Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Окислительный стрессу микроорганизмов 10
1.1. Активные формы кислорода и причины их возникновения 10
1.2. Токсическое действие АФК на клетки микроорганизмов 14
1.3. Механизмы устойчивости микроорганизмов к окислительному стрессу 16
1.3.1. Ферменты антиоксидантной защиты 17
1.3.2. Другие компоненты антиоксидантной защиты 22
1 .4. Регуляция клеточного ответа на окислительный стресс 23
Глава 2. Температурные стрессы у микроорганизмов 26
2.1. Клеточный ответ на тепловой шок 26
2.2. Белки теплового шока 26
2.3. Клеточный ответ на холодовый шок 29
2.4. Участие углеводов в клеточном ответе на температурные стрессы... 32
Глава 3. Регуляция стрессового ответа 34
3.1. Роль RpoS-регулона в защите клеток от множественных стрессов... 35
3.2. Другие регуляторные системы клеточного ответа на стрессы 36
3.3. Система регуляции клеток микроорганизмов гуанозинтетра- фосфатом 37
Глава 4. Участие внеклеточных ауторегуляторов в адаптационном ответе микроорганизмов 38
4.1. Внеклеточные факторы адаптации 40
4.2. Аутоиндукторы анабиоза (факторы d,) 42
Глава 5. Физико-химические свойства белков, модифицированных алкилоксибензолами 116
Глава 6. Продукты окисления алкилоксибеизолов и их функциональная активность 126
6.1. Анализ продуктов окисления АОБ 126
6.2. Модификация ферментов продуктами окисления АОБ 138
6.2.1. Модификация трипсина продуктами окисления С7-АОБ 138
6.2.2. Модификация р-амилазы продуктами окисления С?-АОБ 142
6.2.3. Модификация р-амилазы продуктами окисления С]2-АОБ 143
Глава 7. Прикладные аспекты исследований 145
Заключение 151
Выводы 153
Список литературы 154
- Активные формы кислорода и причины их возникновения
- Белки теплового шока
- Другие регуляторные системы клеточного ответа на стрессы
- Внеклеточные факторы адаптации
Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема адаптации микроорганизмов к стрессу является одной из наиболее актуальных проблем микробиологии. Накапливается все больше данных о том, что действие различных стрессовых факторов сопровождается возрастанием в клетках концентрации активных форм кислорода (АФК), вызывающих окислительный стресс. Так, повреждающие эффекты АФК наблюдаются при воздействии на микроорганизмы как высоких [Davidson et al., 1996; Sugiyama et al., 2000; Рихванов с соавт., 2001; 2003], так и низких температур [Park, 2000], высоких концентраций солей [Гейдебрехт, 2003], под действием радиации [Эйдус, 1962].
Молекулярно-биологические исследования внутриклеточных механизмов адаптации микроорганизмов к стрессу позволили получить обширную информацию о событиях, происходящих на уровне реализации генетических программ клеточного ответа: системах репарации ДНК [Rusting, 1992; Романовская с соавт., 2002; 2003], ферментах аптиоксидантной защиты [Terzenbach, Blaut, 1998; Смирнова с соавт., 2001; Брюханов с соавт., 2002; Подкопаева с соавт., 2003], особенностях транскрипции стрессовых белков [Hidalgo, Demple, 1996; De Maio, 1999; Zheng, Storz, 2000], в том числе белков теплового шока, имеющих функции молекулярных шаперонов и участвующих в структурной стабилизации и фолдинге белков [Van der Vies, Georgopoulos, 1996;Shukla, Singh, 1999; Hossain, Nakamoto, 2003]. Вместе с тем, в последние годы в области исследований устойчивости микроорганизмов к стрессовым воздействиям обозначился очевидный интерес к изучению внеклеточных ауторегуляторов, обеспечивающих межклеточную коммуникацию при формировании стрессового ответа клеток. Описан ряд физиологических процессов, ассоциированных со стационарной фазой культур микроорганизмов в ответ на стресс голодания (starvation stress) и достижение критической плотности клеток (quorum sensing), в которых принимают участие ауторегуляторы [Хохлов, 1988; Эль-Регистан, 1988; Dworkin, 1996; Shapiro, Dworkin, 1997; Parsek, Greenberg, 2000]. Однако, роль межклеточных взаимодействий и участие экзометаболитов в системе гибкой защиты клеток пролиферирующих микробных культур от воздействия стрессоров изучены явно недостаточно.
