Введение к работе
Актуальность исследований. Животные и населяющие их микробные сообщества представляют собой сложно организованную систему с устойчивой структурой, в которой взаимодействие элементов строго сбалансировано, связано с разграничением функций и их специализацией.
В ходе индивидуального развития особи формируются органы и ткани, где имеются доступные для бактерий органические источники питания, поддерживается тепло, влажность. Микроорганизмы развиваются на поверхности кожного покрова животного, в различных отделах пищеварительного тракта, дыхательного и слухового путей, слизистых выстилках ано-генитальной области. Они принимают участие в Формировании неспеииФической_защиты организма и его иммунного статуса, в пищеварении, химической коммуникации, обеспечивают хозяина необходимыми продуктами микробного метаболизма (Hungate, 1966; Петровская, МаркоД976; Нейчев, 1977; Стейниер и др., 1979; Lee, 19S5; Newman, Nisengaard, 1988; Бабин и др., 1994;Ташюск, 1995; Шендеров, 1998 и др.).
Физиолого-биохимические особенности симбиоптных бактерий позволяют использовать их в биотехнологических целях. Одним из активно развивающихся в настоящее время направлений использования симбионтов является разработка пробиотических препаратов для животных - живых микробных пищевых добавок, воздействующих на организм путем улучшения его микробного баланса (Fuller, 1992), стимулирующих обменные и иммунные процессы (Тараканов и др., 2004). Актуальность задачи получения эффективных пробиотиков определяется потребностями современного индустриального животноводства, птицеводства, рыбоводства в стимуляторах роста животных, и связано с ухудшением экологической, санитарно-эпидемиологической обстановки в мире на фоне тенденции общества к ограничению применения в кормах антибиотиков. В странах ЕС с 2006 года вводится запрет на использование антибиотиков в составе кормов для животных; аналогичный вопрос обсуждается и общественностью России (Ли, 2003; Миронов, Малов, 2004). Это ведет к увеличению спроса на пробиотики как альтернативы антибиотиков. Однако научные основы создания таких препаратов (в первую очередь, факторы, помогающие установлению хозяин-микробного симбиоза), источники выделения бактерий с пробиотическими свойствами, обоснованный подбор штаммов, использующихся в препаратах, механизмы их действия, реакции животного на введение пробиотика - разработаны и изучены недостаточно.
К числу перспективных направлений микробной биотехнологии относится создание пробиотических препаратов, в состав которых входят микроорганизмы с целлюлолитическими свойствами в связи с проблемами российского кормопроизводства. В последние годы структура фуражного сырья в стране претерпела значительные изменения, связанные с вынужденным введением в корма трудно перевариваемых и низкокалорийных компонентов (отруби, рожь, овес,
ячмень, просо), увеличивших долю клетчатки в рационах животных. Это поставило задачу повышения ее переваримости, поскольку клетчатка оказывает существенное влияние на эффективность использования питательных веществ корма. Накопление растительных отходов, обогащенных клетчаткой (пивная дробина, различные типы шротов, жомов и др.), вызвало попытки их утилизации путем скармливания крупному рогатому скоту, свиньям и птице, что также создало необходимость разработки препаратов, стимулирующих пищеварение клетчатки. Поэтому актуально изучение внутренних цепей питания растительноядных животных с высокой степенью переваримости клетчатковых волокон, выделение из них целлюлолитических и иных симбионтных бактерий, участвующих в пищеварении, и разработка биотехнологии промышленного получения и применения таких микроорганизмов.
Теоретический и практический интерес представляют и другие направления использования микросимбионтов, такие, как индикация состояния здоровья хозяина (Клемпарская, 1972), биодеградация токсических органических соединений (Безбородое и др., 1998) и др. В литературе отмечена роль симбионтных бактерий в образовании информативных летучих соединений - половых феромонов, участвующих в химической коммуникации животных (Albone, Perry, 1975; Gorman, 1976; Michael et a!., 1976; Brown, Schcllinck, 1992). Это указывает на возможность микробиологического получения препаратов, связанных с решением проблем размножения животных.
