коровый регион, проксимальный промотор и дистальную энхансерную область. Коровый промотор - это последовательность ДНК, которая располагается на расстоянии -35 п.н. upstream и/или downstream от сайта инициации транскрипции. В основной молекулярный аппарат транскрипции входят: РНК-полимераза II и факторы, которые минимально необходимы для транскрипции in vitro с изолированного корового промотора (основные/общие факторы транскрипции). ТАТА бокс является основным, наиболее изученным коровым промоторным элементом. Стабильный комплекс преинициации транскрипции на ТАТА-зависимых коровых промоторах формируется ассоциацией основных факторов транскрипции в следующем порядке: TFIED/TFIIA, TFIIB, РНК-полимераза II/TFIIF, TFIIE, TFIIH. Свойства основных факторов транскрипции и механизм, по которому они действуют достаточно хорошо изучены. Хотя ранее считалось, что коровые промоторы РНК-полимеразы П неизменны, было обнаружено, что они имеют значительные структурные и функциональные различия. Оказалось, что различные коровые промоторы вносят важный вклад в комбинаторную регуляцию генной экспрессии. TATA бокс
TATA бокс является первым коровым промоторным элементом, обнаруженным в белок-кодирующих генах. Фактически во всех генах, транскрибируемых РНК-полимеразой П, последовательность ТАТААА присутствует на расстоянии 25-30 п.н. upstream от сайта старта транскрипции. Было показано, что мутации в TATA последовательности обычно уменьшают активность клеточных и вирусных промоторов или делают их неактивными [14, 68]. Если инициация транскрипции с мутантного промотора остается заметной, то смещается старт инициации транскрипции, В Saccharomyces cerevisiae, TATA бокс также необходим для инициации транскрипции, но в этом организме данный элемент располагается на расстоянии 40-120 п.н. upstream от сайта старта [165].
Компьютерный анализ базы данных генов Drosophila melanogaster показал, что ТАТААА последовательность или последовательность с одной нуклеотидной заменой в ней представлена в 43% из 205 коровых промоторов или, по другим исследованиям, в 33% из 1941 потенциальных промоторов [89,126].
Было показано, что последовательность 5 ATATAAG-3 является оптимальной для распознавания основным фактором транскрипции ТВР (TATA binding protein) [190]. Однако в других экспериментах было выявлено, что широкое число А/Т-богатых последовательностей могут функционировать как TATA боксы, и взаимодействовать с ТВР. Результаты структурного анализа и статистические данные показали, что для активности TATA бокса три нуклеотида (в позициях 2, 4 и 5) должны оставаться неизменными [161]. Хотя большинство исследований TATA бокса было проведено на дрожжах, дрозофиле и человеке, аналогичные элементы были найдены и в более древних эукариотах, например у архея.
TATA боксы или АТ-богатые последовательности на фиксированном расстоянии upstream от старта начала транскрипции, были найдены практически во всех животных, растениях и грибах, которые были исследованы. Кроме того, ТАТА-подобные последовательности обнаружены у простейших [135]. Однако, несмотря на существование TATA боксов и ТВР у архея, ТАТА-подобные последовательности не выявлены в таких эукариотах, как большинство древнейших паразитов простейших [98].
Механизм, который определяет расстояние от TATA бокса до сайта старта транскрипции, является объектом большого числа исследований [39]. Было найдено, что на изменение расстояния влияют TFITB и РНК-полимераза П [93]. Механизм, по которому ТПГВ и РНК-полимераза П определяют расстояние, неизвестен. Однако было показано, что мутации TFIIB, вызывающие изменение старта транскрипции, меняют также конформацию TFIIB [39]. Возможно, что конформационные изменения сдвигают локализацию каталитического центра РНК-полимеразы II на промоторе. Или, по другой гипотезе - мутации TFIIB вызывают конформационные изменения РНК-полимеразы II, которые мешают правильному позиционированию РНК-полимеразы П на промоторе [199].