В обсуждаемом аспекте проблемы нас интересовали функции ауторегуля-торов в развитии защитных реакций клетки, контроле процессов динамичной структурной реорганизации и стабилизации субклеточных структур. Претендентами на эту роль могут быть внеклеточные метаболиты, описанные по адаптогенному действию культуральных жидкостей [Воробьева с соавт., 1993; Николаев, 1996; 2000], вещества, содержащиеся в лизатах клеток [Кокоева, Плакунов, 1993], адаптогены белковой природы [Rowbury, Goodson, 2001; Воробьева с соавт., 2003], а также микробные аутоиндукторы анабиоза — факторы d, ^d,), представленные у ряда бактерий и дрожжей алкилоксибензо-лами(АОБ) [Осипов с соавт., 1985; Батраков с соавт., 1993; Мулюкинссоавт., 1996]. По достижении определенного концентрационного уровня АОБ (фд,) контролируют переход микробной культуры к стационарной фазе, развитие в клетках гипометаболического, а затем анабиотического состояний, сопряженных с повышением устойчивости стационарных клеток и покоящихся форм к неблагоприятным и повреждающим воздействиям [Светличный ссоавт., 1986; Эль-Регистан, 1988; Демкина ссоавт., 2000; Лойко с соавт., 2003]. Описанные свойства АОБ предполагают их участие в природных механизмах адаптации клеток микроорганизмов к стрессу. Выяснение функций АОБ в процессах повышения устойчивости клеток и стабилизации субклеточных структур представляется важным для теории стресса и решения практических задач защиты организмов от неблагоприятных воздействий.
Цель работы — изучить роль микробных алкилоксибензолов — ауторегуляторных факторов d,, в адаптации микроорганизмов к сублсталь-ным воздействиям стрессоров различной природы.
Задачи исследований: 1) изучить динамику накопления вне- и внутриклеточных АОБ в культуре Micrococcus luteus, подвергнутой температурному шоку, и выявить их возможную роль как адаптогенов; 2) оценить протекторные функции АОБ в сохранении жизнеспособности клеток пролиферирующих культур бактерий М. luteus и дрожжей Saccharomyces cerevisiae в условиях теплового шока и окислительного стресса различной природы; 3) изучить механизмы действия химических аналогов фd| бактерий (С7-АОБ и С!2-АОБ) и дрожжей (тирозола) в регуляции активности и стабильности ферментных белков; 4) исследовать участие АОБ в аптиоксидантной защите клеток при окислительном
стрессе; 5) определить на молекулярном уровне функционирование АО Б как антиоксидантов, а также изучить качественный состав и функциональную активность продуктов, образующихся при окислении АОБ.
Научная новизна. (1) Установлены основные закономерности саморегуляции формирования стрессового ответа микроорганизмов с участием внеклеточных фа!,, представленных у ряда бактерий и дрожжей алкилоксибен-золами. Выявлена роль АОБ как адаптогенов протекторного типа, защищающих клетки пролиферирующих культур бактерий и дрожжей от стрессовых воздействий разной природы — теплового шока, у-облучения и фотоокисления. Обнаружено, что формирование стрессового ответа бактерий М. luteus сопряжено с повышением биосинтеза АОБ, внеклеточный пул которых служит для их перераспределения между клетками популяции. Установлено, что защитный эффект АОБ при возрастании их концентрации в культуре, подвергаемой стрессовому воздействию, выражается в повышении устойчивости клеток и сохранении их способности к пролиферации. (2) Установлено, что механизм протекторного действия АОБ включает их функционирование как химических шаперонов и эффективных перехватчиков АФК. Впервые показана антиоксидантная активность фенольных соединений в защите клеток от синглетного кислорода. (3) В опытах in vitro впервые показана способность химических аналогов фсі1 {С7-АОБ, С[2-АОБ и тирозола) направленно модифицировать структуру ферментных белков, что приводит к повышению их стабильности и изменению каталитической активности в сторону как активации, так и ингибирования. Установлена зависимость изменения вектора каталитической активности модифицированных АОБ ферментных белков от структуры и концентрации АОБ как лиганда. Обнаружена корреляция между повышением каталитической активности и снижением гидрофобности образующихся комплексов «фермент-АОБ». (4) Впервые проведен анализ продуктов окисления С7-АОБ и С|2-АОБ, полученных в результате их функционирования как ловушек АФК, образующихся в различных условиях (у-облучение, фото- и химическое окисление). Показано многостадийное окисление АОБ с образованием большого числа окисленных мономеров, продуктов их конденсации и полимеров, более полярных, чем нативные АОБ. (5) Впервые установлено, что продукты окисления АОБ, также как нативные АОБ, обладают свойствами структурных
модификаторов ферментов и обуславливают изменение их каталитической активности сопряженно со стабилизацией макромолекул. Показано, что продукты окисления С7-АОБ и С -АОБ более активны как химические шапероны, чем нативные АОБ.
