Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Ауторегуляторные di-факторы микроорганизмов и возможность их воздействия на генетический аппарат бактери альной клетки 10
1.1. Многообразие внеклеточных ауторегуляторных di-факторов микроорганизмов и их влияние на бактериальную клетку 12
1.2. Основные закономерности взаимодействия низкомолекулярных лигандов с ДНК 23
Глава 2. Материалы и методы исследований 33
2.1. Объекты исследования. Приготовление образцов 34
2.2. Оптические методы , 36
2.2.1. Измерение спектров поглощения 36
2.2.2. Регистрация спектров люминесценции 39
2.2.3. Термическая денатурация ДНК и измерение оптической плотности 40
2.3. Капиллярная вискозиметрия 42
2.4. Электрофорез в агарозном геле 43
2.5. Методы микроскопии 44
2.5.1. Атомно-силовая микроскопия 44
2.5.2. Сканирующая электронная микроскопия 47
2.6. Методы статистической обработки результатов 48
Глава 3. Доказательства взаимодействия ауторегуляторных di-факторов с ДНК 49
3.1. Гипохромный эффект при взаимодействии dj-факторов с ДНК . 50
3.2. Определение характера взаимодействия di-факторов с ДНК люминесцентным методом 3.3. Визуализация комплексов ДНК с с!гфакторами 61
3.4. Количественная оценка связывания молекул di-факторов с ДНК.. 65
3.5. Конформационныи В-+А-переход молекул ДНК в присутствии di-факторов при изменении относительной влажности 67
Глава 4. Устойчивость ДНК к экстремальным воздействиям в присутст вии d -факторов 77
4.1. Изменение температуры плавления ДНК в присутствии dj-факторов 78
4.2. Чувствительность ДНК к УФ-облучению в присутствии ds-факторов 82
4.2.1. Влияние УФ-облучения на линейные молекулы ДНК в при сутствии di4)3KTopoB 84
4.2.2. Влияние УФ-облучения на кольцевые молекулы ДНК в присутствии гі].факторов 88
4.3 Длительное сохранение физико-химических свойств ДНК в при сутствии di-факторов 94
Заключение 100
Выводы 106
Список использованной литературы 108
- Многообразие внеклеточных ауторегуляторных di-факторов микроорганизмов и их влияние на бактериальную клетку
- Основные закономерности взаимодействия низкомолекулярных лигандов с ДНК
- Гипохромный эффект при взаимодействии dj-факторов с ДНК .
- Изменение температуры плавления ДНК в присутствии dj-факторов
Введение к работе
Общая характеристика работы
Актуальность темы исследования
Ауторегуляторные d|-факторы микроорганизмов, по своей химической природе относящиеся к производным алкилоксибензолов (АОБ), в последние десятилетия стали предметом интенсивного изучения (Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И., 2000, Мулюкин А.Л. и др., 2005).
Первым из выявленных механизмов влияния АОБ на метаболическую активность и физиологическое состояние бактериальных клеток стало их взаимодействие с мембранными липидами (Эль-Регистан Г.И. и др., 1979, Reusch R.N., Sadoff H.L., 1983), следствием чего является увеличение микровязкости цитоплазматической мембраны, изменение её проницаемости для моновалентных ионов и следующее за этим обезвоживание клетки (Капрель-янц А.С. и др., 1985). Эффект взаимодействия АОБ с ферментными белками (Беспалов ММ. и др., 2000) проявляется в изменении скорости катализа с одновременным существенным повышением устойчивости белковых глобул к различным экстремальным воздействиям (Колпаков А.И., 2000). На клеточном уровне результатом взаимодействия АОБ с биополимерами и надмолекулярными структурами является контроль обменных процессов, включая выраженное иигибирование метаболизма и образование цистоподобных покоящихся форм микроорганизмов (Эль-Регистан Г.И. и др., 1979), характеризующихся повышенной резистентностью к различным стрессорным воздействиям (Пронин СВ. и др., 1982, Демкина Е.В. и др., 2000).
