Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Ингибиторные рецепторы лимфоцитов и их роль в противоопухолевом иммунитете 10
1.1. Иммунотерапия онкологических заболеваний ..10
1.1.1 Роль иммунной системы в противоопухолевой защите 10
1.1.2 Использование моноклональных антител в иммунотерапии .11
1.1.3 Использование иммуномодуляторов для стимуляции противоопухолевого иммунного ответа .14
1.1.4 Противоопухолевая вакцинация 17
1.2. Ингибиторные рецепторы лимфоцитов и их лиганды.. 24
1.2.1. Ингибиторные рецепторы, распознающие константную часть молекул иммуноглобулинов 28
1.2.2. Ингибиторные рецепторы, распознающие молекулы главного комплекса гистосовместимости 31
Иммуноглобулипоподобные рецепторы киллерных клеток. 31
Рецепторы CD94/NKG2. 34
Рецепторы семейства Ly49. , 35
1.2.3. Ингибиторные рецепторы, распознающие молекулы В7 семейства 37
Молекула CTLA-4. 37
Молекула PD-1 39
Молекула BTLA 40
1.3. Роль ингибиторных рецепторов и шлигандов в противоопухолевом иммунитете 41
1.4. Неканоническая молекула МНС lb класса HLA-E. 45
Глава 2. Материалы и методы исследования 49
2.1. Ферменты и реактивы ..49
2.2. Клеточные линии ..49
2.3. Электрофорез в ДСН-ПААГ и иммуноблот-анализ ,49
2.4. Выделение тотальной РНК из клеток меланомы человека 51
2.5. ПЦР в реальном времени .51
2.6. Проточная цитометрия 52
2.7. Анализ клеточной цитотоксичности 52
2.8. Статистическая обработка результатов .53
Глава 3. Результаты и обсуждение 54
3.1. Анализ экспрессии мРНК молекулы HLA-E в клетках меланомы человека 54
3.2. Анализ присутствия белка HLA-E в клетках меланомы человека..56
3.3. Поверхностная локализация молекул HLA-E в клетках меланомны человека 58
3.4. Экспрессия HLA-E в клетках меланомы человека под действием INF-y .62
3.5. INF-y стимулирует транспорт молекул HLA-E на клеточную мембрану 64
3.6. Участие протеасомной деградации белков в INF-y стимулированной презентации молекул HLA-E на поверхности клеток.. 68
3.7. Выход молекулы HLA-E на поверхность клеток под действием INF-y защищает клетки меланомы от цитотоксического действия лимфоцитов . 73
Заключение ..77
Выводы .82
Список цитируемой литературы 83
Благодарности 104
- Использование иммуномодуляторов для стимуляции противоопухолевого иммунного ответа
- Роль ингибиторных рецепторов и шлигандов в противоопухолевом иммунитете
- Поверхностная локализация молекул HLA-E в клетках меланомны человека
- Выход молекулы HLA-E на поверхность клеток под действием INF-y защищает клетки меланомы от цитотоксического действия лимфоцитов
Введение к работе
В настоящее время наблюдается значительный рост числа онкологических заболеваний. Несмотря на разработку многочисленных современных подходов к терапии опухолей, раковые заболевания до сих пор занимают верхние строки в списке причин смерти в большинстве развитых стран. Большинство нехирургических методов лечения, таких как лучевая и химиотерапия, направлены на уничтожение трансформированных клеток, однако при этом страдают нормальные клетки, что вызывает множество побочных эффектов. Использование возможностей иммунной системы для лечения онкологических заболеваний позволяет избежать данных побочных эффектов.
За последнее десятилетие был совершён прорыв в области молекулярной опкоиммупологии, который послужил толчком к разработке многочисленных иммунотерапевтических методов борьбы с трансформированными клетками. Однако и иммунотерапия при внедрении в клиническую практику не всегда даёт положительных результатов [81; 128]. Одним из возможных объяснений недостаточной эффективности различных методов иммунотерапии является ускользание опухолевых клеток от иммунного надзора или индукция трансформированными клетками толерантности опухолеспецифических лимфоцитов.