Практическая ценность работы. (1) Полученные в работе результаты могут быть использованы: для разработки эффективных способов антиокси-дантной защиты про- и эукариотических организмов; для совершенствования методов борьбы с микробной контаминацией и биообрастанием; для направленной регуляции роста промышленных штаммов. (2) Разработан способ стабилизации и направленной модуляции каталитической активности ферментов на основе использования в качестве структурных модификаторов белков химических аналогов фс!,. На разработанный способ подготовлена и заявлена патентная документация. (3) Разработан способ высокоэффективного солодо-ращения, основанный на применении химических аналогов феї, в качестве регуляторов ферментативной активности прорастающего зерна и одновременно для деконтаминации ячменя от фитопатогенпой микрофлоры. На разработанный способ получен патент РФ.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 1-ой Всероссийской конференции «Прикладные аспекты химии высоких энергий» (Москва, 2001); 3-ей Международной конференции по стабилизации белка "Biocatalyst stability" (Тулуза, Франция, 2002); V Симпозиуме «Химия протео-литических ферментов» (Москва, 2002); 1-ом Международном конгрессе «Биотехнология — состояние и перспективы развития» (Москва, 2002); Всероссийской научно-технической конференции-выставке «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2003); 35th COSPAR Scientific Assembly (Париж, Франция, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 6 статей и 8 тезисов. Также подготовлены и заявлены 2 патента, получено 1 положительное решение (патент РФ №2002124631/13 (026166)).
Структура диссертации. Диссертация изложена на 178 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов п списка литературы, включающего 297 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 7 таблицами и 67 рисунками.
Активные формы кислорода и причины их возникновения
Все больше накапливается данных о том, что действие различных стрессовых факторов на клетки микроорганизмов сопровождается окислительным стрессом. Например, хотя принято считать, что одной из основных причин ингибирующего действия повышенных температур является агрегация и денатурация клеточных белков [Parsell, Lindquist, 1993], однако при воздействии высокой температуры на микроорганизмы было отмечено увеличение количества АФК [Davidson et al., 1996; Sugiyama et al., 2000], что позволяет рассматривать данный тип стресса как вариант окислительного.
В ряде работ Рихванова с соавторами [Рихванов с соавт., 2001а; 2001b; 2003] анализируются причины возникновения АФК под действием повышенной температуры в клетках микроорганизмов. Было отмечено, что при тепловом шоке у дрожжей происходит значительное повышение интенсивности дыхания. Так, при изменении температуры инкубации дрожжевой культуры Debaryomyces vanriji с 30 до 45С интенсивность поглощения кислорода возрастала на 50%. А при сравнении устойчивости к тепловому шоку (46С) дрожжей Saccharomyces cerevisiae дикого типа и мутанта rho" с дыхательной недостаточностью, выращенных на среде, содержащей глюкозу, оказалось, что мутант, у которого ингибированы процессы дыхания, был гораздо более термоустойчив, чем штамм дикого типа. Блокирование азидом натрия дыхания штамма дикого типа привело к резкому повышению его термоустойчивости. Отсюда был сделан вывод, что увеличение интенсивности дыхания при повышении температуры, а значит, соответствующее повышение концентрации АФК является одной из главных причин гибели клетки от теплового шока.
При изучении действия низких температур (-20С) на дрожжевые клетки S. cerevisiae Парк [Park, 2000] выявил основной повреждающий механизм замораживания-размораживания Этот эффект он охарактеризовал как окислительный взрыв (oxidative burst), при котором был отмечен скачкообразный рост количества супероксидных радикалов. Эксперименты показали важную протекторну го роль в процессе защиты клетки от повреждающего воздействия низких температур антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы, что подтверждает наличие окислительного стресса в данном случае.
В экспериментах по влиянию NaCl на физиологическое состояние дрожжевых культур было обнаружено, что высокие концентрации соли подавляют активность каталазы, вызывая состояние окислительного стресса. Культивирование дрожжей в микроаэробных условиях способствовало уменьшению последствий окислительного стресса и выживанию микроорганизмов при высоких концентрациях соли [Гейдебрехт, 2003].
