Содержание к диссертации
Введение
1. Инициация транскрипции рнк-полимеразой п у эукариот 5
1.1 РНК-полимераза П 5
1.2 Локусы контроля транскрипции генов класса II 6
1.3 Базальная транскрипция. Общие факторы транскрипции 10
1.4 Специфические факторы транскрипции: активаторы и репрессоры 14
1.5 Корегуляторы 15
2. Хроматин 18
2.1 Структура хроматина. Модификации гистонов 18
2.2 Структурные и биохимические особенности гетерохроматина 23
2.3 Гетерохроматин и транскрипция. Эффект положения гена 26
2.4 Белковые комплексы, изменяющие структуру хроматина 31
3. Ядерные рецепторы 41
3.1 Строение и механизмы действия ядерных рецепторов 41
3.2 Ядерные рецепторы и гормональная сигнализация у D. melanogaster 46
3.3 Корегуляторы ядерных рецепторов 55
2 Материалы и методы 62
1. Материалы 62
1.1 Штаммы и вектора S. cerevisiae и Е. coli, использованные в работе 62
1.2 Библиотека кДНК 62
1.3 Дрожжевые и бактериальные среды 62
1.4 Ферменты и реактивы 63
1.5Праймеры 63
1.6 Конструкции для анализа активации репортерных генов в дрожжах 64
1.7 Конструкции pBait для двухгибридного анализа 64
1.8 Конструкция для экспрессии фрагмента белка Нг46 для получения поликлональных антител 65
1.9 Конструкции для анализа функций доменов белка SAYP in vivo 65
2. Методы 65
2.1 Работа с дрожжами. Скрининг библиотеки кДНК в двухгибридной системе 65
2.2 Работа с ДНК 70
2.3 Работа с белками 74
2.4 Работа с D. melanogaster 78
2.5 Использованное программное обеспечение 80
3 Результаты 81
1. Изучение роли SAY-домена белка SAYP в активации транскрипции в дрожжах 81
2. Изучение влияния белка SAYP на транскрипцию в гетерохроматине 83
3. Изучение влияния SAY-домена белка SAYP на выживаемости и активацию транскрипции и vivo 85
4. Изучение роли PHD-доменов белка SAYP в репрессии транскрипции в гетерохроматине 88
5. Поиск белков, взаимодействующих с SAYP в двухгибридной системе 88
6. Подтверждение взаимодействия SAYP и Hr46(DHR3) 91
Обсуждение результатов 94
Выводы 104
- Хроматин
- Ядерные рецепторы
- Конструкции для анализа активации репортерных генов в дрожжах
- Изучение роли PHD-доменов белка SAYP в репрессии транскрипции в гетерохроматине
Введение к работе
Реализация наследственной информации клетки является объектом пристального изучения современной науки. Этот сложный многостадийный процесс лежит в основе жизнедеятельности и развития всех живых организмов. Механизмы экспрессии генов активно изучаются с помощью методов молекулярной биологии и генетики. Молекулярный аппарат клетки, осуществляющий чтение и реализацию генетической информации, необычайно сложно устроен. Помимо фундаментального значения, исследования в данной области имеют обширное практическое применение в медицине, фармакологии, биотехнологии, селекции.
Считается, что именно первый этап экспрессии генов — транскрипция — является наиболее важным в регуляции всего процесса. У эукариот различные наборы генов транскрибируются специализированными РНК-полимеразами; гены, кодирующие мРНК, транскрибируются РНК-полимеразоЙ II. Многочисленные исследования показали, что на активацию транскрипции РНК-полимеразой II влияют несколько дискретных, контролируемых процессов; изменение структуры хроматина, изменение локализации гена внутри ядра и привлечение на промотор гена мультибелковых комплексов, активность которых определяется специфическими межмолекулярными взаимодействиями. К настоящему моменту исследовано большое количество разнообразных факторов, формирующих аппарат транскрипции. Выделяют общие факторы транскрипции - консервативные в эволюции белки, необходимые для экспрессии большинства генов, специфические факторы транскрипции (активаторы и репрессоры) и так называемые корегуляторы (коактиваторы и корепрессоры). Последние осуществляют связь между специфическими и общими факторами транскрипции, а также изменяют структуру хроматина (Emerson, 2002).
Большое количество исследований в настоящее время посвящено описанию новых и детальному изучению уже известных факторов транскрипции. Имеющаяся на данный момент картина работы молекулярного аппарата транскрипции постоянно детализируется и корректируется.