Настоящая работа основана на исследовании органов и тканей диких животных, в которых обитают симбионты, исходя из положения, что животные являются природным фондом микроорганизмов с разнообразными и уникальными физиолого-биохимическими свойствами (Заварзин, 1987).
Цель работы: изучение мутуалистических взаимодействий микроорганизмов и животных, выделение симбионтных бактерий - продуцентов биологически активных веществ и разработка способов их применения.
Задачи работы:
-
исследовать взаимодействия микроорганизмов и позвоночных животных в отдельных органах и тканях хозяина: кожном покрове, слизистых выстилках репродуктивной системы, пищеварительном тракте;
-
выделить перспективные для практического применения штаммы бактерий, изучить их культуральные и физиолого-биохимическис свойства;
-
исследовать воздействие выделенных микроорганизмов и их метаболитов на биохимические и поведенческие реакции животного-реципиента;
-
создать основы технологии получения препарата на основе симбионтного продуцента биологически активных веществ с учетом физико-химических условий места обитания микроорганизма;
5) провести испытания опытных партий препарата в рационе домашних,
сельскохозяйственных животных, пушных зверей и оценить полученный эффект.
Научная новизна и теоретическая значимость работы. В работе исследованы механизмы взаимодействий хозяина и микроорганизмов, развивающихся на поверхности кожного покрова, в специфических кожных железах, в слизистых выстилках репродуктивной системы, в слепой кишке. Полученные данные позволили расширить представления о функциональной роли отдельных симбиотических систем и микросимбионтов. Выявлено новое значение бактерий специфических кожных желез позвоночных, секрет которых попадает в пищеварительную систему: микроорганизмы, входящие в состав сбалансированного в ходе индивидуального развития особи бактериального ценоза, выступают в роли пробиотиков, которые передаются от родителей детенышам. Показано, что симбиотические _взаимодействия между животным и вагинальным микробным ценозом направлены на совместную деятельность цо регуляции отношений между полами и обеспечение успешного воспроизводства хозяина. Важное фундаментальное значение имеют исследования симбиотических взаимодействий в кишечном тракте растительноядных млекопитающих и птиц в связи с пищеварением клетчатки при дефиците азота в кормах. Из слепой кишки растительноядной птицы выделен и охарактеризован штамм Bacillus subtilis> обладающий пробиотическими свойствами. Сделано предположение о механизме симбиотического влияния бациллы на регуляцию—и—етймуяяцнго—обменных—прицепив у животного посредством метаболитов - продуктов тверд6^"аиїого~сбра^йвшщя_растительньіх компонентов кормов.
На основе изучения физико-химических условий жизнедеятельности симбионтпых бактерий в химусе слепой кишки растительноядных позвоночных разработаны основы твердофазного сбраживания клетчатковых растительных отходов с использованием кишечной бациллы B.subtilis. Разработана оригинальная двухстадийная технология получения пробиотического препарата - стимулятора пищеварения животных.
Практическая значимость работы. Создан пробиотический препарат Пробиоцел, имеющий существенное экономическое значение при применении в животноводстве, птицеводстве. Разработана нормативно-техническая документация для производства Пробиоцела (опытный регламент, технические условия, наставления по применению). Препарат испытан в рационах сельскохозяйственных животных: бройлеров, свиней, телят, молочных коров - в хозяйствах Московской, Белгородской областей, Алтайском крае. Получены положительные результаты при использовании Пробиоцела и его модификаций в хозяйствах. Комбинирование разработанного штамма B.subtilis, стимулирующего пищеварение у животных, с клетчатковыми растительными отходами (пивной дробиной) позволяет при введении
данных отходов в рацион сельскохозяйственных животных получить дополнительные привесы живой массы животных, увеличить удои молока повышенной жирности.
Выделение из секрета специфической кожной железы микроорганизма Microbactirium oxydans с пробиотическими свойствами открывает возможность использования специфических желез позвоночных животных в качестве нового источника пробиотиков.