Хотя ТВР, по-видимому, является главным ТАТА-связывающим фактором, многоклеточные животные от нематод до человека экспрессируют дополнительные ТАТА-подобные факторы - TRF1 (TBP-related factor 1) и TRF2 (TATA-related factor 2) или TLF (TATA-like factor) [31]. Первый TRF - TRF1, был обнаружен у дрозофилы и является ткане-специфичным регуляторним белком [28]. Этот белок способен связывать консенсус ТАТА бокса, взаимодействует с TFIIA и TFIIB (два основных фактора транскрипции, взаимодействующие с ТВР). У дрозофилы TRF1 является также основным компонентом транскрипционного комплекса РНК-полимеразы HI, TFIIIB, в то время как ТВР является компонентом этого комплекса в других эукариотах [52, 170]. TRF1 образует мультибелковый комплекс с факторами, не входящими в TF1ID комплекс [52]. Эти исследования показали, что TRF1 может быть функционально сходен с ТВР, и вызывает активацию определенного набора белок-кодирующих генов.
Хотя TRF1 был найден только у дрозофилы, второй TRF, TRF2 (также известный как TLF, TLP и TRP) был идентифицирован у нескольких многоклеточных организмов, но не у растений и грибов [31]. TRF2 более сильно отличается от ТВР, чем TRF1, но, вероятно, укладывается в сходную «седловидную» структуру. Взаимодействие с TFIIA и TFIIB сохраняется, но фенилаланины, которые (в ТВР) отвечают за расплетание и выпетливание нити ДНК, в составе TRF2 не обнаружены [31]. В связи с отличием в ДНК-связывающей поверхности, TRF2 не способен связывать TATA боксы [31,77], Цницнаторный элемент (Inr)
Инициаторный элемент является дискретным коровым промоторным элементом, который функционально схож с TATA и может функционировать независимо от TATA бокса [159, 160]. Транскрипция с этого промотора инициирует единственный сайт старта транскрипции. Было показано, что последовательность между -3 и -5 необходима и достаточна для аккуратной транскрипции и in vitro и in vivo [73, 159].
TRF2 управляемая промотор-селективная генная экспрессия у дрозофилы
Анализ ESTs привел к открытию еще одного члена семейства TRF - TRF2 (ТВР-related factor 2). Этот фактор был найден в человеке, мыши, дрозофиле, С. elegarts, крысе, Xenopus и у нематоды Brugia malayi [31, 136]. Однако TRF2 не был обнаружен ни в дрожжах ни у архея. Поскольку TLF/TRF2 был вьщелен из различных организмов, этот фактор имеет несколько названий: TBP-related factor 2 (TRF 2; [102]), TBP-like factor (TLF; [31, 77, 178]), TBP-like protein (TLP; [122, 123]). Первичная структура этого белка варьирует у различных видов, но все они содержат консервативный коровый домен, состоящий из двух повторов, общий у всего семейства ТВР подобных факторов. У TRF2 дрозофилы этот домен идентичен коровому домену ТВР на 39 %. Однако, несмотря на то, что ДНК-связывающий домен у всего семейства ТВР высоко консервативен (около 50% идентичности), детальное сравнение последовательностей ТВР и TRF2 показало, что ключевые аминокислоты, необходимые для взаимодействия ТВР с малым желобком ДНК ТАТА бокса, в TRF2 отличаются [30]. Эти данные подтверждаются тем, что рекомбинантный TRF2 не связывает канонический ТАТА бокс [111, 136, 173]. Хотя у TRF2 дрозофилы коровый домен гомологии с ТВР только на 39% идентичен, основания, ответственные за связывание с TFIIA и ТПГВ факторами гомологичны на 60% и на 75%. Таким образом, TRF2, скорее всего, может взаимодействовать с этими компонентами РІС [136,173] и принимать участие в инициации транскрипции РНК-полимеразой II,
Интересно, что когда было создано единое древо ТВР-подобных факторов, все TLF в результате сгруппировались в одну семью, отличную от ТВР. Некоторые виды имеют более одного гена, кодирующего ТВР. Например, архей имеет три гена, и многие, если не все растения имеют два гена tbp. Однако оказалось, что многоклеточные экспрессируют также по крайней мере три различных ТВР-подобных фактора. Дрозофила является единственным известным организмом, имеющим ТВР, TRFT и TRF2. Геном Celegans содержит только два ТВР-подобных фактора (сеТВР и ceTLF), что говорит о том, что TLF появился раньше в эволюции, нежли TRF1 или, что у Celegans произошла потеря TRF1 [31].