В данной работе были изучены функции нового мультидоменного коактиватора транскрипции РНК полимеразы II высших эукариот SAYP (Е(у)З) и проведен поиск взаимодействующих с ним белков. Показано, что SAYP является бифункциональным фактором и участвует в активации транскрипции в эухроматине и репрессии транскрипции в гетерохроматине. Показано, что SAY-домен белка SAYP отвечает за активацию транскрипции в эухроматине, а PHD-домены — за репрессию транскрипции в гетерохроматине, В дрожжевой двухгибридной системе обнаружен ряд белков, взаимодействующих с SAYP, среди них — транскрипционный регулятор Нг46. Взаимодействие SAYP и Нг4б подтверждено при помощи других биохимических и генетических методов. Т.о. в работе изучен новый важный участник процесса регуляции транскрипции высших эукариот.
Хроматин
Таким образом, ключевым моментом инициации транскрипции РоШ является сборка сложного мультибелкового комплекса в районе промотора. Для того, чтобы эта сборка успешно осуществилась, в промоторной области не должно быть посторонних белков. Это условие не всегда выполняется, так как ДНК находится в клетке в комплексе с множеством белков, формируя структуру, называемую хроматином. Разные районы хроматина отличаются разной степенью компактизации, ковалентними модификациями ДНК и гистонов. В составе эукариотического генома выделяют два основных типа хроматина: эухроматин и гетерохроматин. В эухроматине локализуется большая часть уникальных генов (1 копия в геноме). Эухроматин деконденсирован в интерфазе клеточного цикла, что способствует своевременной экспрессии содержащихся в нём генов. Эухроматин по большей части локализуется в плечах хромосом. В противоположность эухроматину, гетерохроматин находится главным образом в центромерной и теломерной областях и реже в плечах хромосом (интеркалярный гетерохроматин). Гетерохроматин остаётся конденсированным в течение всего клеточного цикла и реплицируется позднее эухроматина. Гетерохроматиновые участки бедны генами: по большей части они содержат повторы и множественные инсерции мобильных элементов. Каждый тип клеток эукриотического организма обладает уникальным паттерном упаковки генома в эухроматин и гетерохроматин. Этот паттерн определяет, какие именно гены будут транскрибироваться в данной клетке, и сохраняется в дочерних клетках (Патрушев, 2000; Orphanides & Reinberg, 2002). Элементарной единицей хроматина является нуклеосома. Нуклеосома представляет собой ДНК длиной 146 п.н., образующую 1,65 витка вокруг белкового октамера, содержащего по две молекулы гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4 (Luger et alt 1997). Гистоны — это небольшие положительно заряженные белки, высококонсервативные у эукариот. Именно они играют ключевую роль в формировании хроматина. Структура нуклеосом может несколько изменяться за счет замены гистонов так называемыми вариантами гистонов.
Варианты гистонов обладают функциями, отличными от таковых у главных гистонов. Наиболее изученными являются: CENP-A - характерный для центромерного района вариант гистона НЗ, гистон H2A.Z, характерный для эухроматина, и гистон Н2АХ, который фосфорилируется в ответ на двухцепочечнык разрывы ДНК (Morales et al, 2001). Образование нуклеосом является первым уровнем компактизации ДНК, при этом формируется хроматиновая фибрилла диаметром 10 нм; в ней ДНК становится компактнее в 6-7 раз. Далее при участии гистона HI формируется 30 нм фибрилла, в результате чего ДНК уплотняется еще в 20-50 раз. Дальнейшая компактизация состоит в упаковке ДНК в петли и домены и осуществляется посредством взаимодействия нуклеосом друг с другом и с рядом негистоновых белков. Существует большое количество гипотез, объясняющих механизмы этих процессов, но до сих пор нет единого мнения на этот счет. Однако нет сомнений в том, что структура нуклеосомы играет главную роль в укладке ДНК на всех уровнях (Карпов, 2005). Большое функциональное значение имеют ковалентные модификации гистонов. Молекула любого гистона содержит центральный высококонсервативный трехспиральный домен и N-концевой неструктурированный участок, содержащий 15-30 а. о., называемый «хвостом» гистона. Спиральные домены взаимодействуют между собой, образуя ядро нуклеосомы. N-концевые "хвосты" гистонов имеют положительный заряд и очень подвижны. Выступая поверх не только нуклеосомы, но даже хроматиновой фибриллы, они подвергаются многочисленным модификациям. Среди них можно отметить ацетилирование, фосфорилирование, метилирование, АДФ-рибозилирование и присоединение белка убиквитина (Kouzarides, 2003). Эти модификации изменяют заряд, гидрофобность и другие свойства поверхности белковых глобул (Narlikar et al., 2002). Поскольку «хвосты» гистонов участвуют в межнуклеосомньгх взаимодействиях, за счет модификаций хроматиновая фибрилла разрыхляется или, наоборот, уплотняется. Это, в свою очередь, облегчает или затрудняет доступ многочисленных регуляторов к ДНК и определяет уровень транскрипции в определенной области. Совокупность вариантов гистонов и их посттрансляционных модификаций, по-видимому, играет роль кода (так называемый «гистоновый код»). «Гистоновый код» определяет межнуклеосомные взаимодействия и обеспечивает привлечение на нуклеосомы тех или иных негистоновых белков (Richards & Elgin, 2002). Различные модификации гистонов часто связаны друг с другом. Активно транскрибирующийся хроматин характеризуется одновременным наличием модификаций Ас-К9, Ас-К14 и P-S10 гистона НЗ, или Ме-К4 и Ас-К14 гистона НЗ, или Me-R3 и Ас-Кб гистона Н4, Для транскрипционно неактивного хроматина характерно наличие Ме-К9 гистона НЗ и Ас-К14 гистона Н4 (Jenuwein & Allis, 2001). Известен целый ряд комплексов, участвующих в модификации хроматина. Показано, что регуляторы транскрипции могут либо вовлекать эти комплексы, либо сами модифицировать хроматин (Narlikar et al., 2002) Важнейшей модификацией «хвостов» гистонов является ацетилирование консервативных остатков лизина. Эта модификация связана с транскрипционно активным хроматином. Предложено несколько механизмов, связывающих активацию транскрипции и ацетилирование хроматина. Ацетилирование может ослаблять взаимодействия гистонов с ДНК, ослаблять межнуклеосомные взаимодействия, или же ацетилированные «хвосты» гистонов могут привлекать определенные факторы транскрипции (Eberharter & Becker, 2002). Однако конкретные механизмы, связывающие транскрипцию и ацетилирование гистонов, до сих пор неясны. В ядре имеются два уровня ацетилирования гистонов: общий и локальный. На общем уровне производится ацетилирование/деацетилирование гистонов на протяжении больших доменов хроматина. Большая часть хроматина в ядре у высших эукариот гипоацетилирована: в среднем 13 из 30 N-концевых остатков лизина в составе нуклеосомы ацетилированы. Такой средний уровень ацетилирования в ядре поддерживается совместной работой ацетилтрансферазных (HAT) и деацетилазных (HDAC) комплексов.
На локальном уровне ацетилирование осуществляется в районе промоторов и регуляторних областей отдельных генов через вовлечение специфических модифицирующих комплексов факторами транскрипции (Eberharter & Becker, 2002). Метилирование гистонов НЗ и Н4 осуществляется либо по остаткам аргинина, либо - лизина. Первый тип модификации связан с активацией транскрипции. Наоборот, метилирование К.9 гистона НЗ приводит к возникновению транскрипционно неактивных областей (Berger, 2002). Фосфорилирование гистона НЗ у S. cerevisiae, D. melanogaster и человека ассоциировано с активацией транскрипции. Также эта модификация облегчает последующее ацетилирование гистона НЗ (Featherstone, 2002), Возможно, фосфорилирование, также как и ацетилирование, может изменять структуру нуклеосомы (Berger, 2002). Одной из интересных форм модификации гистонов является присоединение убиквитина. Модифицированные таким образом формы гистонов присутствуют как в гетеро-, так и в эухроматине. Возможно, объемный убиквитин увеличивает общую доступность ДНК для различных факторов, препятствуя контактам между нуклеосомами, и тем самым стимулирует транскрипцию (Zhang, 2003; Henry et al., 2003). Поли-АДФ-рибозилирование гистонов необходимо для ремоделинга хроматина и обеспечения доступа определенных факторов транскрипции и репликации к ДНК (Rouleau et al., 2004). Таким образом, модификации гистонов приводят к изменению структуры нуклеосом, способствуют привлечению ряда белковых комплексов и тем самым служат динамичным инструментом регуляции структуры хроматина.