Основные механизмы появления в клетках бактерий свободных радикалов связаны обычно с нарушениями функционирования электронно-транспортной цепи цитоплазматической мембраны, а у эукариот в митохондриях и микросомах, или при изменении свойств дегидрогеназ. Так, образование первичных свободных радикалов, к которым относятся супероксидный анион-радикал и окись азота (нитроксильный радикал), активизируется при накоплении свободных электронов вследствие нарушения процессов окисления в дыхательной цепи. С другой стороны, водород NADP-H, NAD-H используется для синтеза вторичных свободных радикалов, к которым относятся гидроксильный радикал, синглетный кислород, перекись водорода, пероксинитрит.
При аэробном дыхании происходит полное восстановление молекулярного кислорода, которое осуществляется ферментами дыхательной цепи с затратой четырех электронов, вследствие чего образуется вода и накапливается энергия в виде АТФ. Однако, в процессе дыхания клетки восстановление кислорода может происходить ступенчато, тогда при переносе одного электрона на 02 образуется супероксидный анион-радикал (02 ). Супероксидный радикал генерируется с помощью таких компонентов дыхательной цепи как флавины, х и ноны, цитохромоксидазы [Messner, Imlay, 1999], при функционировании ряда ферментов [Меньшикова, Зенков, 1997], в том числе при аутоокислении NADH-дегидрогеназы, сукцинат-дегидрогеназы, лактат-дегидрогеназы [Imlay, Fridovich, 1991а], а также при фотосинтезе. Помимо реакций биологической природы его возникновение может происходить вне клетки в водных растворах в результате фотохимических, химических и электрохимических процессов.
Перенос двух электронов на молекулу кислорода с образованием перекиси водорода (Н202) может осуществляться при участии оксидазы флавиновой природы или цитохромоксидазы [Imlay, Fridovich, 199lb]. Также источником Н202 могут быть реакции аутоокисления некоторых FeS-бел ков с высвобождением ионов железа Fe2+ [Gardner, Fridovich, 1991; Keyer, Imlay, 1996], спонтанные или катализируемые реакции дисмутации супероксидного радикала.
Супероксидный радикал и перекись водорода могут принимать участие в образовании гидроксилыюго радикала (ОН) в присутствии ионов металлов переменной валентности, таких как Fe2+ и Си+. В реакции Хабера-Вейсса гидроксильный радикал образуется при взаимодействии супероксидного радикала с перекисью водорода: 02- + Н202 + Н+ — 02 + Н20 + ОН ; а в реакции Фентона при одноэлсктроином окислении перекиси водорода: Н202 + Fe2+ — Fe3+ + ОН + ОН . Среди АФК важное место принадлежит синглетному кислороду С02). У большинства живых клеток в темноте основным источником синглетного кислорода служит спонтанная дисмутация супероксидных анионов [Khan, 1970], также реакция взаимодействия супероксидного и гидроксильного радикалов. Хотя синглетный кислород может возникать в некоторых темновых неферментативных и ферментативных процессах, основной путь его появления обусловлен световыми реакциями, которые опосредованы фотосенсибилизаторами.
Белки теплового шока
Много работ по изучению клеточного ответа на повышение температуры культивирования посвящено, так называемым, белкам теплового шока (БТШ) "heat shock proteins" (Hsp). Типичными БТШ являются белки GroEL и DnaK бактерий Е. coll, которым в большой степени гомологичны БТШ других микроорганизмов. Так, в клетках Neisseria gonorrhoeae при температурном шоке выявили 10 различных БТШ, при этом два из них давали перекрестную иммунологическую реакцию с белками GroEL и DnaK Е. coli [Woods et al., 1990].
Группой бразильских исследователей были определены у патогенных бактерий Streptococcus pyogenes индуцированные повышенной температурой белки GroEL и DnaK, которые также являются важными иммуногенами при стрептококковых инфекциях [Lemos et al., 1998; 2000]. Этими же авторами был проведен анализ терморезистентности патогенных бактерий Enterococcus faecium. При температуре инкубации более 37С наблюдалось уменьшение общего белкового синтеза, его минимальный уровень детектировался еще при 55С. Оптимальной температурой для синтеза термоиндуцированных белков с молекулярной массой 65, 75 и 100 кДа было значение 45С. С помощью Вестерн-блот анализа два первых белка были идентифицированы как GroEL и DnaK, белок 100 кДа по мнению авторов является родственным HsplOO [Laport et ah, 2003].