Сравнение трех членов ТВР семейства (ТВР, TRFI, TRF2) показало, что ТВР и TRF1 более схожи между собой, чем TRF2, и TRF2 имеет большую гомологию с ТВР , чем с TRF1. Исходя из этих данных можно предположить, что TRF2 дивергировал от ТВР раньше, чем TRP1, и TRF1 эволюционировал позже также от ТВР. Эта гипотеза подтверждается тем, что в дрожжах обнаружен только ТВР, в то время как Celegans содержит ТВР и TRF2, а у дрозофилы есть ТВР, TRF1 и TRF2.
Хотя TRF2 человека и дрозофилы оба содержат консервативный коровый повтор, они имеют различные размеры и доменную структуру. TRF2 человека включает только коровый домен, в то время как TRF2 дрозофилы имеет также N- и С-концевые домены. Коровый повтор у TRF2 человека и TRF2 дрозофилы имеет 55% идентичности. Несколько аминокислотных оснований, консервативных у всех TRF2 белков отличаются от консенсусной последовательности ТВР. Наиболее значимы последовательности DIXIXNVVC и TGSXTVT, располагающиеся около N- и С- концов, соответственно, корового повтора. Эти области участвуют в активации транскрипции в дрожжах. TRF2 необходим для эмбрионального развития и дифференцировки
Изучение TRF2 у С. elegarts и Xenopus привело к разгадке его биологической функции [30, 77, 178]. Нокаут TRF2 в червях и лягушках приводил к гибели организма на ранней стадии эмбрионального развития. Анализ паттерна генной экспрессии показал, что эти эмбрионы не способны экспрессировать обычные маркеры развития, и общий уровень транскрипции РНК-полимеразой П у них снижается. Интересно, что нарушение регуляции генов развития на ранних стадиях эмбриогенеза также приводит к уменьшению экспрессии TRF2 [30]. Дополнительные исследования у Xenopus и zebrajish выявили также, что ТВР и TRF2 необходимы для экспрессии различного набора генов. Эти данные подтверждают, что ТВР и TRF2 могут функционировать дифференцированно для контроля транскрипции специфичного набора генов в клетках животных [113, 178]. TRF2 мыши необходим для сперматогенеза
Нозерн блот анализ показал, что TRF2 человека экспрессируется ткане-специфично и наивысший уровень экспрессии гена наблюдается в семенниках [136]. Чтобы объяснить его потенциальную биологическую функцию был получен TRF2 " нокаут мыши [107, 198]. TRF2 " мыши были жизнеспособны; однако мутантные самцы оказались стерильны из-за позднего ареста в сперматогенезе. Эти данные показывают, что мышиный TRF2, в отличие от TRF2 лягушки или рыбы, возможно, не необходим для эмбрионального развития, но нужен для сперматогенеза. Нозерн блот и ОТ-ПЦР анализ подтвердили, что TRF2 мыши показывают измененный паттерн экспрессии генов, участвующих в сперматогенезе. Таким образом, TRF2, возможно, специфично участвует в транскрипционной регуляции сперматозоидов [107,198].