Ядерные рецепторы
Классическая передача сигнала извне в клетку - это сложный многостадийный процесс, который начинается с взаимодействия лиганда с мембранно-связанным рецептором. Затем рецептор инициирует в цитоплазме клетки каскад событий, результатом которого становится влияние специфических факторов транскрипции на экспрессию генов в ядре. Транскрипционные факторы, относящиеся к суперсемейству ядерных рецепторов, благодаря своему уникальному строению, используют другую стратегию. Ядерные рецепторы в составе одной белковой молекулы содержат домены, отвечающие за рецепторную функцию, способность связывать ДНК и влиять на транскрипцию. В клетке свободные ядерные рецепторы локализуются в цитоплазме или в ядре. Лиганды ядерных рецепторов - это стероидные гормоны и другие небольшие липофильные молекулы. Они легко проникают через клеточную и ядерную мембрану и связываются с ядерными рецепторами. Рецепторы при связывании лигандов претерпевают структурные изменения, способствующие присоединению лиганд-рецепторного комплекса к специфическим последовательностям ДНК. Эти последовательности называются гормон-акцепторными элементами (hormon response elements, HRE) и обладают свойствами энхансеров, регулируя транскрипцию подконтрольных генов. Таким образом, изменение экспрессии генов в ответ на гормональный сигнал осуществляется в одну стадию (King-Jones & Thummel, 2005). Характерной структурной особенностью ядерных рецепторов является наличие двух консервативных доменов: ДНК-связывающего домена (DBD) и расположенного ближе к С-концу лиганд-связывающего домена (LBD), соединенных гибким «шарнирным» участком (Рис. 2А). DBD разных ядерных рецепторов высококонсервативны и содержат 2 С4 цинковых пальца, из которых первый содержит последовательность из 5 а.о., называемую Р-боксом, которая обеспечивает специфическое связывание с ДНК. Второй цинковый палец имеет относительно слабую способность к димеризации, что позволяет DBD димеризоваться, но лишь в присутствии молекулы ДНК-мишени. Менее консервативный LBD содержит основной район димеризации, который позволяет димеризоваться молекулам разных рецепторов между собой, что значительно расширяет спектр потенциальных ДНК-мишеней и регуляторных функций. LBD состоит из 11-13 а-спиральных участков, которые образуют гидрофобный «карман» для связывания молекулы лиганда.
Расположенный на N-конце активацнонный домен AF-1 (activation function 1) может работать лиганд-независимо, в то время как AF-2 домен, находящийся на С-конце LBD, часто работает лиганд-зависимо. Детальные структурные и молекулярные исследования показали, что при связывании лиганда осуществляется конформационный переход LBD в активное состояние посредством разворота а-спирали 12 в положение, при котором AF-2 домен получает способность рекрутировать транскрипционные коактиваторы (King-Jones & Thummel, 2005). Не все ядерные рецепторы обладают полным набором перечисленных доменов, некоторые домены в отдельных белках были утрачены в ходе эволюции (Segraves & Hogness, 1990). Сайт связывания ядерного рецептора с ДНК (HRE) - это короткая последовательность, идентичная консенсусу AGGTCA или являющаяся его производным (Рис. 2Б). Некоторые ядерные рецепторы, такие как SF-1 (steroidogenic factor 1) у позвоночных, могут работать в виде мономера, связываясь с одной консенсусной последовательностью. Остальные ядерные рецепторы связываются в виде гомо- или гетеродимера с двумя консенсусами, которые вместе составляют функциональный HRE. Два консенсуса могут быть расположены как прямые или инвертированные повторы и разделены короткой вариабельной последовательностью, длина которой специфична для разных димеров рецепторов (0-6 п.н.). Таким образом, специфичность связывания рецепторов определяется нуклеотидной последовательностью и организацией HRE (King-Jones & Thummel, 2005). Лиганды ядерных рецепторов - это широкий спектр небольших липофильных молекул, таких как стероидные и тиреоидные гормоны, ретиноевая кислота и витамин D, При помощи филогенетического анализа внутри суперсемейства ядерных рецепторов было выявлено несколько типов. Рецепторы типа I («классические» или «стероидные») - это рецепторы прогестинов (PR), эстрогенов (ER), андрогенов (AR), глюкокортикоидов (GR) и минералокортикоидов (MR). К рецепторам типа П относятся рецепторы тиреоидного гормона (TR), полностью транс-ретиноевой кислоты (RAR), 9-цис-ретиноевой кислоты (RXR) и витамина Оэ (VDR). Тип Ш включает в себя рецепторы, лиганды которых на данный момент неизвестны, Это так называемые орфанные рецепторы (orphan receprors), «рецепторы-сироты», по крайней мере, некоторые из них могут функционировать лиганд-независимо (Chawla et al., 2001). Между рецепторами разных типов существуют функциональные различия. Рецепторы типа I в отсутствии лиганда неактивны и находятся в цитоплазме в комплексах с шаперонами, а после связывания с лигандом, перемещаются в ядро, где связываются с палиндромными повторами на ДНК в виде гомодимера, организованного «голова к голове» и регулируют транскрипцию генов-мишеней.