Считается, что БТШ блокируют образование третичной и четвертичной структуры вновь синтезироваї шых белков и обеспечивают транспорт последних через мембрану [Баснакьян, 2003], но главное, они участвуют в стабилизации нативной конформации жизненно важных белков клетки во время стресса [Van der Vies, Georgopoulos, 1996], тем самым исполняя роль молекулярных шаперонов.
При температурной обработке (45С) клеток Clostridium botulinum у них нарастала экспрессия до девяти БТШ, среди которых белок с молекулярной массой 40 кДа с помощью серологической реакции был идентифицирован как DnaJ Е. colL Авторы предполагают, что этот белок выполняет функции молекулярного шаперона и принимает участие в транслокации нейротоксипа и других клеточных белков через мембрану клетки. Также он может участвовать в восстановлении поврежденных белков и в выживании этих бактерий в организме хозяина [Shukla, Singh, 1999].
БТШ принимают участие не только в защите организма от повреждающего действия высоких температур, но и при воздействии других видов стрессовых факторов. Так, например, белок теплового шока HtpG цианобактерий, гомологичный Hsp90, необходимый для повышения термотолерантности этих микроорганизмов, участвует в акклиматизации цианобактерий к низким температурам, а также играет важную роль самостоятельно или в комплексе с другими молекулярными шаперонами в адаптации бактерий к окислительному стрессу. Было показано, что инактивация htpG гена цианобактерий Synechococcus sp. РСС 7942 приводила к уменьшению выживаемости клеток и к увеличению ингибирования фотосистемы II, когда клетки в жидкой среде подвергались освещению высокой интенсивности. При культивировании микроорганизмов на плотной среде с добавлением метилвиологена мутанты htpG" были более чувствительны к стрессу, чем клетки дикого штамма. Предполагают, что интенсивное облучение или метилвиологен в диком штамме цианобактерий повышали экспрессию htpG гена, также как groEL гена [Hossain, Nakamoto, 2003].
При осмотическом шоке в клетках Lactococcus lactic наблюдалась индукция белков теплового шока DnaK, GroEL и GroES. Причем стрессовые белки делились на две группы, быстро и медленно индуцируемые. Синтез быстро индуцируемых белков (группа DnaK) резко возрастал в течение первых 10 мин, а через 15 мин происходило его снижение до промежуточных значений, синтез другой группы белков начинался значительно позже [Kilstrup et al., 1997].
Также было показано, что в клетках Грам-бактерий Shewanellaputrefaciens, широко распространенных в природе и выделенных из водной среды, осадков и нефтяных месторождений [Brettar, Hoefle, 1993; Leblancetal., 2000], в условиях осмотического шока, вызванного добавлением в среду культивирования 1,5% NaCI, индуцировался синтез 37 белков [Leblanc et al., 2003]. Один из этих вновь синтезированных белков на 83% был идентичен белку теплового шока GroEL бактерий Е. соїіи Salmonella typhimurium. При снижении температуры культивирования с оптимальной (25С) до 2С, усиливался синтез 32 белков, причем 11 из них были одинаковыми и для осмотического, и для холодового стрессов. Из этих 11 белков один был идентифицирован как алкилгидропероксид-редуктаза (AhpC) и был гомологичен Ahp бактерий Legionella pneumophila и Campylobacter jejuni на 75% и 61%, соответственно. Этот фермент необходим для защиты клеток от органических перекисей при окислительном стрессе, индуцированном перекисью водорода [Storz, Imlay, 1999] или при фосфорном голодании у бактерий Е. colt [Moreau et al., 2001]. Также было показано, что синтез AhpC индуцировался в клетках Staphylococcus aureus при осмотическом стрессе [Armstrong-Buisseret et al., 1995]; в клетках В. subtilis в ответ на тепловой и осмотический шок и, в том числе, при переходе культуры в стационарную фазу [Hecker, Volker, 1990; Antelmann et al., 1996].
Сериновая протеаза HtrA (DegP), локализованная на внешней стороне цитоплазматической мембраны Е. colt, также является БТШ и необходима для выживания клеток при повышенных температурах. Физиологическая роль протеазы заключается в том, что она участвует в гидролизе денатурированных белков, образующихся в клеточных оболочках при тепловом шоке [Skorko-Glonek et al., 1995]. Была проведена работа по изучению возможного участия HtrA протеазы в протекции клеток от окислительного стресса. Исследования показали, что в мутантных клетках htrA" Е. соїі не возрастала чувствительность к перекиси водорода или параквату, но наблюдалось сильное повышение клеточной чувствительности к ионам железа Fe(II), которые, как известно, увеличивают окисление белков. Исследователи отметили, что индуцированное железом окисление мембранных белков в большей степени регистрировалось в мутантах htrA", по сравнению с диким штаммом. Кроме того, ингибирование роста бактериальной культуры усиливалось при добавлении гидропероксида кумена, который аккумулируется в мембране. Было показано, что синтез HtrA индуцировался ионами железа и гидропероксидом кумена, но не пероксидом водорода и паракватом. Авторы делают вывод, что HtrA участвует в деградации денатурированных окислением белков, локализованных в клеточных оболочках и ассоциированных с мембранами, тем самым, участвуя в защите клеток от окислительного стресса [Skorko-Glonek et ah, 1999].
