Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 7
1. Структура хроматина и транскрипция. 7
1.1. Регуляция транскрипции на разных уровнях организации хроматин . 7
1.2. Общая характеристика доменов генома, 9
1.3. Глобиновый генный кластер кур 12
1.4. Отличительные черты и функции гетерохроматина. 18
2. Факторы, определяющие компактизацию хроматина, 19
2.1, Линкерные гистоны, 19
2.2, Гистоновый код, 21
2.3, Негистоновые белки хроматина позвоночных, 24
3. Генетические элементы на границах активного и неактивного хромагина, 28
3.1. Инсуляторы, как антагонисты энхансеров. 28
3.2. Инсуляторы, как барьерные элементы, 33
Материалы и методы исследования. 35
1. Реактивы 35
2. Коммерческие наборы 36
3. Антитела 36
4. Приборы и оборудование: 37
5. Составы основных растворов 37
6. Линии клеток 39
7. Выделение ядер клеток 39
8. Генно-инженерные методы. 41
8.1. Полимеразная цепная реакция (ТЩР) 41
8.2. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и дефосфорилирование 41
9. Электрофоретические методы. 41
9.1. Электрофорез белков в ПААГ 41
9.2, Электрофорез ДНК в агарозном геле, 42
10. Western-гибридизация. 42
11Формальдегидная фиксация и иммунопреципитация хроматина. 44
Результаты и обсуждение 51
1. Оценка количества белка MENT и белков НР1. клетках крови на конечных стадиях дифференцировки. 51
2, Оценка уровня метилирования гистона НЗ в клетках крови на конечных стадиях дифференцировк . 54
3. Фиксация и иммунопреципитаиия хроматина клеток крови Gallus gallus. 56
3.1. Подбор условий для фиксации и иммунопреципитании хроматина при помощи белка MENT 56
3.2, Подбор последовательностей ДНК для зондов, использованных в гибридизации, 60
3.3, Распределение белка MENT вдоль 3-глобинового домена G.gallus. 64
3.3.1, Распределение белка MENT вдоль ft-глобинового домена в эритроцитах G, gallus, 66
3.3.2. Распределение белка MENT вдоль р-глобигювого домена в лимфоцитах G.gallus. 69
4, Сравнение картины распределения белка MENT с картиной ацетилирования и метилирования гистонов вдоль р-глобинового домена генома Gallus gallus . 73
5, Влияние экспрессии белка MENT в культуре клеток NIH3T3 на уровень ацетилирования и метилирования гистонов.
Выводы 79
Список использованной литературы 80
Приложение 95
- Регуляция транскрипции на разных уровнях организации хроматин
- Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и дефосфорилирование
- Оценка уровня метилирования гистона НЗ в клетках крови на конечных стадиях дифференцировк
- Сравнение картины распределения белка MENT с картиной ацетилирования и метилирования гистонов вдоль р-глобинового домена генома Gallus gallus
Введение к работе
Геном эукариот упакован в ДНК-белковый комплекс - хроматин, включающий в себя гистоны и другие ядерные белки. Выделяют два основных типа хроматина, которые отличает уровень компактизации ДНК: активный и менее компактный эухроматин, а также конденсированный гетерохроматин. В основном гетерохроматин содержит репрессированные гены. В процессе клеточной дифференцировки, когда основная часть генома неактивна, большинство генов входят в состав гетерохроматииа, однако ряд генов все же сохраняют свою экспрессию. Одним из интереснейших аспектов формирования гетерохроматииа является тот факт, что он не распространяет свое репрессирующее влияние на гены, специфично транскрибирующиеся в клетках определенного типа, на данном этапе развития.