Рецепторы типа II конститутивно связаны с акцепторными элементами ДНК, которые образованы прямыми повторами и имеют разные паттерны димеризации, включая гетеродимеризацию с RXR. Некоторые из таких рецепторов работают как репрессоры в отсутствие лиганда, поддерживая неактивное состояние гена-мишени, посредством привлечение корепрессорных комплексов. При связывании гормона, эти рецепторы привлекают коактиваторы, высвобождают из комплекса корепрессоры, и таким образом индуцируют транскрипцию гена-мишени (Рис. ЗА) (McKenna et al., 1999). Рецептор Ш типа SF-1 связывается с акцепторным элементом в виде мономера и работает лиганд-независимо как Возможность быстро и просто переключать функциональное состояние ядерного рецептора путем добавления лиганда сделала эти транскрипционные факторы одним из главных объектов исследований контроля экспрессии эукариотических генов. Ядерные рецепторы работают, как мощные регуляторы важнейших биологических процессов, включая гомеостаз липидов и глюкозы, детоксикацию, клеточную дифференцировку, эмбриогенез и половое созревание (Chawla et al., 2001). Хотя исследования, проведенные в последние годы на позвоночных, обеспечили прорыв в понимании того, как ядерные рецепторы регулируют транскрипцию генов-мишеней, многое об их роли в биологическом развитии еще остается неизвестным. 3.2 Ядерные рецепторы и гормональная сигнализация у D. melanogastcr И у позвоночных, и у насекомых половое созревание инициируется увеличением титра гормонов и опосредуется членами суперсемейства ядерных рецепторов. У позвоночных основную роль в этом процессе играют тиреоидные и половые гормоны, в то время как у насекомых созревание регулируется экдистероидами. Экдистероиды - стероидные гормоны насекомых, сходные по строению с экдизоном - играют центральную роль в жизненном цикле, контролируя прохождения всех стадий постэмбрионального развития. Некоторые уникальные особенности D. melanogaster делают ее перспективным модельным объектом для изучения функций и регуляции работы ядерных рецепторов. В отличие от позвоночных, обладателей сложных гормональных сигнальных путей, D. melanogaster имеет только 2 известных физиологически активных липофильных гормона: стероидный гормон 20-гидроксиэкдизон (20Е) и сесквитерпеноидный ювенильный гормон (JH). Кроме того, геном D. melanogaster содержит только 18 генов ядерных рецепторов, в то время как, например, в геноме человека их обнаружено 48 (King-Jones & Thummel, 2005).
Конструкции для анализа активации репортерных генов в дрожжах
LexA-SAYP(l-362) - фрагмент кДНК SAYP, кодирующий а.о. 1-362, субклонирован в вектор рВТМ 117с по сайтам рестриктаз Sall-Sacl. LexA-SAYP(361-644) - фрагмент кДНК SAYP, кодирующий а.о. 361-644, субклонирован в вектор pBTMl 17с по сайтам рестриктаз Nhel-Ncol(T4). LexA-SAYP(643-889) - фрагмент кДНК SAYP, кодирующий а.о. 643-889, субклонирован в вектор pBTMl 17с по сайтам рестриктаз SaH-Sacl. LexA-SAYP(888-1273) - фрагмент кДНК SAYP, кодирующий а.о. 888-1273, субклонирован в вектор рВТМ 117с по сайтам рестриктаз Sacl-Ncol. LexA-SAYP(l 628-2008) - фрагмент кДНК SAYP, кодирующий а.о. 1628-2008, субклонирован в вектор pBTMl 17с по сайтам рестриктаз Ncol-Xhol. Фрагмент кДНК Нг46, кодирующий а.о, Ш-478, был субклонирован из вектора рАСТ2 в экспрессионный вектор pQE32 по сайтам рестриктаз BamHl-Hindm(T4) при помощи ПЦР с праймерами 501 и 502. 1.9 Конструкции для анализа функций доменов белка SAYP in vivo. Конструкция Р{е(у)3} была предоставлена Ю. Шидловским. Содержит геномный фрагмент, фланкированный сайтами рестриктазы ВатШ. в положениях ] 800 п.н. «выше» начала первого экзона и 1400 п.н. «ниже» стоп кодона гена е(у)3, в векторе pCaSpeR3. Кодирует полноразмерный белок SAYP (а. о. 1-2008), Конструкция P{e(y)3dPHD} была получена из конструкции Р{е(у)3+} посредством обработки рестриктазой Stul и последующего «самолигирования». В этой конструкции делегированы 2622 п.н. с 3 конца геномного фрагмента (10-12 экзоны гена е(у)3). Кодирует белок SAYP без PHD-доменов (а.о. 1-1665). Правильность клонирования всех конструкций и сохранность ОРТ была подтверждена секвенированием. 2. МЕТОДЫ 2.1 Работа с дрожжами. Скрининг библиотеки кДНК в двухгибридной системе. 2.1.1 Трансформация дрожжей индивидуальной плазмидой А) Приготовление компетентых клеток. Дрожжи рассевали на чашку со средой YPD-arap и растили 2-3 суток при 30С до появления колоний 2-3 мм в диаметре. Несколько колоний пересевали в жидкую среду YPD (50 мл) и растили в течение ночи при 30С с покачиванием (250 об/мин). Пересевали дрожжи в 300 мл YPD до OD$oo=0,3, растили 3 ч, осаждали дрожжи центрифугированием (4500 об/мин, 5 мин), супернатант удаляли и ресуспендировали дрожжи в стерильной воде (25-50 мл).