В то же время, как формирование анабиотического состояния, так и повышение стрессоустойчивости клеток, предполагают стабилизацию основного носителя генетической информации - ДНК - с приобретением ей устойчивости к повреждающему воздействию широкого спектра абиотических и биотических факторов (Setlow Р., 1995, Azam Т.А. et al., 1999). При этом АОБ в силу
особенностей своего химического строения являются одними из достаточно вероятных кандидатов на эту роль.
Однако, имеющиеся данные как о возможности взаимодействия АОБ с ДНК, так и о результатах подобного контакта до настоящего времени немногочисленны, а иногда и противоречивы. С одной стороны, описан повреждающий эффект АОБ на ДНК, включающий Си(П)-зависимое расщепление ДНК с ингибированием её репарации (Starck S.R., Deng J.Z., Hecht S.M., 2000), а также мутагенное действие АОБ на клетки про- и эукариот (Маргулис А.Б. и др., 2005). С другой стороны, хорошо документированным является антимутагенное действие АОБ (Gasiorowski К., Brocos В., 2001), а также связываемый с их воздействием эффект компактизации нуклеоида в покоящихся бактериальных клетках (Мулюкин А.Л. и др., 2005), сопровождающийся изменением эла-стовязкости ДНК.
В пользу актуальности исследования взаимодействия АОБ с ДНК говорят и перспективы применения полученных результатов для совершенствования методов направленного воздействия на метаболические процессы в бактериальных клетках и их генетический аппарат. Кроме того, актуальным представляется и исследование процессов формирования функциональных надмолекулярных структур на основе ДНК и АОБ, потенциально востребованных в таких перспективных областях как биотехнология и биоинженерия.
Цель и задачи исследования
Цель работы - исследование взаимодействия алкилоксибензолов - химических аналогов ауторегуляторных di-факторов микроорганизмов с ДНК, а также оценка последствий подобного взаимодействия.
Для достижения этой цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:
Изучить возможность прямого взаимодействия алкилоксибензолов -химических аналогов ауторегуляторных di-факторов микроорганизмов, различающихся строением и биологической активностью, с ДНК.
Визуализировать результат взаимодействия структурно различных АОБ с ДНК.
Определить конформационное состояние ДНК в присутствии структурно различающихся АОБ при изменении относительной влажности.
Исследовать влияние АОБ на чувствительность ДНК к экстремальным факторам (температура, УФ-облучение), а также динамику изменения физико-химических свойств ДНК в водных растворах в присутствии АОБ.
Научная новизна
На основании анализа ряда физико-химических характеристик ДНК в присутствии синтетических аналогов ауторегуляторных ф-факторов микроорганизмов впервые установлен факт прямого взаимодействия между этими молекулами, что расширяет список биополимеров бактериальной клетки, способных устанавливать контакт с АОБ.
Изучение флуоресцентных характеристик структурно различных АОБ в присутствии ДНК, а также поведения флуоресцентного зонда пирена в смесях ДНК-АОБ показали, что взаимодействие между данными молекулами может вести к формированию вокруг ДНК гидрофобного окружения. Впервые показано, что в результате взаимодействия одного из наиболее биологически активных АОБ - гексилрезорцина - на ДНК формируются устойчивые мицелло-подобные наноструктуры. При этом развивающееся во времени увеличение подобных образований и их слияние в более крупные агрегаты соответствует картине компактизации нуклеоида бактериальной клетки при воздействии АОБ.
Установлено влияние химических аналогов ауторегуляторных dr факторов микроорганизмов на конформационную подвижность ДНК при уменьшении относительной влажности, результатом которого является замедление В—»А-перехода в присутствии метилрезорцина и его ускорение в присутствии тирозола и гексилрезорцина, что может быть одной из причин метаболической инертности ДНК в покоящихся клетках микроорганизмов.
Выявлено повышение температуры плавления ДНК в присутствии АОБ, а также защитное действие последних на линейные и кольцевые молекулы ДНК при УФ-облучении, что является экспериментальным объяснением высокой УФ- и терморезистентности покоящихся форм микроорганизмов, образование которых индуцируется АОБ. Показан факт длительного сохранения вязкостных и электрофоретических свойств полимерных молекул ДНК в водных растворах в присутствии ауторегуляторных di-факторов, что моделирует процесс консервации генетического материала в цитозоле покоящихся клеток микроорганизмов.