Примером эпигенетической регуляциии экспрессии генов в процессе развития является регуляциии экспрессии 3-глобинового локуса кур. Это участок активного хроматина размером 30 тысяч пар оснований, отделенный от конденсированного хроматина так называемыми пограничными элементами или инсуляторами. Известно, что репрессированный хроматин характеризуется пониженным уровнем ацетилирования гистонов и повышенным уровнем метилирования гистона НЗ, по положению Lys9. Наиболее изученным негистоновым маркером гетерохроматииа является гетерохроматиновый белок НР1, способный связываться только с метилированным гистоном НЗ. Ранее в нашей лаборатории был описан еще один белок гетерохроматииа - MENT (от Myeloid and Erythroid Nuclear Termination stage-specific protein). Он накапливается в клетках крови птиц на конечных стадиях дифференцировки, связывается с репрессированным хроматином и вызывает его конденсацию.
Данная работа была направлена на определение негистоновых белков, участвующих в образовании конденсированного хроматина на границах (ї-глобинового домена и изучение их роли в этом процессе. Во время выполнения данной работы было показано, что уровень всех изоформ белка НР1 в зрелых клетках крови кур (Gallus gallus) незначителен, а значит, данный белок не может являться фактором конденсации хроматина на конечных стадиях дифференцировки. Было показано, что количество белка MENT нарастает в процессе дифференцировки клеток крови, что делает его очевидным кандидатом в факторы, определяющие репрессию хроматина в процессе созревания клеток крови. При выполнении данной работы было показано, что распространение белка MENT вдоль р-глобшювого домена совпадает с картиной распределения диметилированного гистона НЗ и обратно картине распределения ацетилированных гистонов.
Целью данной работы было выяснить, участвуют ли негистоновые белки MENT и НР1 в организации хроматина в клетках крови G. gailus па примере глобинового домена генома.
Для этого в ходе исследования предполагалось выполнить следующие задачи:
1. Оценить наличие вариантов белка НР1 в клетках крови G. gailus на разных стадиях их дифференцировки.
2. Используя методику иммунопреципитации хроматина, оценить, соответствуют ли последовательности ДНК, взаимодействующие с белком MENT, деконденсированному, конденсированному или пограничным участкам хроматина.
3. Исследовать, приводит ли экспрессия белка MENT в культуре клеток NIH ЗТЗ к изменению уровня ацетилирования и метилирования гистонов.
Регуляция транскрипции на разных уровнях организации хроматин
Необходимым условием правильного развития и выживания любого живого организма является регуляция экспрессии его генома. До 90% генома отдельной клетки млекопитающих не транскрибируется {Allis Gasser, 1998), и в любом геноме есть транскрибируемые и молчащие участки ДНК. Таким образом, ключевым вопросом в биологии многоклеточных эукариот является то, как именно клетка данного типа координирует экпрессшо той или иной части своего генома в данный конкретный момент времени. С недавнего времени стало очевидно, что подобная координация обеспечивается не только за счет многочисленных транскрипционных факторов и регуляторных последовательностей ДНК, но и за счет изменений в структуре самого хроматина. Регуляция транскрипции, обеспечивающая переход ДНК из неактивного в активное состояние включает несколько последовательных стадий. Принципиальной характеристикой эукариот, в особенности высших многоклеточных, является то, что ключевую роль в механизмах транскрипционной регуляции играет структура хроматина (Struhl, 1999).
Хроматин - это плотноупакованный ДНК-белковый комплекс, включающий в себя гистоны и другие ядерные белки, такие как репрессирующие и транскрипционные факторы (Wolfte, 1998). Ряд основных черт хроматина (ковалентные модификации цитидина в составе ДНК, ковалентные модификации гистонов, наличие типичных репрессоров и факторов ремоделинга хроматина), определяющих транскрипционную активность генов в его составе отражены в Таблице № 1.
Изучение структуры политенпых хромосом насекомых позволило идентифицировать транскрипционно активные (деконденсированные) и неактивные (конденсированные) участки и картировать положение этих участков в составе хромосом (Lewin, 1997, глава № 26). Структурные отличия хроматина не обязательно связаны собственно с транскрипцией, но могут предшествовать ее инициации. В этом случае мы имеем дело с потенциированием хроматина. Характерное проявление этого свойства выявлено в экспериментах на трансгенных животных, в которых трансген проявляет сильно варьирующую транскрипционную активность в зависимости от положения в хромосомах (Palmiter and Brinster, 1985).