Описано несколько механизмов, благодаря которым опухоли могут избегать иммунологического надзора: возникновение вариантов раковых клеток с утерей антигенов [155], локальная экспрессия ингибиторных молекул, таких как трансформирующий фактор роста (TGF-P) [151] и Fas лиганд [52], снижение уровня процессинга и презентации антигенов [123], а также потеря молекул МНС на клеточной поверхности [54]. Казалось бы, в
случае снижения или полного исчезновения молекул МНС на поверхности, опухолевые клетки с одной стороны избегают лизиса цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL), но с другой стороны становятся идеальными мишенями для естественных киллерных клеток (NK). Однако было показано, что подобные клетоки часто не чувствительны к NK клеточной цитотоксичности, то есть существует дополнительный, не выявленный ранее механизм ускользания опухолевых клеток от иммунологического надзора. Возможно, что одним из механизмов может быть использование трансформированными клетками иигибиторных сигнальных путей CTL и NK клеток. Считается, что связывание иигибиторных рецепторов на поверхности CTL с соответствующими лигандами представленными на поверхности клеток-мишеней может подавлять эффекторные функции лимфоцитов [86]. Ряд человеческих иигибиторных рецепторов, распознающих молекулы МНС, включает в себя иммуноглобулиноподобные рецепторы киллерных клеток, узнающие классические молекулы МНС класса la (HLA-A, HLA-B, HLA-C) и молекулу HLA-G [165], а также рецепторы пектинового семейства NKG2, распознающие неканоническую молекулу главного комплекса гистосовместимости HLA-E [16].
В 1998 году группа исследователей определила, что HLA-E является основным лигандом гетеромерной молекулы CD94/NKG2A - ингибиторного рецептора большинства NK клеток и уб Т-клеток, а также значительной части ар Т-лимфоцитов [16; 18]. А в работе М. Ulbrecht и коллег было продемонстрировано использование цитомегаловирусом ингибиторной функции молекулы HLA-E для избежания лизиса заражённых клеток NK клетками, путём предоставления мимикрирующего лидерную последовательность HLA-C нанопептида [154]. Таким образом, существует гипотеза о том, что опухолевые клетки со сниженным уровнем МНС класса
la могут взамен увеличивать выход на поверхность неканонических молекул МНС, чтобы избежать как CTL, так и NK клеточной цитотоксичности [105; 134].
В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования являлось изучение возможной роли неканонической молекулы главного комплекса гистосовместимости человека HLA-E в регуляции противоопухолевого иммунного ответа.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи.
Определить уровень экспрессии молекулы HLA-E в клеточных линиях меланомы человека.
Оценить уровень представления молекулы на поверхности опухолевых клеток.
Исследовать влияние факторов опухолевого микроокружения на экспрессию и представленность на клеточной поверхности молекул HLA-E.
Изучить влияние экспрессии молекул HLA-E на цитотоксичность NK клеток в отношении клеток меланомы человека.
Использование иммуномодуляторов для стимуляции противоопухолевого иммунного ответа
Использование моноклональных антител (мАТ) относится к методам пассивной специфической иммунотерапии опухолей, которое стало возможным после разработки в 1975 году Георгом Кёлером и Цезарем Милштейн гибридомной технологии получения моноклональных антител в терапевтических количествах [75]. В настоящее время известно три основных терапевтических подхода с использованием моноклональных антител. Первый включает использование неконъюгированных антител, которые сами способны вызывать гибель опухолевых клеток. Два других представлены антителами конъюгированпыми с токсинами или изотопами (конъюгированные антитела), тем самым, являясь своеобразными перевозчиками цитотоксичных препаратов к опухолевым клеткам.
В основе механизмов противоопухолевого действия моноклональных антител задействованы элементы комплемент-зависимой цитотоксичности (КЗЦТ) и антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦТ), а также модулирование передачи сигналов ростовых факторов и факторов дифференцировки внутрь клетки-мишени [4]. При реализации КЗЦТ после связывания антителом антигена на поверхности опухолевой клетки активизируется многоэтапная система комплемента. На последнем её этапе образуется мембраноатакующий комплекс белков С5/С9, способный формировать поры в цитоплазматической мембране клетки, что, в конечном счете, приводит её к гибели. Вторым важным механизмом является АЗКЦТ. При этом мАТ своим гипервариабельным доменом связывается с соответствующим антигеном на поверхности опухолевой клетки, а константным доменом с Fc-рецептором цитотоксических лимфоцитов. Последние способны синтезировать и выделять белки - перфорины (подобные белку С9 системы комплемента) и сериновые протеазы, повреждающие клеточную мембрану мишеней. Третий механизм действия моноклональных антител основан на характерной для трансформированных клеток суперэкспрессии рецепторов ростовых факторов на клеточной поверхности, которые являются наиболее часто используемыми ТАА. Поскольку чрезмерная активация рецепторов ростовых факторов приводит к прогрессивному росту опухолевых клеток и нечувствительности к химиотерапевтическим агентам, то блокирование передачи сигнала через данные рецепторы с помощью мАТ должно приводить к регуляции пролиферации клеток и возможному восстановлению чувствительности к цитотоксическим агентам [152].