Практическая значимость
Полученные результаты, свидетельствующие о формировании вокруг нитей ДНК оболочек из химических аналогов ауторегуляторных ф-факторов микроорганизмов, изолирующих их от водного окружения, потенциально мо-
гут быть использованы в нескольких областях современной микробиологии, биохимии и биоинженерии, а именно:
при разработке методик консервации генетического материала бактериальных клеток, позволяющих сохранять их ДНК в нативных условиях;
при создании частиц для трансфекции и доставки лекарственных препаратов или плазмидной ДНК в клетки про- и эукариот.
Одной из возможных технологий также является способ получения надмолекулярных композитов из молекул гексилрезорцина и ДНК, характеризующихся взаимноупорядоченным расположением, на который получено решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2005110818/13 от 13.04.2005.
На защиту выносятся следующие положения:
Алкилоксибензолы - химические аналоги ауторегуляторных dr факторов микроорганизмов взаимодействуют с ДНК. Это взаимодействие носит различный характер в зависимости от химического строения di-факторов, их молярного соотношения с ДНК и времени совместной инкубации. При определённых условиях в присутствии одного из ауторегуляторных di-факторов (гексилрезорцина) на нитях ДНК образуются упорядоченные надмолекулярные структуры.
Взаимодействие с химическими аналогами ауторегуляторных d|-факторов влияет на скорость конформационного В—*А-перехода ДНК при снижении относительной влажности воздуха и оказывает протективное действие на ДНК, заключающееся в повышении температуры её плавления, защите от УФ-облучения и замедлении гидролитических процессов.
Публикации
Основные результаты изложены в 12 печатных работах, в числе которых 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК для публикации результатов диссертационных исследований.
Апробация работы
Результаты исследований обсуждались на международной конференции «Молодая наука - XXI веку» (Иваново, 2001); III, VI и VIII международных конференциях «Опто-, наноэлектроника, нанотехпологий и микросистемы» (Ульяновск, 2001, 2004 и 2006), III межрегиональной конференции молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружаю-
щей средой» (Саратов, 2006), международной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2006).
Структура и объём диссертации
Диссертация состоит из введения, четырёх глав, заключения, списка использованной литературы из 194 источников, включает 127 страниц машинописного текста, в том числе 28 рисунков и 4 таблицы.
Многообразие внеклеточных ауторегуляторных di-факторов микроорганизмов и их влияние на бактериальную клетку
В современной микробиологии существует концепция, согласно которой развивающаяся клеточная культура представляет собой саморегулирующуюся систему, поведение которой определяется как воздействием внешних факторов, так и влиянием ауторегуляторных метаболитов, контролирующих скорость и этапность развития культуры [I]. Оригинальные отечественные и зарубежные статьи по низкомолекулярным микробным ауторегуляторам обобщены в монографии А.С. Хохлова [2]. В последние годы опубликован ряд работ по микробной колониальной организации и биокоммуникации, в которых микробная колония рассматривается как целостная структура или даже надор ган изм енная (биосоциальная) система, подобно социумам муравьев или млекопитающих [3-5], а выделяемые ею химические вещества выступают в качестве факторов межклеточной коммуникации и социального поведения.
Неуклонно расширяется список работ, посвященных плотностноза-висимой (кворумзависимой) коммуникации [6-8], состоящей в том, что по концентрации сигнального вещества коллектив организмов оценивает собственную плотность. Если эта плотность достигла определённого порогового значения (кворума), то предпринимаются те или иные коллективные действия. К числу описанных к настоящему времени явлений относятся, например, биолюминесценция у морских бактерий, где в роли диффундирующих химических факторов коммуникации выступают аци-лированные лактоны гомосерина. Кроме ацилированных производных го-мосеринлактона другие (в частности, грамположительные) бактерии используют также пептидные факторы плотностнозависимой коммуникации, например, определяющие спорообразование у бацилл. В роли факторов межклеточной коммуникации могут выступать и некоторые аминокислоты (глутамин, аспарагиновая кислота), например, глутамин необходим для образования клеток-швермеров у Proteus, последующая стимуляция движения которых осуществляется упоминавшимися выше ацилированными производными гомосеринлактона [9].