Участки хроматина, имеющие характерный транскрипционный потенциал получили название хромосомных доменов. В пределах одного хромосомного домена транскрипционная активность ДНК не зависит от других доменов. В состав домена генома может входить как один ген, так и несколько (тогда домен еще называют генным кластером). Характерно, что в этом случае все гены одного домена экспрессируются в одном и том же типе дифференцированных клеток. Очевидно, что в составе генома всегда одновременно присутствуют активные и неактивные домены.
В состав хромосом входят два типа доменов: транскрипционно активный эухроматин и молчащий гетерохроматин. Различия между ними хорошо выражены на структурном уровне. Универсальной характеристикой активного состояния домена является его чувствительность к воздействию ДНКазы I. Интересно, что в случае активного домена повышенная чувствительность к воздействию ДНКазы I распространяется на несколько тысяч пар оснований от кодирующего участка (Lawson et al., 1982). Неактивный домен хроматина сильно компактизован и потому не чувствителен к действию ДНКазы I.
С функциональной точки зрения, домен содержит необходимые и достаточные последовательности ДНК для активации гена и защиты его от репрессивного окружения. Так, транскрипционно активный домен, помещенный в репрессированную область хроматина, сохраняет свою активность (Pikaart et al., 1998).
Помимо кодирующих последовательностей ДНК, домен включает в себя регуляторные элементы (энхансеры и промоторы), причем внутри одного домена все регуляторные элементы доступны друг другу. Обычно такие элементы совпадают с участками гиперчувствительности к действию нуклеаз. Такие участки на 1-2 порядка более подвержены воздействию ДНКазы I, чем основная часть хроматина (Elgin, 1988). Подобную чувствительность связывают с отсутствием нуклеосом с нормальным строением или с изменением вторичной структуры ДНК, ио в целом природа гиперчувствительных участков хроматина пока неизвестна (Leach et al., 2001). Участки гиперчувствительности к ДНКазе можно разделить на две большие группы: конститутивные и индуцибильные (Gross and Garrard, 1988), конститутивные участки проявляют себя во всех клетках организма, а индуцибельные только в определенных тканях или на определенных стадиях развития. Обычно гиперчувствительные участки содержат места связывание транскрипционных факторов, причем ткан еспецифичес кие гиперчувствтельные участки содержат сайты связывания как тканеспецифических, так и общих регуля горных факторов. Регуляторные последовательности ДНК, обеспечивающие эффективную независимую экспрессию генов внутри одного домена, принято называть участками контроля над локусом или ЬСЯами (от Locus Control Region) (Grosveld, 1999). Они обычно включают в себя несколько участков гиперчувствительности к ДНКазе I. LCRbi способны влиять иа экспрессию гена с расстояния до 50 тысяч пар оснований. Ранее предполагалось, что в генных кластерах LCRbi обеспечивают работу одного определенного гена в определенный момент времени. Но позднее было показано, что стадииспецифическая экспрессия генов р-глобиноного кластера человека сохраняется даже при отсутствии LCR (Starck et al., 1994).
Один из возможных принципов укладки ДНК в структуры хромосомы высокого порядка был подсказан внешним видом некоторых особых хромосом - так называемых хромосом типа ламповых щеток из ооцитов ряда животных. Такие хромосомы обладают хорошо выраженной петельной структурой, то есть имеют серию петельных доменов, которые под углом отходят от основной оси хромосомы. Существует гипотеза, что каждой такой петле хроматина соответствует один хромосомный домен. На рисунке № 1 приведены модели, описывающие как именно пограничные элементы доменов обесфечивают их независимость от геномного окружения. Ниже мы более подробно остановимся на характеристиках генетических элементов, способных защищать гены от воздействия их геномного окружения.
Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и дефосфорилирование
Класс последовательностей ДНК, способных защищать гены от песпецифического воздействия посторонних элементов генома, получил название «инсуляторы». Эта способность иысуляторов может быть реализована двумя основными способами: разобщением действия отдаленного энхансера на промотор (Kellum и Schedl, 1992) и/или предотвращением распространения комиактизации хроматина на активные гены, действуя как барьерный элемент (Sun и Elgin, 1999) (Рисунок № 6). Инсуляторы были впервые описаны, как элементы, разделяющие конденсированные и деконденсированные домены хроматина, но надо отмстить, что работа инсуляторных элементов только в качестве барьеров для гетерохроматина более харатерна для дрожжей, нежели для позвоночных (West et al., 2002). Ряд инсуляторов позвоночных функционируют только как антагонисты энхансеров, другие совмещают в себе оба описанных свойства, в любом случае, было показано, что эти две активности разделены (Таблица № 2).
Изначально работы по изучению инсуляторов велись на Drosophila, и большая их часть описана именно для этого организма. У позвоночных же впервые свойства инсуляторов обнаружили в участке 5" границы р-глобинового локуса цыпленка (5 HS4), для которого была показана конститутивная гиперчувствителыюстъ к ДНКазе в клетках всех типов тканей (Chung et al., 1993). 5 HS4 инсулятор, помещенный между промотором и энхансером в ряде репортерных систем разобщал их взаимодействие (Chung et al, 1997). Резкие изменения чувствительности к ДНКазе 1 и уровня ацетилирования гистонов в районе 5 HS4 навелЬ на мысль, что этот элемент препятствует активирующему влиянию участка контроля над локусом (LCR от Locus Control Region) в направлении 5 (Hcbbes et al 1994). В дальнейшем была идентифицирована последовательность ДНК в 250 пар оснований, необходимая и достаточная для инсуляторной активности 5 HS4. В состав последовательности входят участки связывания с белком CTCF (от СССТС-binding factor, фактор, связывающий СССТС) (Bell et al., 1999). Полипептидная цепь этого консервативного для всех позвоночных белка, характеризуется 11 доменами типа «цинковые пальцы», отвечающими за его ДНК-связывающую активность и необходимыми для функционирования инсулятора (Ohlsson et al, 2001). Позднее стало очевидно, что свойствами, аналогичными свойствам 5 HS4, обладает участок гиперчувствительности к ДНКазе I на 3 границе (і-глобинового локуса Gallus Gallus (3 HSJ (Saitoh et al 2000). С 5 HS4 отделяет р-глобиновый локус от гена фолатного рецептора, который экспрессируется на других стадиях эмбрионального развития, а с 3 конца локус отделен 3 HS элементом от промотора гена обонятельного рецептора, он экспрессируется в других типах клеток, нежели глобиновые гены.
В отличие от р-глобинового локуса а-глобиновый домен сохраняет не конденсированную конформацию хроматина как в эритроидных, так и в неэритроидных типах клеток (это характерно для всех позвоночных), в таком случае можно предположить, что в барьерной функции инсулятора в составе такого домен нет необходимости (Recillasarga, 2000). На 5 конце а-глобинового домена курицы расположены два кластера участков гиперчувствительности к ДНКазе I, причем в состав каждого входят как конститутивные, так и ткапеспецифические участки гиперчувствительности (Razin et al, 1999). Интересной особенностью а-глобинового кластера является наличие целых двух инсуляторов в составе гипер чувствительных участков, причем один соответствует конститутивному, а другой тканеспецифическому. Оба несут в себе CTCF-связывающие последовательности и связывают CTCF in vitro (Valadez-Graham et al, 2004). Несмотря на то, что описано значительное количество инсуляторов позвоночных (Таблица №2), детально изучены, только некоторые из них. Характерным примером участия элементов, подавляющих действие энхансеров. в регуляции генной экспрессии является дифференциально метилируемый домен (differentially methylated domain -DMD) или область, регулируемая импрингингом (imprinted control region - ICR), в составе локуса Igf2/H19 генома мыши, крысы и человека. Экспрессия генов этого локуса регулируется импрингингом, так в отцовской аллели аллсльному исключению подвержен ген Н19, а в материнской Lgf2. ICR расположен между двумя этими генами, ДНК в нем оказывается метилированной только в отцовской аллели. Было установлено, что именно инсулятор в составе DMD отвечает за подавление экспрессии гена Jgf (Thorvaldsen et al 1998, Webber et al, 1998), связываясь с белком CTCF и действуя как разобщитель энхансера и промотера (Hark et al, 2000). Однако метилирование CpG последовательностей ДНК дифференциально метилируемого домена нарушает его связывание с CTCF, позволяя, таким образом, экспрессию гена Igfs отцовской аллели (Holmgren et al, 2001; Burgess-Beusse et al, 2002).