В настоящее время большая группа моноклональных антител против различных поверхностных опухолевых антигенов проходит предклинические и клинические испытания [в]. Примером удачного применения гуманизированных моноклональных антител можно считать разработку препарата трастузумаб (trastuzumab), или герцептин (herceptin), который представляет собой гуманизированное антитело к белку HER2/neo (трансмембранный рецептор эпидермальпого ростового фактора человека) и используется для лечения опухолей молочной железы, в клетках которых синтезируется большое количество этого белка [117]. Другим известным противоопухолевым препаратом на основе химерных моноклональных антител является ритуксимаб (rituximab), который специфически связывается с трансмембранным антигеном CD20. Этот антиген экспрессируется более чем в 95% В-клеточных лимфом. Лечение моноклональными антителами обычно хорошо переносится больными и частота побочных эффектов несопоставима с аналогичным показателем для химиотерапии. Также, в последнее время моноклональные антитела всё чаще применяют в ранней диагностике некторых видов рака.
Несмотря на простоту концепции использования моноклональных антител для терапии злокачественных опухолей, проблема пока далека от полного разрешения. Существует ряд ограничений - это биохимическая и биологическая нестабильность моноклональных антител, сложности фармакокинетики антител (плохая экстравазальная диффузия и проникновение антител в опухоль, быстрое изменение иммунных комплексов на поверхности клетки), иммуногенность мышиных моноклональных антител (образование в ответ на их введение нейтрализующих антител), а также гетерогенность опухоли (когда не на всех опухолевых клетках содержится антиген, против которого направленно данное антитело).
В настоящее время предпринимаются шаги с целью повышения эффективности терапии моноклональными антителами. Так, для снижения иммуногенности мАТ с помощью методов генной инженерии получены химерные и гиперхимерные (гуманизированные) антитела с разным соотношением мышиного и человеческого белка, в результате частота образования нейтрализующих антител в ответ на введение модернизированных антител уменьшается на несколько порядков. Наиболее перспективным в плане повышения биологической активности мАТ считается получение биспецифических антител. Биспецифическое антитело одним плечом гипервариабельного домена связывается с поверхностным антигеном опухолевой клетки, а другим с антигенным рецептором Т клетки, что обеспечивает их тесный контакт [114].
Главным стимулом в развитии иммунотерапевтических подходов при лечении онкологических заболеваний послужило открытие опухолеассоциированных антигенов. В связи с этим, одним из методов иммунной терапии стало создание противоопухолевых вакцин, как наиболее специфичной формы иммунизации против опухолей [45]. Успех вакцин против ряда вирусных заболеваний создал теоретические предпосылки для возможной иммунизации против ТАА, несмотря на то, что далеко не против всех известных вирусных инфекций возможно сформировать защитный иммунитет. Существует также практическая причина привлекательности терапии противоопухолевыми вакцинами - это простота в применении, отсутствие в большинстве случаев побочных эффектов и возможность профилактики онкологических заболеваний.