Терминология, применяемая для обозначения метаболитов с конкретной сигнальной функцией весьма многообразна. Классификация их построена на выяснении типа взаимодействий: меж- или внутривидовых, а также их характера: благоприятного или вредного для микроорганизма [10]. Термин «семиохемики» был предложен для обозначения всех метаболитов с сигнальной функцией [11], разделяющихся на два класса и обеспечивающих межвидовые (алломоны, кайромоны, депрессоры) и внутривидовые (аутоксины, аутоингибиторы адаптации, феромоны) взаимодействия. Следует отметить, что как классификация, так и терминология метаболитов с сигнальной функцией достаточно условна, поэтому в последнее время наиболее употребимым стал термин «факторы ауторегуляции».
В наиболее общем определении под ауторегуляторными факторами понимаются физиологически активные соединения различной химической природы, выделяемые микробной популяцией или её частью в окружающую среду, не используемые в целях конструктивного и энергетического метаболизма, но играющие в клеточном сообществе сигнальную роль к изменению количественного (скорость роста) и качественного (дифференциация) состояния микробной культуры [12]. В соответствии с последним, группу таких метаболитов называют факторами d (от англ. differentiation). Показано, что микроорганизмы различных таксономических групп в про цессе развития их периодических или непрерывных культур синтезируют и выделяют в окружающую среду ауторегуляторные метаболиты двух типов: аутостимуляторы автолиза (факторы d2) жирнокислотной природы [13] и аутоиндукторы анабиоза (факторы di), являющиеся фенольными соединениями [12,14]. Одной из последних и наиболее полных работ, посвященных вопросам ауторегуляции образования покоящихся форм бактерий, механизмам анабиоза и основным свойствам аутоиндукторов анабиоза -факторов db является монография Бухарина О.В. с соавт. [15].
Фенольные соединения представляют собой один из наиболее многочисленных классов природных соединений с различной биологической активностью [16], состоящие из одного ароматического бензольного кольца и являющиеся производными фенола (оксибензола) или дигидроксифе-нола (диоксибензола - резорцина) [17] . Фенольные липиды состоят из фе-нольной части и углеводородной цепи (различной длины), соединённой с ароматическим ядром. Наиболее часто встречающимися являются резор-цинольные липиды, присутствующие в различных живых организмах и представленные широким спектром гомологов и изомеров. Фенольные липиды, имеющие алкильный радикал и две ОН-группы в метаположении называют алкилрезорцинами или алкилоксибензолами (АОБ).
Основные закономерности взаимодействия низкомолекулярных лигандов с ДНК
Прежде, чем перейти к вопросу взаимодействия ДНК с веществами различной химической природы, кратко рассмотрим как организована и стабилизирована ДНК. Компонентами нуклеиновых кислот (НК) являются относительно гидрофобные основания, способные за счёт водородных связей образовывать пары. Основание ковалентно связано с сахаром, к которому присоединена фосфатная группа (эти связанные компоненты называются нуклеотидами). При поликонденсации таких веществ между мономерами возникают фосфодиэфирные связи и образуются НК. Когда между основаниями образуются водородные связи, полярная часть каждого из них становится менее доступной для воды; поскольку гетероциклы явно гидрофобны (особенно по сравнению с сахаром и заряженным фосфатным остатком), в НК, где присутствуют водородные связи, основания расположены т.о., что они минимально соприкасаются с водой, находятся внутри и окружены гидрофильными фосфатно-углеводными цепями [75].
Первичную структуру ДНК определяет последовательность ковалентно связанных нуклеотидов. Под вторичной структурой понимают, как правило, ближние взаимодействия, приводящие к образованию двойной спирали. При этом последовательность оснований в двух цепях комплементарна. Молекулы ДНК существуют в виде линейных и кольцевых форм. В линейной форме находится большинство природных ДНК, но ДНК ряда вирусов и фагов, а также ДНК хлоропластов, митохондрий, цен триолей и бактериальных плазмид обладают кольцевой структурой. Третичная структура линейных и кольцевых форм ДНК характеризуется спи-рализацией и суперспирализацией [76]. Например, в вегетативных клетках бактерий кольцевая молекула ДНК существует в виде топологически замкнутых, прикреплённых к мембране суперспирализованных петель [77].