Другие регуляторные системы клеточного ответа на стрессы
Синтез белков, участвующих в клеточном ответе на действие стрессовых факторов, регулируется различными системами, в основном на уровне транскрипции, которая осуществляется РНК-полимеразой, состоящей из 4 постоянных субъединиц (аарр), изредка замещаемой ст-субъединицы и часто меняющегося активатора, которые определяют выбор места на геноме бактерии [Storz, Toledano, 1994]. Так, для активации синтеза белков теплового шока необходимо присутствие в клетке ст -субъединицы РНК-полимеразы, содержание которой резко возрастает при повышении температуры культивирования микроорганизмов [Van derVies, Georgopoulos, 1996]. Этот сигма фактор ответственен за узнавание промоторной области генов теплового шока. При углеродном голодании образуется свой сигма фактор ст38 (RpoS).
Необходимо отметить, что состояние «открытости» генов стрессового ответа зависит от их строения и уровня суперскрученности ДНК, то есть от ее топологического состояния [Wang, Syvanen, 1992]. В изменении топологии молекулы ДНК принимают участие ферменты топоизомераза I и гираза, а также полиамины [Esposito et al., 1997]. Так, было показано, что диамин путресцин в экспериментах на культурах Е. еоії, подвергнутых различным стрессовым воздействиям, а также in vitro оказывал регул яторное воздействие на топологию ДНК, в физиологических концентрациях повышая степень отрицательной суперскрученности [Ткаченко с соавт., 1996; 1997]. При тепловом шоке происходила диссоциация путресцина и ДНК, что сопровождалось дестабилизацией двойной спирали. Авторы предполагают, что в условиях повышенных температур, приводящих к частичному плавлению ДНК, это может стимулировать процесс раскручивания и расхождения полипуклеотидных цепей [Ткаченко с соавт., 1998]. Это подтверждается тем, что полиамины, в частности путресцин, повышают температуру точки плавления ДНК [Esposito et al., 1997]. Этой же группой авторов было показано участие путресцина в защите бактериальных клеток от окислительного стресса [Tkachenko et al., 2001]. Добавление путресцина к культуре Е. coli, подвергнутой действию окислителя, приводило к повышению степени выживаемости клеток. Предполагается, что он принимает участие в регуляции экспрессии oxyR и katG в присутствии перекиси водорода. Белок RpoS (KatF), crs или ст38—альтернативная сигма-субъединица РНК-полимеразы с молекулярной массой 38 кДа. Индукция гена rpoS наблюдается в течение перехода культуры в стационарную фазу при исчерпании в среде источника углерода [Hengge-Aronis, 1993; Lange, Hengge-Aronis, 1994], а также при клеточном ответе на увеличение в среде осмотического давления [Loewen, Hengge-Aronis, 1994; Hengge-Aronis, 1996].
Сигма-субъединица РНК-полимеразы в клетках Е. coli контролирует экспрессию более чем 30 генов и оперонов, которые вовлечены в устойчивость микроорганизмов к голоданию, множественным стрессам в течение стационарной фазы и высокому осмотическому давлению окружающей среды [Lange, Hengge-Aronis, 1991]. Это такие гены, как katE и xthA, кодирующие ферменты каталазу HPII и экзонуклеазу III, которые участвуют в клеточном ответе на окислительный стресс; гены, кодирующие более 10 белков связанных с делением клетки (bolA и ftsZ), ее морфологией, структурой наружной мембраны, процессами транспорта. Большая группа генов, находящихся под контролем сг5-субъединицы, участвует в формировании нуклсоида; изгибании и топологии ДНК, например, ген topA, кодирующий ДНК-топоизомеразу; модуляции степени суперскрученности; а также ее репарации и защиты [Conter et al., 1997; Farewell et al., 1998]. Так, было показано, что белок Dps, синтез которого индуцируется в клетках Е. coli в условиях голодания или окислительного стресса, участвует в протекции ДНК от окислительных агентов in vitro и in vivo [Altuvia et al., 1994; Martinez, Kolter, 1997]. а5-Субъединица контролирует несколько генов ответственных за синтез гликогена (glgB + glgCA), трсгалозы (treA), полифосфатов, микроцинов В17 и С7. Среди генов, контролирующих энергетический метаболизм и анаболизм, только гены, кодирующие пиру вато ксидазу, цитохромоксидазу (участвует в анаэробном обмене), гидрогеназу, кислую фосфатазу АррА и белок-регулятор этого оперона, находятся в составе RpoS-регулона. Как видно из перечисления, эти белки и гены соответствуют фенотипу стационарной культуры, прежде всего той его части, которая связана с устойчивостью к стрессам и переживанию неблагоприятных условий [Ishihama, 1997].