Роль ингибиторных рецепторов и шлигандов в противоопухолевом иммунитете
Открытие ингибиторных рецепторов на поверхности лимфоцитов и изучение механизмов передачи сигнала через них указывает на возможность полного блокирования цитотоксических функций киллерных клеток, тем самым позволяя клеткам, предоставляющим на своей поверхности лиганды к ингибиторным рецепторам уходить от иммуннологического надзора. В настоящий момент накоплено много подтверждений участия ингибиторных рецепторов в развитии различных аутоиммунных заболеваний, что привело к идее о возможной роли ингибиторных рецепторов и их лигандов в регуляции противоопухолевого иммунного ответа. Так, было показано, что взаимодействие NK клеточного рецептора KIR3DLI с аллотипом HLA-Bw4, а KIR2DL2/3 с аллотипом HLA-Cw3 на поверхности клеток-мишеней приводит к ингибированию NK, уб Т клеточной и CTL цитотоксичности против клеток меланомы человека [9]. Кроме того, генотипирование генов NK клеточных рецепторов (11 генов KIR и 2 гена CD94/NKG2) полимеразной цепной реакцией с использованием наборов аллелеспецифичных праймеров у 96 пациентов с лейкемией и 148 здоровых людей выявило, что у больных уровень встречаемости ингибиторных KIR фенотипов почти в два раза выше, чем у контрольной группы. В этом исследовании также были обнаружены два KIR фенотипа, состоящих исключительно из набора ингибиторных рецепторов, которые были найдены только у больных лейкемией [158]. Таким образом, дифференциальный паттерн экспрессии генов KIR может служить хорошим диагностическим маркёром для некоторых видов опухолей. Например, синдром Сезари (эритродермический лейкозный вариант Т клеточной лимфомы) коррелирует с высоким уровнем экспрессии гена ингибиторногорецеітгораКЖЗВЬ2(С0158)[П8].
Популярным и логичным стало применение на практике моноклональных антител к ингибиторным рецепторам или их лигандам с целью блокирования передачи ингибиторного сигнала. Так, было показано, что введение моноклональных антител против CTLA-4 содействует регрессии некоторых видов мышиных опухолей. На мышиных лимфомах было показано, что уровень эффективного отторжения опухолевых клеток после иммунизации животных вакцинами на основе дендритных клеток напрямую зависит от уровня блокировки CTLA-4 молекул. Более того, только совместное введение вакцины и антител приводило к эффективному отторжению мышиной опухоли, тогда как сами по себе ни вакцина ни администрирование различных доз антител не вызывали эффективного иммунного ответа [93]. Например, Hurwitz А. с коллегами добились существенных успехов и даже регрессии сформированных опухолей молочной железы совместным введением моноклональных антител против CTLA-4 и вакцины на основе клеток карциномы молочной железы SM1, экспрессирующих GM-CSF [61]. Аналогично, высоко эффективное сочетание антител к CTLA-4 и различных методов активной специфичной иммунотерапии было продемонстрировано и в клинических испытаниях на людях. Доктор Steven Rosenberg применил данный подход для лечения больных с IV стадией меланомы и раком почки. Каждые 3 недели пациенты получали дозу моноклональных антител против CTLA-4 отдельно или вместе с пептидной иммунизацией. После проведения курса лечения у большинста пациентов наблюдали прямую активацию CD4+ и CD8+ эффекторных клеток [88]. Участие PD-1/PD-L1 взаимодействий в выработке толерантности опухолевыми клетками было показано на мышиных модельных опухолях: мастоцитоме Р815, меланоме В16 и ряде миеломных клеточных линий. Трансгенная экпрессия лиганда PD-L1 в клетках Р815 приводила к значительному снижению лизиса раковых клеток цитотоксическими Т лимфоцитами ш vitro. При этом эффект полностью исчезал при введении моноклональиых антител против PD-L1. Анализ мышиных миеломных линий выявил природный повышенный уровень лиганда PD-L1 на поверхности клеток. При этом рост миеломных клеток в мышах полностью подавлялся введением моноклональиых антител в лиганду [36]. Известно также, что супрессия функциональных DC приводит к ингибированшо иммунного ответа и прогрессии опухолей у человека. Группа исследователей во главе с Lieping Chen недавно обнаружила, что этот процесс связан с поверхностной локализацией лиганда В7-Н1 (PD-L1) на миелоидных дендритных клетках (МДК) в инфильтратах рака яичника [30]. Более того, выход лиганда на поверхность МКД значительно увеличивается в присутсвии факторов микроокружения карциномы яичника - интерлейкина 10 (IL-10) и фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF). При этом блокирование молекулы ЕННІ моиоклональными антителами увеличивало Т-клеточную активацию и приводило к секреции IL-2 и INF-y. Таким образом, введение больным антагонистов В7-Н1 в одиночку или в сочетании с другими терапевтическими методами, как, например, противоопухолевые вакцины, представляет собой многообещающий подход для существенного улучшения противораковой терапии. Альтернативно можно использовать и блокирование самого рецептора PD-1 моиоклональными антителами, что приводит к аналогичным результатам при лечении как вирусных [15], так и онкологических заболеваний у человека [57]. Экспрессия в образцах ткани от больных раком яичника и раком лёгкого молекулы В7-Н4, которая является линагдом ингибиторного рецептора BTLA, выявляется в 85% и 31% случаев, соответственно [25]. Поскольку, как уже было сказано, в образцах ткани здорового человека экспрессии лиганда В7-Н4 обнаружено не было, то, вероятней всего, появление белкового продукта в опухолевых образцах свидетельствует о роли BTLA/B7-H4 сигнального пути в ускользании от иммунного надзора. Успешное применение моноклональных антител против В7-Н4 также было продемонстрировано на человеческих клетках рака яичника, в сочетании с GM-CSF и IL-4 блокирование молекулы В7-Н4 приводило к регрессии опухоли [77].