Функция мышиного TRF2 не совпадает с сильным ранним эмбриональным фенотипом, видимым у Celegans, Xenopus и zebrafish. Хотя члены TRF2 семейства похожи и имеют общий высоко консервативный ДНК-связывающий домен, они значительно варьируют в размерах и доменной архитектуре [31, 136]. Например, человеческий TRF2 сравнительно небольшой и состоит, в основном, из двойного корового повтора, в то время как TRF2 С. elegans и дрозофилы имеют уникальные протяженные С-и N-концевые домены [31, 136]. Эта вариабельность, вероятно, необходима для осуществления специфичных биологических функций у различных видов организмов. Несмотря на все эти исследования in vivo, механизм, по которому TRF2 контролируют транскрипцию, остается не выясненным, и гены-мишени TRF2 пока не идентифицированы. TRF2 управляемая промотор-селективная генная экспрессия у дрозофилы
TRF2 дрозофилы, как и ТВР, и TRFI, взаимодействует с общими транскрипционными факторами TFIIA и TFIIB, однако dTRF2 взаимодействует с ДНК, содержащей канонический TATA бокс. Хроматографические исследования показали, что TRF2 является частью макромолекулярного комплекса. TRF2 может быть ассоциирован с новым набором белков, который отличается от ТВР- и TRF1 -ассоциированных факторов [48, 52, 170]. Были идентифицированы TRF2-содержащие комплексы дрозофилы, в которые входят: компоненты NURF хроматин ремодулирующего комплекса, DREF (DNA replication-related element (DRE)-binding factor), и другие белки, которые могут взаимодействовать с хроматином [63]. Биохимический анализ TRF2-COдержащего комплекса выявил TRF2 -специфичные промоторы. Фактор DREF, связывающий промоторный проксимальный элемент ДНК — DRE и вовлеченный в регуляцию клеточного цикла и клеточную пролиферацию генов, оказался связанным с TRF2. [62].
Исследования in vitro показали, что DREF-содержащий TRF2 комплекс участвует в распознавании корового промотора гена PCNA (proliferating cell nuclear antigen) [63]. По механизму, напоминающему связывание TRF1 с тандемными промоторами, PCNA ген также использует два тандемных коровых промотора, которые разделены 63 п.и.. DREF/TRF2 комплекс селективно инициирует транскрипцию с промотора 2, который содержит DREF-связывающий сайт (DRE), в то время как промотор 1 стимулируется комплексом TBP/TFIID [63]. Генный анализ экспрессии идентифицировал несколько дополнительных генов-мишеней TRF2, вовлеченных в репликацию ДНК и клеточную пролиферацию, которые содержат промотор проксимальный элемент DRE [63]. Таким образом, промотор 2 PCNA гена может представлять класс промоторов, которые содрежат DRE элемент [63]. Компьютерный анализ коровых промоторных элементов в геноме дрозофилы определил DRE как один из консервативных потенциальных коровых промоторных элементов [126].
Приготовление компетентных клеток и трансформация. Вьщеление плазмидной ДНК
Выделение производили с помощью тризола по рекомендациям производителя (Gibco BPvL). Образец ткани гомогенизировали в 1 мл тризола (на 50-100 мг ткани). Добавляли 1/5 хлороформа/объем тризола. Перемешивали и центрифугировали при 12000 g, 15 мин. Отбирали верхнюю фазу. Осаждали РНК из водной фазы Л/объема тризола.Осадок отмывали раствором 75% этанола. Осадок высушивали и растворяли в воде.
Тотальную РНК инкубировали в воде 5 мин при 65С, затем быстро охлаждали до комнатной температуры. Добавляли к раствору равный объём 2xCLB (їх: 20 мМ Tris-HCl рН 7,6; 0,5 М NaCl; 1 мМ EDTA; 0,1 % SDS). Полученную смесь наносили на колонку с oligo-dT целлюлозой из расчёта 1 мл на 10 мг РНК. Колонку промывали 5 объемами lxCLB, прогревали колонку 5 мин при 70С и элюировали polyA+ РНК 2 объёмами горячего (70С) ЕВ (10 мМ Tris-HCl рН 7,6; 1 мМ EDTA; 0,05 % SDS). Фракции, содержащие polyA+ РНК, определяли спектрофотометрически (OD26o) и объединяли. РНК переосаждали.
Для получения кДНК брали 1 мкг тотальной РНК и 0,3 мкл ЮмкМ олиго-dT праймера, добавляли воду до 5 мкл, нагревали до 65С, помещали в лёд на несколько минут. Добавляли 2 мкл 5xFSB (їх: 50 мМ Tris-HCl, рН 8,3, 75 мМ КС1, 3 мМ MgCI2), 1 мкл ОД М DTT, 1 мкл 10 мМ dNTPs, 0,3 мкл rRNAzin и 200 ед. Superscript П RT (Invitrogen) и инкубировали 1ч при 42С.