Было показано, что регуляция белка RpoS осуществляется на уровне контроля его стабильности, так как в растущих клетках это очень нестабильный белок и время его полужизни составляет меньше 3 мин из-за того, что ot і активно расщепляется протеосомой ClpX/ClpP [Zgurskaya et al., 1997]. Обнаружен ген rssB, активирующий протеолиз RpoS и обладающий высокой гомологией с генами белков-регуляторов двухкомпонентных систем, тестирующих качество среды. Однако, второго компонента этой пары, белка-сенсора, найти не удал ось [Muffler et al., 1996]. Но как оказалось, регулятор RssB активируется без участия типичного сенсора путем фосфорилирования за счет внутриклеточного ацетилфосфата [Boucher et al., 1998].
Есть данные о том, что среди вновь синтезируемых белков около 15 составляют ядро, которое синтезируется при любых типах голодания, также и при других видах стрессов [Nystrom, Neidhardt, 1992]. К этим белкам относятся описанные выше молекулярные шапероны, известные как белки теплового шока (GroEL, GroES, DnaK, GrpE, HtpH, HtpM), гистоноподобный белок H-NS, играющий важную роль в формировании нуклеоида и топологии ДНК. Индукция подобных белков показана нетолько для бактерий Е. сой. При недостатке глюкозы и железа, а также под действием высоких температур в клетках Neisseria gonorrhoeae индуцируется экспрессия некоторых белков. Один из них Gsp63 гомологичен белкам теплового шока Hsp60 [Pannekoek et al., 1992].
Внеклеточные факторы адаптации
При изучении кислотной толерантности бактериальных клеток Е. coli было обнаружено, что она связана с секрецией в культуральную жидкость компонентов белковой природы, которые не имеют видоспецифичности и могут изменять устойчивость к вариациям рН среды других бактерий [Rowbury et а!., 1998]. Повышение кислотоустойчивости клеток Е. coli, развивающееся у них при культивировании в слабокислой среде, было сопряжено с одновременным развитием чувствительности к высокой щелочности среды. Оказалось, что этот феномен опосредован внеклеточным компонентом, представленным низкомолекулярпым термостабильным белком [Rowbury, Hussain, 1998]. В других работах было показано наличие внеклеточного фактора адаптации к повышенным значениям рН и температуры (42С) [Hussain ct ah, 1998]. Анализ полученных результатов позволил предположить, что эти регуляторы принимают участие в общей системе адаптации бактерий к стрессу, в том числе к высоким концентрациям активных форм кислорода (окислительному стрессу) и изменению концентрации питательных веществ (starvation stress) [Rowbury, 1998; Rowbury, Goodson, 2001].
При изучении биосинтеза внеклеточного компонента, необходимого для обеспечения кислотной толерантности Е. coli при рН 5, было показано, что он образуется из внеклеточного предшественника, синтезируемого конститутивно, а процесс образования активной формы индуцируется в условиях стресса [Rowbury, Goodson, 1999b]. Предшественник, который представляет собой термостабильный белок, синтезировался клетками, не подвергнутыми действию кислотного стрессора, растущими при рН выше 7. Молекулы предшественника активировались при рН 4,5-6, а также при нагревании и действии ультрафиолетовых лучей [Rowbury, Goodson, 1999а]. Таким образом, бактериальные клетки постоянно образуют внеклеточные «зонды качества» среды, которые активируются только в неблагоприятных условиях и параллель) ю с этим индуцируются внутриклеточные механизмы адаптации [Rowbury, 1998; Rowbury etal., 1999].