Таким образом, эффекторные клетки врождённого и приобретённого иммунитета имеют в своём арсенале набор ингибиторных рецепторов для лучшего узнавания патологических изменений в организме, одновременно обеспечивая умеренный ответ организма, не приводящий к возникновению пагубной аутореактивности. С другой стороны несомненна роль данных рецепторов в формировании толерантности по отношению к опухолевым клеткам и, как следствие, ускользанию опухоли от иммунного надзора. Понимание тонких механизмов работы данных рецепторов, а также методов модуляции проведения сигналов открывает новые горизонты для создания новых средств терапии вирусных инфекций, аутоиммунных болезней, а также онкологических заболеваний.
Поверхностная локализация молекул HLA-E в клетках меланомны человека
INF-y является одним из главных цитокинов, секретируемых цитотоксическими клетками в очагах лизиса клеток-мишеней. Известно, что INF-y вызывает индукцию молекул главного комплекса гистосовместимости человека как I, так и II класса, как часть защитного иммунного механизма, и его присутствие может влиять на статус клеток. Элементы, отвечающие на воздействие INF-y, были обнаружены в промоторной области гена HLA-E, а дистально от элементов также был идентифицирован энхансер к этим последовательностям [11]. Таким образом, для воссоздания условий, в которых находятся опухолевые клетки во время иммунного ответа, мы обрабатывали исследуемые образцы различными концентрациями INF-y.
Клеточные линии меланомы человека культивировали 48 часов в присутствии в среде различных доз INF-y. После чего анализировали уровень транскрипта мРНК HLA-E с помощью ПЦР в реальном времени. Количество полноразмерного белка исследовали методом иммуноблотинга (Рисунок 5). Уровень мРНК генов, контролирующих гомеостаз, таких как GAPDH и р-актин, оставался прежним после воздействия INF-y. Под влиянием цитокина мы наблюдали увеличение уровня мРНК рУмикроглобулина, а также тяжёлых цепей HLA 1а класса. Для молекул HLA-A и HLA-C увеличение было в среднем меньше такового значения для мРНК рУмикроглобулина и составило в 2.2 и 3.5 раза соответственно, тогда как количество мРНК HLA-B выросло после воздействия цитокина в 5 раз. Однако наиболее значительные изменения уровня экспрессии мы получили именно для мРНК неканонической молекулы первого класса гистосовместимости HLA-E. Во всех клеточных линиях наблюдали резкое увеличение, в среднем в 5.5 раз, в количестве мРНК HLA-E (Рисунок 5, Б). Таким образом, мы подтвердили, что воздействие интерферона-гамма на синтез матричной РНК человеческого лейкоцитарного антигена Е происходит именно на уровне транскрипции за счёт регуряторных элементов промоторной и дистальной промоторной зоны гена HLA-E. По результатам иммунноблот-анализа нами также было продемонстрировано изменение в количестве синтезируемого белка. Для большинства исследумых клеточных линий меланомы человека было показано увеличение количества полноразмерной молекулы HLA-E под действием INF-y, и воздействие носило дозозависимый характер (Рисунок 5, А). Из полученных данных можно вывести интересную закономерность: в клеточных линиях с изначально высоким уровнем базальной (т.е. до обработки клеток INF-y) экспрессии, как например в меланомных клетках линий Mel Ibr, индукция цитокином не была ярко выраженной, а в клеточных линиях с низкой базальной экпрессией, как например Mel 259 и Mel Р, индукция достигала соизмеримого с первой группой меланом уровня. Таким образом, можно сказать, что после воздействия INF-y происходило своеобразное выравнивание по количеству белка HLA-E в клетках меланомы человека. Полученные результаты хорошо согласуются с данными других авторов, изучающих влияние цитокинов на экспрессию молекул главного комплекса гистосо вместим ости человека на других опухолевых клетках [12]. Таким образом, можно предположить, что в реальных условиях in vivo уровень защиты опухолевых клеток молекулой HLA-E зависит от локального присутствия INF-y и процесс, скорее всего, является дозозависимым.