В ходе работ по изучению анти-энханеерных свойств иисуляторов было показано, что, только введя такой элемент между энхансером и промотором, можно функционально изолировать энхансер и таким образом подавить экспрессию гена (Burgess-Beusse et al, 2002) (Рисунок № 6). Эта черта отличает инсуляторы, от таких регуляторных элементов, как саЙлеисеры, которые в экспериментах уменьшают уровень экспрессии репортерного гена, находясь в любом положении относительно пары эпхапсер-промотор. При подавлении активности энхансеров проявляется еще одно свойство инсуляторов - полярность действия (Рисунок №6Б). Например, ICR из локуса Igf2/H19 генома мыши лучше проявляет себя в одной ориентации нежели в обратной (Hark et al, 2000; Bell et al, 2000). Этот факт объясним тем, что регуляторные области значительно больше по размерам, чем участки связывания с CTCF (собственно, отвегсгвепные за активность подавления энхансера), а значит, могут включать в себя регуляторные последовательности другого рода. Этот факт и помешал в рашшх исследованиях выделить энхансерподавляющую активность в районе 5 ги пер чувствительного участка р-глобинового локуса человека, которая была замаскирована энхансером в его составе (Chung et al, 1993).
Давно известно, что перенос гена или группы генов в гетерохроматиновые (неактивные в отношении транскрипции) участки хромосом часто сопровождаются ослаблением или прекращением его экспрессии (так называемый эффект положения), это стало очевидно при использовании методов трансгеноза. Впервые функционально охарактеризованные, как границы между активными и конденсированными доменами хроматина, инсуляторы помимо анти-энхансерной активности часто являются барьерами для распространения гетерохроматина (West et al, 2002). Наиболее изучена барьерные элементы дрожжей (Bi ct al, 1999), однако феномен эффекта положения широко используется для поиска барьерных элементов среди ипсуляторов позвоночных (Pikaart et al, 1998) (Таблица №2). На данный момент одним из немногих и самым изученным инсулятором позвоночных, обладающим барьерной активностью, является 5 HS4. Этот элемент образует 5 границу активного в эритроидных клетках (3-глобинового локуса цыпленка с гетерохроматином. Фланкирование трансгенных конструкций копиями инсулятора 5 HS4 обеспечивает их независимую экспрессию в клетках все типов при создании трансгенных мышей (Wang et al, 1997; Potts et al, 2000; Rivella et al, 2000) и клеточных линий в культуре клеток (Pikaart et al, 1998; Rivella et al, 2000: Recillasarga et al, 2002). В этом проявляется универсальность действия пограничных элементов в различных организмах.
Оценка уровня метилирования гистона НЗ в клетках крови на конечных стадиях дифференцировк
Ранее было показано, что метилирование гистона НЗ по положению Lys9 является первичным сигналом для взаимодействия хроматина с белком НР1 и последующего перехода активного хроматина в гетерохроматин. Также известно, что повышенный уровень метилированного гистона НЗ в составе хроматина характерен для молчащих участков генома. Ранее в нашей лаборатории было показано (Springhetti et al.5 2003), что взаимодействуя с метилированным N-концевым доменом гистона НЗ, in vitro белок MENT вызывает конденсацию хроматина. На основании данных фактов следующим этапом работы было оценить уровень метилирования гистона НЗ по положению Lys9 в клетках крови G. gallus на разных стадиях дифференцировкн.