Для проведения 5 -, 3VRACE использовали Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech). Продукты ПЦР были клонированы в pBlueScript SK+ вектор и секвенированы с использованием BigDye Terminator (Applied Biosystems). Нозерн анализ
Проводили электрофоретическое разделение в геле из 0.8 % агарозы в буфере lxFGRB (50х: 1.0 М MOPS рН 7,0; 0.5 М AcONa2; 50 мМ EDTA) с добавлением формальдегида рН 4,0 до 2,2 М. polyA+ РНК (0.5 мкг) смешивали буфер для внесения РНК 1 (на одну пробу 0,2 мкл 50xFGRB; 1,75 мкл 12.3 М формальдегид; 5 мкл 100% формамид; EtBr), инкубировали 15 мин при 65С, помещали в лёд на несколько минут. К каждому образцу добавляли 1/10 объема буфера буфера для внесения РНК 2 (50% глицерин; 1 М EDTA; 0,1 % бромфеноловый синий, 0.1 % ксиленцианол). Проводили 5- минутный префорез при напряжении 5 В/см, наносили образцы и производили дальнейший форез в тех же условиях.
После электрофореза гель отмывали 30 мин., инкубировали гель 30 мин. в том же объёме 20xSSC. Далее ставили 12-часовоЙ капиллярный перенос в SSC той же кратности на мембрану Hybond N (Amersham). Затем фиксировали РНК на мембране ультрафиолетом.
Помещали мембрану в раствор HSB (Ґ) (7 % SDS 50 % формамид; 5х SSC; 2 % сухое обезжиренное молоко; 50 мМ NaPi рН 7,0; 0,1 % N-Lauroylsarcosine Na; 50 м кг/мл ДНК спермы лосося) и проводили предгибридизацию 30 мин. при 50С. Затем добавляли в буфер меченный зонд и гибридизовали в течение ночи при 50С. Отмывали мембрану от неспецифически связавшейся метки два раза по 15 мин при 68С в I буфере для отмывки (lxSSC, 0,1 % SDS) и два раза по 25 мин во П буфере (0,3х SSC, 0,1 % SDS) для отмывки при той же температуре.
Для гибридизации использовали соответствующие зонды. Для визуализации использовали Cyclone Storage Phosphor System (Packard Instrument Company). Для последующих гибридизаций мембрана опускалась на 1 мин в кипящий раствор 0,5 % SDS.
Последовательность, содержащая ОРС р!75 (геномная копия, содержащая последовательность, начинающуюся 66 н.п. upsteam от ATG кодона белка р175 и до 184 н.п. downsteam от стоп кодона) была клонирована в pCaSpeR-З вектор по сайтам Nhe I и Xho I. Конструкция была инъецирована в ylwl эмбрионы, как описано в [143, 163]. Количество встроенных копий определяли Саузерн блот анализом, с использованием Р-элемента в качестве зонда. Спасение мутантного фенотипа определялось в скрещивании php,cflawcpl/FM4 самок с y w самцами, несущими P{trf2J75) трансген. Были исследована фертильность самок и самцов, а также эмбриональный фенотип phplctntawcPI/FM4 P{trf2_l 75}/P{trf2_l 75}.
Для экспрессии рекомбинантных белков соответствующими конструкциями трансформировали клетки Е, colt BL2I и XL-2, Выросшими колониями инокулировали среду 2YT (с ампицилином 50 мг/мл) и растили клетки до оптической плотности СЮйнрО-б с покачиванием при температуре 30С. Затем индуцировали экспрессию белка добавлением в среду 1PTG до концентрации 1 мМ. Экспрессию проводили в течение 4-6 часов. Клетки осаждали центрифугированием, осадок хранили при -20С.