В других работах по сгрессоустойчивости Е. coli было показано, что растущая бактериальная культура, обработанная тетрациклином, образует (неиден-тифицированные)протекторныеэкзометаболиты. Добавление культуральной жидкости, содержащей их, обеспечивало рост клеток Е. coli в присутствии бактсриостатической концентрации тетрациклина и в условиях высокой температуры, а также обуславливала сокращение времени адаптации бактерий к N-этилмалеимиду (NEM) и высокому осмотическому давлению [Николаев, 1996а; 1996b]. Аналогичные по биологическому действию протекторные соединения выделялись клетками Е. сой при неблагоприятных условиях различной природы: высокая (48С) или низкая температура (5-15С), добавление N-этилмалеимида [Николаев, 1997с].
Также было обнаружено, что в культу рал ьных жидкостях, полученных при супраоптимальных (41-44С) и сублетальных (48-50С) температурах, присутствовали внеклеточные протекторные соединения двух типов, образуемые Е. соїі в условиях теплового шока [Николаев, 1997а]. Они были описаны как фактор X,, защитное действие которого выражалось в предотвращении или уменьшении лизиса клеток под воздействием 9 мкМ N-этилмалеимида, и фактор ХГ снижающий скорость роста культуры (после 60 мин инкубации с ним) и увеличивающий жизнеспособность клеток в присутствии 200 мкМ NEM. Оба внеклеточных адаптогена являлись низкомолекулярными веществами с массой менее 10 кДа и устойчивыми в широком диапазоне рН 1-11 [Николаев, 1997b; Николаев, Воронина, 1999]. По совокупности характеристик X,, следует считать протектором-адаптогеном прямого действия, а X, — индуктором, запускающим систему повышения жизнеспособности клеток. Также адаптогеї (Ы типа фактора Хп обнаружены у бактерий В. subtllis и дрожжей Candida utilis, а адаптогены типа фактора Xf—у Pseudomonasfluoresceins и В. subtilis [Николаев, Воронина, 1999; Николаев с соавт., 2000].
На примере пропионовокислых бактерий было показано, что они синтезируют внеклеточные метаболиты с антимутагенными свойствами, при добавлении которых к культуре тест-объекта Salmonella typhimurium снижался мутагенный эффект 4-нитрохинолин-1-оксида [Воробьева с соавт., 1993], а также УФ, азида натрия, метилнитронитрозогуанидина, аминоакридина [Vorobjeva et ai., 1996; 2000]. Позже авторы показали, что, кроме пропионовокислых бактерий, подобные соединения образуют лактобациллы, стрептококки, б иф идо бактерии и кишечная палочка [Воробьева с соавт., 1995].
Также отмечено, что реактивирующее действие культуральной жидкости бактерий Luteococcus japonicus subsp. case/, родственных пропионовокисльш бактериям, на клетки тех же бактерий, подвергнутых УФ-облучению или нагреванию, было обусловлено присутствием в культуральнои жидкости экзамета-болита белковой природы [Воробьева с соавт., 2003].
Можно также упомянуть другие неидентифицированные внеклеточные факторы адаптации микроорганизмов. Так, например, экстремально гало-фил ьные гал оба ктери и Halobacterium salinarhmi в условиях гипоосмотичсского шока выделяли в среду метаболиты сфункцией сигналов «осмотической тревоги» [Кокоева, Плакунов, 1993]. Эти метаболиты, представленные низкомолекулярными соединениями нелипидной природы, являлись продуктами осмолиза клеток галобактерий и способствовали приобретению осмоустойчивости клетками, инкубированными в их присутствии.
Достаточно хорошо известно, что адгезия клеток микроорганизмов на твердых поверхностях является их универсальной адаптивной реакцией к действию таких неблагоприятных факторов, как резкое изменение температуры, присутствие ядов, недостаток питательных веществ, высыхание [Звягинцев, 1986]. Различают две фазы адгезии, обратимую и необратимую [Marshall, 1996]. Прямым доказательством защитного действия обратимой адгезии являлось повышение устойчивости к летальному действию NEM прикрепленных к стеклу клеток Bacillus Ucheniformis по сравнению с неприкрепленными клетками [Родионова, Николаев, 2004]. Этот механизм адаптации также контролируется внеклеточными метаболитами.
Так, было показано, что обратимая адгезия регулируется веществами, находящимися в культуральнои жидкости, внесение которой вместе с отмытыми клетками значительно уменьшало количество прикрепленных клеток либо совершенно подавляло адгезию. Была установлена химическая природа антиадге-зинов Psendomonasfluorescens, оказавшихся высокомолекулярными парафинами [Николаев с соавт., 2001] и внеклеточной протеазой [Николаев, Пани ков, 2002].