Уровень метилирования оценивался методом Western-гибридизации с антителами к диметилированному (анти-НЗме2К9) и триметилированному (анти-НЗмеЗК9) по положеник Lys9 гистону НЗ (Рисунок 7В), а также методом иммунофлуоресцентной микроскопии (Рисунок 8). Известно, что триметилированный, но не диметилированный гистон НЗ характерен для перицентромерного конститутивного хроматина. Бьио показано, что уровень как диметилнрованного, гак и триметилированного гистона НЗ остается неизменным как в пролиферируюющих, гак и в зрелых клетках крови (Рисунок 7В). Это соответствует данным о метаболической стабильности метилированного гистона НЗ, так описаны системы, в которых конденсация хроматина вызывается не накопление метилированного гистона НЗ, а его перераспределением в ядре.
Важно отметить, что картина распределения белка MENT в ядрах клеток крови G. gallus совпадает с картиной распределения только диметилированной по положению Lys9 модификации гистона 113 (Рисунок № 8). Из рисунка видно, что распределение триметилированного гистона НЗ по положению Lys9 носит фокусный характер, соответствуя расположению хромосомных центромер, тогда как диметилированный НЗ распределен по всему клеточному ядру.
В последнее время в литературе появилось много данных о перестройках и модификации хроматина, связанных с его активацией. Это, а так же возможность получить моноспецифические антитела высокого титра к модифицированным гистонам и другим белкам хроматина, в том числе коммерческие (например, Upstate Biotechnology) сделали метод фиксации и иммунопреипитации хроматина СЫР основным методом картирования распределения модифицированных пистонов и негистоновых белков хроматина вдоль различных участков генома. Варшавский с коллегами впервые использовали антитела к гистону Н4 для изучения структуры хроматина в активном гене lisp 70 Drosophila melanogaster (Solomon, et al., 1988). Именно этот метод и был выбран нами для оценки взаимодействия белка MENT с последовательностями ДНК в составе Р-глобинового локуса G. gallus.
Рассмотрим принцип иммунопреципитация хроматина, его основные этапы представлены на Рисунке № 8. Материал (хроматин, ядра, живые клетки, ткани или целые эмбрионы) обрабатывается формальдегидом, чтобы зафиксировать ДНК-белковые взаимодействие. Затем, хроматин растворяют, лизируя клетки и обрабатывая пробу ультразвуком. Грубый экстракт осветляют осаждением на центрифуге. После чего проводится иммунопреципитация антителами (AT) к определенному белку. Как только интересующие ДНК-белковые комплексы получены, ДНК очищают от примесей белка и РНК и анализируют с помощью ПЦРа или гибридизации. Несмотря на очевидную трудоемкость, на данный момент CHIP успешно используется для картирования ДНК-связывающих белков в таких организмах как дрожжи (Кно and Allis, 1999), Drosophila (Orlando et al., 1997), Tetrahymena (Dedon, et al, 1991) и человек (Chen et al. 1999). Нами был разработан метод и подобраны условия фиксации и иммунопреципитации хроматина антителами к белку MENT.
Основной проблемой при фиксации ДНК-белковых взаимодействий является поиск условий, при которых одновременно эффективность фиксации достигала бы максимальной величины, но с другой стороны наибольшая часть материала оставалась бы в растворимом состоянии. Мы сразу остановились на концентрации формальдегида 1%, так как именно ее наиболее часто используют для фиксации ДНК-белковых взаимодействий (Orlando, 2000). Фиксацию проводили при температуре +4 С и при комнатной температуре. Однако вскоре выяснилось, что такая разница в температурном режиме проведения реакции не сказывается на эффективности фиксации. За счет использования ингибиторов протеиназ деградации белков удавалось избежать, и мы остановились на проведении фиксации при комнатной температуре.