Молекулярная структура ДНК может изменяться при варьировании различных факторов: повышении температуры, изменении влажности, состава растворителя, ионных условий, кислотности и др. Возможны несколько структурных форм двойной спирали (информации) - А-, В-, С-, Z-формы, отличающихся степенью закручивания, ориентацией плоскостей оснований относительно оси спирали и биологическими функциями [78].
В образовании биологически активной структуры НК, существенное участие принимают низкомолекулярные вещества различной химической природы, которые принято называть «лигандами» [79]. Некоторые из этих веществ, находясь в микроколичествах в клетке и изменяя структуру НК, нарушают процессы передачи генетической информации (репликацию, транскрипцию и трансляцию), вызывают одно- и двунитевые разрывы в ДНК и приводят к генетическим аномалиям. Последнее, однако, может быть использовано при создании новых лекарственных препаратов проти-вомикробного, противовирусного, противоопухолевого действия, поскольку избирательное связывание лиганда с ДНК патогенных микроорганизмов приводит к ингибированию их размножения, а в случае онкологических заболеваний может подавлять нерегулируемое деление раковых клеток.
Наряду с самостоятельным действием на функционирование биосистем молекулы-лиганды могут оказывать и опосредованное влияние. Например, существенно изменять (усиливать или, наоборот, ослаблять) влияние различных внешних физических факторов (излучений, теплового воздействия) на биологические макромолекулы, а также действие различных химических агентов [80].
Различают несколько видов взаимодействия органических и неорганических соединений с макромолекулами. ДНК является полианионом с отрицательными зарядами на каждом звене своей полимерной цепи, поэтому наиболее активно взаимодействовать с ней будут катионы за счёт электростатических (кулоновских) сил [75, 81].
Под ван-дер-ваальсовыми силами подразумевают силы межмолекулярного взаимодействия. Основу их составляют кулоновские силы взаимодействия между электронами и ядрами одной молекулы и ядрами и электронами другой. На определенном расстоянии между молекулами силы притяжения и отталкивания уравновешивают друг друга, и образуется устойчивая система. Ван-дер-ваальсовы силы заметно уступают химическому связыванию. Именно эти взаимодействия удерживают частицы в ассо-циате, а не сильные химические связи [75, 79].
Под гидрофобными взаимодействиями понимают силы эффективного притяжения между окружёнными водой неполярными органическими группами (-СНз, -СН2, -СН). Их происхождение объясняется нарушением характерной для воды сетки связей и обусловлено возрастанием свободной энергии системы при растворении в воде молекул, имеющих углеводородные (гидрофобные) группировки, и носит энтропийный характер. Гидрофобное взаимодействие проявляется во многих случаях: при образовании стопочных структур оснований НК, компактизации белковых молекул и формировании глобулярного строения белков, а также при образовании бислойных фосфолипидных мембран [75, 78-79].
Гипохромный эффект при взаимодействии dj-факторов с ДНК .
Спектр поглощения вещества определяется в первую очередь химической структурой молекулы. Однако положение максимума поглощения (KKLKC) И молярный коэффициент экстинции (є) претерпевают заметные изменения под влиянием окружения. Имеется в виду влияние рН, полярности растворителя или соседних молекул и относительная ориентация соседних хромофоров. Именно эти факторы лежат в основе использования метода спектрофотометри и для характеристики макромолекул. Биологические макромолекулярные структуры характеризуются высокой упорядоченностью пространственного расположения своих составных элементов и большой степенью сложности, что сопровождается формированием специфических оптических эффектов.