Центрифугировали (4500 об/мин, 5мин), супернатант удаляли, ресуспендировали дрожжи в 1,5 мл стерильного свежеприготовленного раствора ІхТЕ/СНзСООІл (IxTE, ІхСНзСООІл, готовится из 10-кратных растворов ЮхТЕ: 0,1М Трис-HCl; ЮтМ ЭДТА, рН7,5 и 10х CHjCOOU: ЇМ СНзСООІд, рН7,5). Б) Трансформация. В 1,7 мл пробирке (Eppendorf) смешивали 0,1 мг геномной ДНК спермы лосося , 0,1 мкг плазмидной ДНК, 100 мкл компетентных клеток, 600 мкл свежеприготовленного раствора ПЭГ/СН3С001л (40% ПЭГ 4000; IxTE; 1хСН3СООЫ ) и инкубировали при 30С 30 мин с покачиванием (250 об/мин). Добавляли ДМСО до 10% (70 мкл), перемешивали и инкубировали при 42С 15 мин, охлаждали во льду, осаждали дрожжи центрифугированием (13000 об/мин, 5 с), удаляли супернатант и ресуспендировали дрожжи в 1,5 мл буфера IxTE. Рассевали смесь на чашку с селективной средой. Перед использованием денатурировали 10 мин при 95С и охлаждали во льду. 2.1.2 Анализ активациирепортерного гена LacZ с использованием субстрата X-gal Вырезали по размеру чашки ватман ЗММ и нейлоновую мембрану (MSI) (мембрану стерилизовали облучением УФ 15 мин), смачивали ватман в растворе 2-буфер/X-gal (0.06М Na2HP04x2H20; 0,04М NaH2P04xH20; 0,0 ЇМ КС1; 0,001 М MgSO+; 20 мг/мл X-Gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-р-0-галактопиранозид в N,N MOA)) и помещали в чистую чашку (2,5 мл раствора 2-буфер/Х а1 для чашки диаметром 100 мм). Делали на мембране отпечаток колоний, выросших на чашках с селективной средой, замораживали мембрану в жидком азоте, давали оттаять и помещали отпечатком вверх на ватман. Закрытую чашку инкубировали при 30С до появления синих колоний (от 15 мин до 8 ч). Сеяли 3 дрожжевые колонии в 5 мл селективной среды и растили 1-2 суток при 30С. Пересевали в 5 мл YPD до OD6oo=0.3, растили 3 ч при 30С. Осаждали дрожжи из 1,5 мл культуры центрифугированием (13000 об/мин, 30 с), тщательно удаляли супернатант, суспендировали осадок в 1 мл буфера «I» (50 тМ КР (КН2РО4+К2НРО4), рН 7.6; ImM MgCb), центрифугировали (і3000 об/мин, 30 с), тщательно удаляли супернатант, суспендировали осадок в 300 мкл буфера «Ь . Переносили 100 мкл суспензии в новую пробирку, (оставшиеся 200 мкл суспензии использовали для определения OD6oo)» трижды замораживали в жидком азоте, перенося на 37 С до полного оттаивания. В микротитровальной плашке смешивали 40 мкл суспензии и 260 мкл буфера «II» (1 мг/мл CPRG (C25H2iOioCbSNa, хлорфеноловый красный-Р-О-галактопиранозид) в буфере «I»), отмечали стартовое время. Через 15 мин переносили 150 мкл в новую лунку и добавляли 100 мкл ЗтМ ZnCb, чтобы остановить реакцию; через 1 ч добавляли 100 мкл ЗтМ ZnCb в первую лунку. Переносили суспензии из обеих лунок в пробирки, центрифугировали (13000 об/мин, 1 мин), супернатанты переносили в новые пробирки и измеряли OD578. Рассчитывали активность р-галактозидазы (в единицах активности) по формуле: U = 1000xOD578 / (t х V х ODMO), где ODftoo = ODsoo 1мл культуры; (Для большей точности измерения для определения СЮбсю использовали 200 мкл суспензии клеток в буфере «I»: доводили НгО до 1мл и измеряли OD6oo)J V = ОД х Концентрационный фактор; Концентрационный фактор — 5; t = время инкубации, мин, 1 единица активности р-галактозидазы - это количество фермента, способное гидролизовать Імкмоль CPRG до хлорфенолового красного и D-галактозы за 1 мин в пересчете на 1 клетку (Miller, 1992) Дрожжи, трансформированные по отдельности четырьмя конструкциями pBait, вырастили в течение ночи в 50 мл SDrp, объединили 4 культуры и посеяли в 1,5 л среды YPD до СЮбоо=0,2-0,3, растили 3 ч при 30С с покачиванием.