Особое внимание было уделено подбору продолжительности времени фиксации. Ядра куриных эритроцитов и лимфоцитов фиксировали 1% формальдегидом в течение 1, 5, 15, 30 и 60 минут. Оказалось, что при фиксации куриных эритроцитов в течение в течение 5 минут, а лимфоцитов в течение 15 в растворимом состоянии остается более 50% материала от исходного, при более длительной процедуре эта величина не достигала и 30% (данные не приведены). Количество и размер ДНК, оставшейся в растворимом состоянии после фиксации, оценивали, разделяя ее в агарозном геле (Рисунок № 9).
Далее мы решили установить, насколько белок MENT выпадает в осадок при выбранных условиях фиксации. Для этого лизат ядер куриных эритроцитов, обработанных тем же образом, наносили на ПААГ, а затем наличие белка MRNT в растворимой фракции анализировали с помощью иммуноблотинга. Оказалось, при выбранных условиях в растворимом состоянии остается приблизительно 50% от общего количества белка MENT.
Таким образом, при 5-ти минутной фиксации куриных эритроцитов и 15-ти минутной фиксации лимфоцитов примерно 50% материала, как со стороны белка, так и со стороны ДНК переходит в нерастворимое состояние и выпадает из дальнейшего изучения. Впоследствии мы показали, что при фиксации формальдегидом параллельно образуются ДНК-белковые и белок-белковые сшивки.
Итак, мы остановились на следующих условиях фиксации взаимодействия белка MENT с ДНК:концентрациия формальдегида - 1%, время фиксации -5 (для эритроцитов) и 15 (для лимфоцитов) минут, при комнатной температуре проведения реакции. Эти условия мы и использовали в дальнейшей работе.
Сравнение картины распределения белка MENT с картиной ацетилирования и метилирования гистонов вдоль р-глобинового домена генома Gallus gallus
Эритроциты и лимфоциты происходят от одних и тех же клеток-предшественников, но их пути дифференцировки разделяются в ходе гемопоэза до момента включения генов р-глобинового локуса. Таким образом, в лимфоидной клеточной линии р-глобиновые гены не экспрессируются, а локус находится в неактивном состоянии. Число участков гиперчувствителыюсти к ДНКазе I, отграничивающих р-глобиновые гены, уменьшается на конечных стадиях дифференцировки лимфоидных клеток (Jimenez et al, 1992). Ранее в нашей лаборатории было покачано, что уровень белка MENT в лимфоцитах G.gallus в 5 раз превышает его уровень в эритроцитах. Также было показано (см. выше), что белок MENT гораздо более представлен в хроматине лимфоцитов, но сравнению с хроматином эритроцитов. В связи с вышесказанным мы предположили, что картина распределения белка MENT вдоль р-глобинового домена G.gallus в лимфоцитах и эритроцитах будет отличаться. Так мы ожидали более широкого распространения белка MENT вдоль р-глобинового локуса, неактивного с лимфоидной линии клеток.
Для подтверждения нашего предположения мы провели картирование взаимодействия белка MENT с последовательностями в составе Р-глобинового домена G.gallus в лимфоидных клетках. Для анализа снова использовался метод СЫР, для гибридизации на этот раз были использованы пробы, соответствующие: участку конденсированного хроматина (проба №1), области LCR Р-глобинового локуса (проба № 4), кодирующей области р гена глобинового локуса (проба №7), 3 границе Р-глобинового локуса (пробы № 8, 9, 12) (Таблица № 7).
Картирование белка MENT вдоль р-глобинового домена в лимфоцитах G.gallus показало, значительно меньшее различие в значениях его относительного обогащения по сравнению с эритроцитами. Например, уровень белка на участке р-глобинового гена, соответствующего пробе 7 в лимфоцитах оказался всего в 1,6 раз ниже максимального значения (проба №1), тогда как для эритроцитов значения относительного обогащения для проб 1 и 7 отличались в три раза (Рисунок № 14А).