Разработанный методологический подход к созданию в искусственных условиях бактериальных композиций, летучие метаболиты которых имитируют запах эстралыюй самки, аттрактивный для самцов своего вида, может быть применен при микробиологическом получении препаратов, стимулирующих воспроизводство сельскохозяйственных, домашних и содержащихся в неволе животных.
Положения, выносимые на защиту:
1. Комплексный подход к изучению мутуалистических взаимодействий
микроорганизмов и животных, включающий зоологические предпосылки
(анатомическое строение органов и тканей, физиолого-биохимические свойства
хозяина, особенности поведения), микробиологические исследования, в сочетании с
применением достижений современной биотехнологии являются научной основой
выделения симбионтных бактерий-продуцентов биологически активных веществ и
разработки эффективных препаратов с их использованием.
-
Специфические кожные железы позвоночных животных служат источником пробиотиков, которые передаются от родителей детенышам для обеспечения нормального развития и функционирования животного организма.
-
Участие симбионтных микроорганизмов в химической коммуникации между самцом и самкой проявляется в выделении бактериями летучих метаболитов, которые Вйцяютна половое поведение самца, стимулируют процесс воспроизводства животныхГ^^-^ — — .
-
Бактерии вида Bacillus subtilis, участвующие в начальных этапах анаэробного расщепления клетчатки при дефиците азота, входят в состав нормального кишечного микробиоценоза животных и выполняют важные функции по регуляции углеводного и азотистого обмена веществ хозяина. Общий характер выявленных мутуалистических взаимодействий позволяют животным различной видовой принадлежности (свиньям, курам, крупному рогатому скоту, пушным зверям, собакам) при содержании на рационах, включающих клетчатку, использовать данные бактерии в качестве пробиотических стимуляторов пищеварения.
-
Особенности физико-химических условий жизнедеятельности симбионтных бактерий в химусе слепой кишки являются основой разработки биотехнологии твердофазного сбраживания растительного субстрата.
6. Двухстадийная схема получения пробиотического препарата с
использованием выделенного штамма B.subtilis, включающая аэробное глубинное
накопление биомассы пробиотика с последующим твердофазным сбраживанием
растительных отходов, позволяет получить стабильный препарат с контролируемыми свойствами, высоким биологическим и экономическим эффектом.
Публикация материалов. По теме диссертации опубликовано 36 научных работ, в том числе 21 - в рецензируемых изданиях, получены 2 патента РФ. Получен Диплом «Concours Lepine» (Paris), 2000; Золотая медаль ВВЦ, 2003; Золотая медаль IV Московского Международного Салона инноваций и инвестиций, 2004.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях: 2-е Всесоюзное совещание по химической коммуникации животных. Москва, 1983; 4-й Всесоюзный съезд по териологии, Москва, 1986; 4-е Всесоюзное совещание по проблемам морских гидробионтов, Москва, 1986; Vth Int. Congress of Ecology, Iokohama, Japan, 1990; Chemical signals in vertebrates - VII, Tubingen, 1994; Проблемы эволюционной и экологической морфологии, (Школа-семинар), Москва, 15-16 мая 2001; Всероссийская конференция «Сельскохозяйственная микробиология в 19-21 веках», С.-Петербург, 14-19 июня 2001; 1-й Международный Конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития», Москва, 14-18 октября 2002; Научно-практическая конференция, посвященная 85-летию академика РАСХН АЛ.Калашникова «Проблемы кормления сельскохозяйственных животных в современных условиях развития животноводства», Дубровины, 9-10 февраля 2003; 2-й Московский международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 10-14 ноября 2003; Международная конференция «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы», Москва, ВВЦ, 2-4 июня 2004; Всероссийский симпозиум «Биотехнология микробов», Москва, 2004; 3-й Московский международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 14-18 марта 2005.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения и выводов, списка литературы; содержит 249 страниц текста, в том числе, 54 таблицы, 84 рисунка. Список цитируемой литературы включает 330 источника, из них 119 на иностранных языках.
В данном разделе освещены известные фундаментальные представления о мутуалистических связях микроорганизмов и животных - предпосылки для использования микросимбионтов в биотехнологических целях. Отмечены перспективные направления практического применения бактерий.