Осадили дрожжи центрифугированием (4500 об/мин, 5 мин), промыли осадок водой, осадили в том же режиме и ресуспендировали в 12,5 мл ІхТЕ/СНзСООЬі. Добавили 0,5 мг библиотеки кДНК, 20 мг геномной ДНК из спермы лосося и 94 мл ПЭГ/СНзСООЫ, перемешали и инкубировали при 30С 30 мин. Добавили 11 мл ДМСО и инкубировали при 42С 15 мин. Охладили во льду и осадили дрожжи. Осадок растворили в 24 мл ІхТЕ. В 1,7 мл пробирках сделали три аликвоты с десятикратным разведением: 1.500 мкл IxTE + 24 мкл суспензии дрожжей (1/1000 от общего объема); 2.500 мкл IxTE + 50 мкл из пробирки 1; 3. 500 мкл IxTE + 50 мкл из пробирки 2, Аликвоты посеяли на три чашки со средой SD-leurp для оценки эффективности трансформации. Все оставшиеся дрожжи посеяли на 6 чашек 20x20см со средой SD-leurp-his. 2.1.5 Отбор клонов, позитивных по активации обоих репортериых генов, элиминация «автоактиваторов». Выросшие на чашках 20x20 см со средой SD-leurp-his колонии (-600) суспендировали в жидкой среде SD-leurp-his и пересеяли штрихом на чашки диаметром 100 мм со средой SD-leurp-his (по 12 колоний на чашку), подрастили при 30С в течение 2 суток и сделали X-gaI-тест активности Р-галактозидазы. Позитивные по активности р-галактозидазы колонии (-300) пересеяли в микротитровальную плашку в среду SD-leurp (75 мкл). Подрастили в течение 2 суток и пересеяли по 3 мкл на размеченные по шаблону чашки диаметром 100 мм (77 колоний на чашку) со средой: SD-leu+can (20мг/мл канаванина), SD-leurp и SD-leurp-his. Подрастили в течение 2 суток и сделали X-gal- тест активности Р-галактозидазы. Колонии, которые выросли на всех трех чашках и посинели на чашках SD-leurp и SD-leurp-his, но не на чашке SD-leu+can подвергали дальнейшему анализу (-250 колоний). 2.1.6 Отбор и анализ уникальных клонов Повторяющиеся к ДНК клоны элиминировали методом ПЦР дрожжевых колоний и последующей Southem-гибридизации, Плазмиды, содержащие уникальные кДНК клоны, выделяли из дрожжей, трансформировали в Е. coli и выделяли в препаративных количествах для дальнейшего анализа.