Наиболее интересным нам показался тот факт, что уровень белка MENT на 3 границе р-глобинового домена (проба 8) лимфоцитах оказался значительно выше, в сравнении с уровнем MENT на аналогичном участке домена в эритроцитах. Полученные результаты говорят о том, что в лимфоидных клетках MENT связывается с последовательностями в составе неактивных в данной линии клеток р-глобиновых генов. Очевидно, что такое накопление гетерохроматинового белка в Р-глобиновом домене не определяется взаимодействием MENT с определенными последовательностями ДНК в составе локуса. Хотелось бы отметить, высокий уровень обогащения белком MENT на 3 границе неактивного В-глобинового домена в лимфоцитах при сохранении такого же минимума обогащения на 5 границе домена, как и в эритроцитах. Это наблюдение согласуется с данными, что 5 , но не 3 пограничный элемент В-глобинового домена G.gaUas сохраняет гиперчувствительность к ДНКазе І в клетках неэритроидного ряда (Saitoh et al, 2000; West et al, 2004). А также с тем, что именно 5 пограничный элемент 3-глобинового домена обогащен ацетилированными гистонами даже в клетках неэритроидного ряда (Litt et al., 2001). Таким образом, конститутивный 5 инсулятор 3-глобинового домена, отмеченный участком гиперчувствительности к ДНКазе I, остается защищенным от взаимодействия с белком MENT даже тогда, когда весь хромосомный домен остается транскрипционно неактивным, а хроматин в его составе находится в конденсированном состоянии. Гистограмма отражает относительное обогащение белком MENT, определенное методом СЫР, для участков В-глобинового домена G.gallus (черным) и гена овальбумина (серым) в эритроцитах и лимфоцитах G.gallus. Вертикальные стрелки обозначают гибридизационные пробы, соответствующие минимуму обогащения белком MENT в районе 5" и 3 пограничных элементов домена. В. Гистограмма отражает относительное обогащение белком MENT, диметилированным и ацетилированным по положению Lys 9 гистоном НЗ. Относительное обогащение определено методом ChIP, для участков Р-глобинового домена G.gallus (черным) и гена овальбумина (серым) в эритроцитах G.gallus. Вертикальные стрелки обозначают гибридизационные пробы, соответствующие минимуму обогащения белком MENT в районе 5 и 3 пограничных элементов домена. Ранее ряд лабораторий показали методом СЫР. что репрессированный хроматин 5 от р-глобинового домена G.galius характеризуется пониженным уровнем ацетилирования гистонов НЗ и Н4 гистонов и повышенным уровнем метилирования гистона НЗ по положению Lys9 (Hebbes et al, 1994; Litt et al., 2001). Поскольку в нашей работе мы использовали другие условия СЫР. нежели в предыдущих работах, было решено подтвердить, что участки обогащенные MENT, соответствуют участкам повышенного метилирования и пониженного ацетилирования гистонов. Для этого использовались стандартные условия для иммуиопреципитации хроматина за модифицированные гистоны. Фиксированный форматьдегидом материал ядер эритроцитов иммунопреципитировали антителами к гистону НЗ, метилированному по положению Lys9, и антителами к гистону НЗ, ацетилированному по тому же положению. Далее полученную ДНК анализировали гибридизацией с последовательностями ДНК в составе конститутивного гетерохроматина {проба №1), 5 пограничного элемента домена (проба № 4) и активного хроматина (проба № 7). Сравнение уровня MENT и модифицированных гистонов на указанных участках р-глобинового домена показало, что гетерохроматиновый участок обогащен MENT и метилированным гистоном НЗ, а уровень ацетилированного гистона НЗ гам очень низок (Рисунок № 14В). Обратная картина наблюдалась для 5 пограничного элемента домена, для него было характерно обогащение ацетилировапным гистоном НЗ. а уровень MENT и метилированного гистона НЗ там был незначителен. Приведенные данные коррелируют с данными, полученными ранее в других группах.