Из клеточных лизатов при помощи Ni-NTA агарозы выделяли рекомбинатные белки с гистидиновым эпитопом. Сначала клеточный осадок, полученный из 500 мл среды, ресуспендировали в 25 мл LB (50 мМ NaP, рН8,0, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол). Затем добавляли лизоцим до 0,4 мг/мл, инкубировали 30 мин во льду, обрабатывали ультразвуком, центрифугировали 30 мин. на 12000 об/мин, супернатант наносили на колонку с 1 мл Ni-NTA агарозы, инкубировали 1 ч при 4С, Отмывали смолу от несвязавшихся белков 10 мл WB (50 мМ NaPj рН 8,0, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол). Элюировали связавшиеся с Ni-NTA агарозой белки в подходящем объеме ЕВ (50 мМ NaP; рН8,0, 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазол). Фракции, содержащие белок диализовали против раствора, содержащего PBS (1,7 мМ КН2Р04, 5,2 мМ Na:HP04, 150 мМ NaCl) + 20% глицерин.
Для получения антител иммунизировали каждые две недели кроликов интердермально смесью 1:1 адъюванта Фрейнда (Sigma) и рекомбинантного белка (0.5 мг). Кровь сливали через 6-8 мес. и получали из нее сыворотку. Антитела из сыворотки очищали аффинно. Для этого с BrCN-активированной сефарозой (Pharmacia) ковалентно сшивали антиген по методике производителя, полученную матрицу инкубировали с сывороткой, промывали PBS (1,7 мМ КН2Р04, 5,2 мМ Na2HP04, 150мМ NaCl), антитела элюировали раствором, содержащим 0,1 М глицин, рН 2,8. Необходимые фракции объединяли и диализовали против раствора PBS + 20% глицерин.
Локализация на политенных хромосомах слюнных желез Drosophila melanogaster
В данной работе был изучен ген tr/2 D. melanogaster и кодируемый им транскрипционный фактор TRF2. TRF2 имеет домен, гомологичный ДНК связывающему домену основного транскрипционного фактора ТВР, однако не связывается с TATA-промотором. Логично было бы предположить, что TRF2 активирует экспрессию определенной группы промоторов. Однако до сих пор не было показано, что TRF2 способен связываться с какой-либо специфичной последовательностью ДНК. Таким образом, молекулярный механизм действия TRF2 и его функция у высших эукариот представляют большой интерес и во многом остаются неясными.
Ранее генетическими методами у дрозофилы была обнаружена мутация lawc (leg-arista-wing complex), вызванная инсерцией Р-элемента в районе 7Е 6-8 X хромосомы и вызывающая плейотропный эффект на фенотип мухи. В данной работе был проведен молекулярный анализ мутации lawc. Было показано, что инсерция Р-элемента вызвавшая мутацию, произошла в транскрибируемую некодирующую область гена (г/2, и встраивание Р-элемента значительно понижает уровень транскрипции гена tr/2 и изменяет длину его транскриптов. Таким образом, было показано, что мутация lawc является первой изолированной мутацией гена tr/2. Изолированная мутация дала возможность исследовать значение белка TRF2 для развития D. melanogaster.
Для изучения структуры гена tr/2 нами был изолирован кДНК клон, который на 5056 н.п. длиннее, чем кДНК клон tr/2 описанный ранее. Сравнение кДНК данного клона, длиной 7.2 т.п.н. и геномной копии гена tr/2 показало, что ген состоит из одинадцати экзонов (три экзона находятся в 5 нетранслируемой области и инсерция Р-элемента произошла во второй экзон), и кодирует открытую рамку считывания белка, длиной 1715 ак, Нозерн блот гибридизация выявляет несколько транскриптов, соответствующих tr/2, длиной 11.2 т.п.н., 9.5 т.п.н,, 7.8 т.п.н., 7.2 т.п.н. (11.2 т.п.н, 7.8 т.п.н., 7.2 т.п.н у самцов, 11.2 т.п.н., 9.5 т.п.н., 7.8 т.п.н. у самок). Таким образом, изолированный клон оказывается короче большинства обнаруженных мРНК. Мы не проводили клонирования и точного определения последовательности каждого из этих транскриптов. Однако наши данные указывают, что они отличаются нетранслируемыми 5 и 3 - концевыми областями.