Как уже говорилось выше, для регуляции противоопухолевого иммунного ответа и ингибирования функций лимфоцитов важна поверхностная локализация молекул HLA-E. Особый интерес представляют клеточные линии, в которых белок имеется внутри клеток, но по каким-то причинам отсутствует на поверхности. Вероятно, что в условиях модуляции микроокружения может происходить выход молекул HLA-E на поверхность опухолевых клеток. Увеличение количества полноразмерного белка в клетках меланомы человека под воздействием INF-y является важной предпосылкой для INF-y индуцированного, HLA-E опосредованного механизма ускользания опухолевых клеток от иммунологического надзора, однако наибольший интерес к молекуле в нашем исследовании проистекает имеено в области функционирования HLA-E на поверхности клеток в качестве лиганда к ингибиторным рецепторам цитотоксических клеток. Поэтому следующим этапом исследования было изучение выхода на клеточную поверхность комплекса HLA-E в присутствии INF-y в культуральной среде.
В культуральную среду к клеткам меланомы in vitro добавляли рекомбинантный человеческий INF-y до конечной концентрации 100 нг в мл. Также как и в экпериментах по локализации белка на клеточной поверхности в покоящихся клетках, клетки окрашивали моноклональными антителами 3D12 к нативному белку HLA-E, а также антителами к суммарному HLA-АВС, и проводили сравнительный анализ методом проточной цитометрии до и после обработки INF-y.
На Рисунке 6 представлены результаты анализа методом проточной цитометрии присутствия молекул HLA-ABC и HLA-E на поверхности клеточных линий меланомы человека после воздействия INF-y. Видно, что под действием цитокина не происходит существенного увеличения количества мембраноассоциированных молекул МНС 1а класса -единственной линией, в которой наблюдается небольшое повышение плотности HLA-ABC на поверхности, была линия Mel Ibr. На самом деле, мы скорее наблюдали обратный эффект - заметный сдвиг пика в сторону уменьшения поверхностной фракции молекул данного класса.
Выход молекулы HLA-E на поверхность клеток под действием INF-y защищает клетки меланомы от цитотоксического действия лимфоцитов
Логично предположить, что существует связь между индукцией IFN-y усиления протеасомной деградации белков, которая бы обеспечивала тяжёлую цепь HLA-E пептидами, стабилизирующими молекулу на клеточной поверхности. Для ответа на поставленный вопрос мы ингибировали протеасомную деградацию белков с применением традиционных ингибиторов протеасом. В качестве ингибитора протеасом мы использовали ингибитор калпаина I типа и лактацистина - ALLN. ALLN добавляли к обработанным и необработанным IFN-y культивируемым in vitro клеткам и ингибировали в течение 12 часов с последующим анализом клеток на предмет экспрессии молекул МНС I класса методом проточной цитометрии (Рисунок 8).
Из полученных результатов видно, что добавление ALLN к кондиционной среде полностью отменяло способность IFN-y стимулировать выход HLA-E на клеточную поверхность, при этом внутриклеточная концентрация белка по результатам иммуноблот-анализа не менялась. Таким образом, усиление протеасомной деградации белков IFN-y приводит к генерированию пептидов для HLA-E, что, вероятно, стимулирует выход на поверхность неканонической молекулы HLA-E.