Изучение роли PHD-доменов белка SAYP в репрессии транскрипции в гетерохроматине
Для дальнейшего изучения функций белка SAYP был предпринят поиск белков, взаимодействующих с ним. С этой целью был проведен скрининг библиотеки кДНК из эмбрионов D. melanogaster в дрожжевой двухгибридной системе. Белок SAYP имеет большие размеры, что затрудняет его экспрессию в дрожжах, кроме того, SAY-домен, как было показано, способен активировать транскрипцию. Район а.о. 1273-1629, содержащий SAY-домен, в составе одного полипептида с LexA является «автоактиватором», т.е. не пригоден для анализа в двухгибридной системе, поэтому он был заведомо исключен из эксперимента. Для анализа был использован район SAYP, содержащий PHD-домены, а также N-концевая часть белка. Поскольку N-концевой район SAYP не содержит известных доменов, он был произвольно разделен на части длиной от 250 до 390 а.о. (Рис. 7). Было создано 5 конструкций в векторе рВТМ117с (далее эти конструкции будут называться pBaitJ, которые кодировали рекомбинантные полипептиды, состоящие из LexA и фрагментов белка SAYP в единой ОРТ. Для уменьшения числа ложноположительных результатов все конструкции были проверены на «автоактивацию». pBait, кодирующая район а.о. 888-1273, при котрансфекции с плазмидой рАСТ2, вызывала В данной работе был использован штамм дрожжей L40, дефектный по биосинтезу лейцина, триптофана и гистидина. Взаимодействие белков «bait» и «prey» в клетках этого штамма вызывает активацию двух репортерных генов: дрожжевого гена HIS3 и бактериального гена LacZ. Оба репортерных гена экспрессируются под контролем операторов бактериального ДНК-связывающего белка LexA. Дрожжи штамма L40 были трансформированы смесью из четырех плазмид pBait. Полученные трансформанты были отобраны на селективной среде и затем трансформированы библиотекой кДНК из эмбрионов D, melanogaster в векторе рАСТ2, Плазмиды с клонами библиотеки кДНК далее будут обобщённо называться рРгеу, В сумме было проскринировано около 2x106 клонов, что в 2 раза превосходит представительность данной библиотеки. Анализ нуклеотидных последовательностей клонов проводился при помощи программы BLAST на сервере NCBI. На последнем этапе эксперимента отобранные белки проверялись на специфичность взаимодействия с SAYP, Для этого соответствующие плазмиды рРгеу котрансформировали в дрожжи L40 с четырьмя использованными плазмидами pBait по отдельности. В итоге было идентифицировано 11 клонов, кодирующих белки, взаимодействующие с разными районами SAYP. В основном это гипотетические белки, предсказанные по последовательности кДНК (данные не представлены).
Большинство найденных белков (9 из 11) взаимодействуют с районом SAYP, содержащим PHD-домены, что согласуется с предположением, что PHD-домены отвечают за белок-белковые взаимодействия. Среди белков, взаимодействующих с PHD-доменами SAYP, наибольший интерес представляет белок Mes-4, вовлеченный в репрессию транскрипции в клетках зародышевой линии и предположительно обладающий гистон-метилтрансферазной активностью (Ketel et al., 2002; Ketel et at., 2003). Для проверки взаимодействия SAYP и Mes-4 in vivo проводятся дальнейшие исследования. С фрагментом а.о. 643-889 белка SAYP взаимодействует клон, соответствующий фрагменту кДНК гена Нг4б, который мы посчитали наиболее важным для дальнейшего анализа. Ген Hr46 {DHRS) кодирует консервативный ядерный белок, который относится к суперсемейству ядерных рецепторов, экспрессируется во многих тканях в эмбриогенезе, во время линек и в начале метаморфоза D. melanogaster, необходим для развития и жизнеспособности насекомого и вовлечен как в активацию, так и в репрессию транскрипции (Koelle et al., 1992; Carney et al., 1997; Lam et al., 1997). 6. Подтверждение взаимодействия SAYP и Hr46(DHR3) Полученные результаты двухгибридного анализа выглядят достоверно, т.к. было выявлено взаимодействие между двумя ядерными белками, имеющими перекрывающиеся временные и пространственные профили экспрессии и участвующими в регуляции транскрипции. Однако, поскольку дрожжевая двухгибридная система является гетерологичной для D. melanogaster, данные результаты требуют проверки с помощью других методов. Для этой цели были получены поликлональные антитела мыши к Hr46(DHR3). Методами Western-анализа и иммунопреципитации было показано, что антитела, полученные от двух разных животных, специфично узнают в эмбриональном ядерном экстракте и в лизате эмбрионов D. melanogaster белок с предсказанной для Нг46 (DHR3) молекулярной массой (49 кДа) (Рис. 8А и данные не представлены). Ранее в нашей лаборатории для изучения SAYP-содержащего комплекса был проведен ряд хроматографических очисток эмбрионального ядерного экстракта (Шидловский Ю., личное сообщение). Методом гель-фильтрации было показано, что SAYP входит в состав комплекса массой около 2 МДа. Этот комплекс присутствует в наибольшей концентрации во фракциях № 2-4 и практически отсутствует во фракции №1, содержащей, в частности, различные крупные неспецифические агрегаты. Эти данные указывают на то, что детектируемый комплекс не является продуктом неспецифической агрегации. Было исследовано распределение Нг46 во фракциях с нечетными номерами и обнаружено, что он присутствует только во фракции №3, содержащей основную часть SAYP-содержащего комплекса, и отсутствует в остальных фракциях, где содержание SAYP низкое или он вообще отсутствует (Рис. 8Б).