Ранее был показан ткане-специфичный паттерн экспрессии гомологов tr/2 у человека и мыши [107, 136, 198]. В данной работе показано, что ген D.melanogaster также обладает ткане-специфичной экспрессией: транскрипт длиной 11,2 т.п.н. экспрессируется в голове мух и транскрипты длиной 7.8 т.п.н. и 9.5 т.п.н. - в гонадах. Транскрипт, длиной 7.2 т.п.н., выявляемый зондом к открытой рамке считывания TRF2, также является специфичным для гонад. Этот транскрипт не содержит области инсерции Р-элемента, и мутация не изменяет его длину. В то же время уровень экспрессии этого транскрипта у мутантных мух уменьшается. Скорее всего, существует сложная многоуровневая регуляция экспрессии гена tr/2, который, по нашим предварительным данным, имеет два промотора.
Изолированный кДНК клон содержит открытую рамку считывания для белка, длиной 1715 ак, что позволило предположить, что наряду с TRF2, описанным ранее, существует более длинная форма этого белка. В данной работе действительно было выявлено два белка TRF2: белок с молекулярной массой 75 кДа, который, как мы показали, соответствует описанному [136], и новый белок с молекулярной массой 175 кДа. По сравнении с р75, р175 имеет дополнительную длинную N-концевую последовательность. Наиболее вероятно, что существование двух белков является результатом альтернативного сплайсинга мРНК trf2. Однако полученные данные не позволяют исключить и того, что р75 является результатом протеолиза р175. Обе изоформы TRF2 присутствуют в эмбриональных экстрактах и связывают те же сайты на политенных хромосомах. Отсутствие специфичных сайтов для р75 на политенных хромосомах показывает, что обе изоформы имеют те же гены мишени. Наши эксперименты не выявили разницы в локализации двух форм белка на политенных хромосомах, что указывает на сходство их функций. Однако р175 и р75 присутствуют в белковых комплексах с разной молекулярной массой и с различными биохимическими свойствами. Вероятно, это объясняется тем, что coiled-coil мотивы, найденные в N-концевой части р175 взаимодействуют с другими белками. Ранее было показано, что мотив coiled-coil, найденный в большом количестве транскрипционных факторов, участвует как в димеризации белка, так и в белок-белковых взаимодействиях [85].
В работе были найдены гомологи TRF2 у отдельных видов Drosophila: Drosophila erecta, Drosophila yakuba, Drosophila ananassae, Drosophila mojavensis, Drosophila pseudoobscura, Drosophila virilis. Все белки имеют высококонсервативные С-концевые домены гомологичные ТВР (84% гомологии), Виды близкородственные Drosophila melanogaster (Drosophila erecta, Drosophila yakuba, Drosophila ananassae) также имеют высокую гомологию в N-концевой части белка и имеют домены coiled-coil. Однако у более эволюционно отдаленных видов Drosophila: Drosophila mojavensis, Drosophila pseudoobscura, Drosophila virilis N-концевой домен отсутствует. Возможно, при этом теряются некоторые свойства TRF2, изменяется его ткане-специфичность или участие в некоторых комплексах, TRF2 Drosophila pseudoobscura отличается от всех остальных белков, поскольку его гомология с TRF2 других исследованных видов несколько ниже. У видов Drosophila mojavensis и Drosophila virilis появилось по два гомолога TRF2 (длинной 387 ак и 697 ак у Drosophila virilis; 442 ак и 656 ак у Drosophila mojavensis). Эти белки попарно сходны между собой: 387 ак Drosophila virilis и 442 ак Drosophila mojavensis; 697 ак Drosophila virilis и 656 ак Drosophila mojavensis. Белки D. virilis 1 и D. mojavensis 2 имеют на С-конце Zn-finger ДНК-связывающий домен. Возможно, отсутствие N-концевого участка в этих белках компенсируется данным доменом или же эти белки приобретают дополнительные свойства. Белки D. virilis 2 и D. mojavensis 1 также очень схожи между собой, но TRF2 D. virilis 2 имеет трансмембранный домен, которого не было найдено в D. mojavensis 1. Наличие у видов Drosophila mojavensis и Drosophila virilis двух белков TRF2, скорее всего обладающих разной специфичностью и свойствами, возможно, отражает бифункциональность TRF2 Drosophila melanogaster, имеющего, как было нами показано, два белка, различных по молекулярной массе и биохимическим свойствам.