Ранее, группой исследователей во главе с Veronique Braud было продемонстрировано, что для формирования функционального пептида, способного связываться с молекулой HLA-E, необходимо сначала отщепление с помощью сигнальной пептидазы сигнальной последовательности классических молекул МНС I класса и неканонической молекулы HLA-G с последующим внутримембранным расщеплением аспарагиновой протеиназой, которая носит название пептидаза сигнального пептида (SSP, от анг. signal peptide peptidase) [14; 87]. Участие же протеасомы в расщеплении сигнального пептида от классических молекул МНС I класса и молекулы HLA-G с одной стороны не очень понятно, так как было показано, что протеасома с большим трудом расщепляет короткие пептиды и в основном специализируется на полноразмерных и удлинённых полипептидных цепях. С другой стороны, если вспомнить, что протеасома при генерировании антигенных пепетидов для классических молекул МНС I класса формирует как раз правильные С-концевые пептиды, но удлиненные на N-конце, тогда как сигнальная пептидаза и SSP формируют удлинённые именно с С-конца пептиды, то участие 26S протеасомы как раз объяснимо.
Таким образом, формирование правильного пептида для закладки в пептид-связывающий домен HLA-E происходит, вероятно, в несколько стадий - сначала происходит формирование правильного N-конца с помощью сигнальных пептидаз, а на второй стадии с помощью протеасомы происходит подгонка пептида с С-конца. Возможно, что такой непростой механизм генерирования антигенного пептида для HLA-E прежде всего связан с несовершенством клеточной системы протеаз, которые в силу узнавания определённых аминокислотных последовательностей, то есть своеобразной "специализации", не могут производить одновременное расщепление в случае несоответствия сайтов. Не стоит также забывать о нестабильности пептидов в цитоплазме клеток: возможно захват протеасомой сигнальных пептидов после расщепления SSP носит не только функциональный характер в формировании правильного С-конца пептида, но также и защитную функцию. В пользу этой гипотезы свидетельствуют данные флуоресцентной микроскопии о локализации 26S протеасомы в цитоплазме клеток близко к поверхности эндоплазматического ретикулума [122]. То есть в свете полученных исследователями результатов можно представить, что после расщепления лидерной последовательности SSP может происходить прямая поставка пептида протеасоме, в отсутствие воздействия цитоплазматических протеаз. Однако попытки найти белки, взаимодействующие с субъединицами 26S на поверхности ЭПР, пока не увенчались успехом, и гипотеза остаётся всего лишь предположением.
Нам удалось показать наличие белка HLA-E в клетках линий меланомы человека, его поверхностную локализацию и индукцию IFN-y. Однако до момента демонстрации функциональной значимости молекулы HLA-E в противоопухолевом иммунном ответе наша гипотеза остается всего лишь гипотезой. Соответственно, следующим этапом нашего исследования стало выявление функциональной активности молекул HLA-E на поверхности опухолевых клеток. Ранее Michaelsson М с коллегами показали, что положительные по NKG2 рецепторам и отрицательные по KIR рецепторам NK-клетки клеточной линии NKL способны лизировать только клетки не несущие молекулу HLA-E на своей поверхности, а клетки с молекулой HLA-E были не чувствительны к цитотоксическому действию NKL клеток [94].
В нашем случе, мы протестировали клетки линии Mel Si, которые постоянно экспрессируют HLA-E на клеточной поверхности, Mel Р, которые презентируют молекулу HLA-E на клеточной поверхности только в условиях индукции IFN-y, а также клеточную линию Mel Ког, у которой полностью отсутсвуют молекулы МНС I класса на поверхности (Рисунок 9).
При анализе клеток линии Mel Si мы обнаружили, что они обладают устойчивостью к лизису NKL даже в условиях высокого соотношения эффекторных клеток к клеткам-мишеням. И наоборот, клеточная линия Mel Ког была чувствительна к NK-клеточному лизису независимо от обработки интерфероном-гамма.
Интересные результаты мы получили при тестировании клеточной линии Mel Р, клетки которой в покоящемся состоянии не экспрессируют HLA-E на поверхности и, соответственно, были чувствительны к лизису NKL клеткам - мы получили 45% специфически лизированных клеток при соотношении 20:1 эффекторных клеток и клеток-мишеней. Прединкубация клеток Mel Р с INF-y делала клетки устойчивыми к NK. клеточному лизису, именно за счёт презентации неканонической молекулы HLA-E на поверхность клеток.