В работе исследовалось поглощение в ультрафиолетовой области растворов ДНК в присутствии АОБ. Типичные спектры dj-факторов представлены на рис. 3.1. Пространственно положения максимумов АОБ и ДНК разделены незначительно, что создаёт определённую сложность при изучении спектров смесей ДНК-ГР, ДНК-MP и ДНК-Т. Так ДНК имеет максимум 260 нм, максимум MP приходится на длину волны 274 нм и имеется дополнительный максимум 280 нм, ГР имеет только один максимум - 280 им, а у Т, аналогично MP, основной максимум приходится на 276 нм, дополнительный - на 282 нм.
Несмотря на некоторые отличия, в сериях экспериментов, различающихся концентрацией ауторегуляторных факторов, наблюдается сходное спектральное поведение систем. Спектры поглощения смесей ДНК с АОБ подчинялись правилу аддитивности спектров поглощения отдельных компонентов на начальных сроках исследования, но проявляли гипохромный эффект после инкубации смесей, что иллюстрирует рис. 3.2. на примере ГР. Это явление регистрировалось при изучении оптического поглощения смеси ДНК+Т (до 0,16), было наиболее выражено в смесях ДНК+ГР (до 0,31) и практически незначимо в смеси ДНК+МР.
Наиболее существенные изменения оптической плотности растворов ДНК-АОБ наблюдаются с увеличением концентрации АОБ (рис. 3.3). Уменьшение поглощения при увеличении концентрации АОБ отражает стабилизацию нативной структуры ДНК, аналогично гипохромному эффекту.
Для объяснения гипохромизма - снижения коэффициента экстинции хромофора вблизи соседних хромофоров в молекулах полипептидов и белков, олигонуклсотидов и ДНК [150] традиционно привлекается модель ди-поль-дипольного взаимодействия, предложенная Тиноко [151]. В ряде случаев она даёт удовлетворительное качественное согласие с опытом, однако очень часто наблюдается сильное количественное и качественное расхождение, в связи с чем неоднократно выдвигались различные модификации этой теории: дисперсионная, поляризационная, а также их синтетические варианты [150]. Все теоретические модели исходят из предложения, что гипохро-мизм есть результат межхромофорных взаимодействий. Однако гипохро-мизм суспензий нельзя объяснить с позиции межмолекулярных взаимодействий. Наиболее вероятно, что он обусловлен той же причиной, что и гипо-хромизм макромолекул со стопкообразным расположением хромофоров — взаимной экранировкой хромофоров от света [150].
Спектральные изменения растворов ДНК-АОБ, наблюдаемые с увеличением концентрации АОБ, могут происходить вследствие образования водородных связей между молекулами. Поэтому для выяснения природы таких спектральных изменений необходимо ставить вспомогательные эксперименты. Следует указать, что развитие гипохромизма связывают с образованием более упорядоченной структуры ДНК, например в результате взаимодействия с ней молекул-интеркаляторов [81, 87, 119]. Однако, выраженная зависимость эффекта от длины алкильного радикала, обуславливающего различия в структуре применяемых АОБ, тогда как полярные головы были однотипны, потребовали иного объяснения механизмов формирования комплексов ДНК-АОБ, как например в случае взаимодействия с ДНК катион-ных поверхностно-активных веществ [104].
Изменение температуры плавления ДНК в присутствии dj-факторов
Полученные данные о прямом взаимодействии между молекулами ДНК и АОБ с формированием надмолекулярных комплексов определили задачу исследования результатов подобного взаимодействия на чувствительность ДНК к воздействию таких факторов среды обитания микроорганизмов как температура, УФ-облучение и спонтанный гидролиз.
Учитывая существование ряда хорошо документированных доказательств высокой терморезистентности покоящихся клеток микроорганизмов, образование которых индуцируется АОБ, представляется целесообразным проведение спектрофотометрического исследования термической денатурации ДНК в присутствии di-факторов различного химического строения, концентраций и временных экспозиций.
Еще одной перспективной задачей является анализ УФ-резистентности линейных и кольцевых молекул ДНК, а также влияние на нее предварительной инкубации ДНК с АОБ. Для выявления глубоких необратимых повреждений ДНК будет проведено облучение ДНК ультрафиолетом при 254 нм с последующей регистрацией изменения картины её электрофоретической подвижности в агарозном геле.
Наконец актуальным является анализ динамики физико-химических свойств полимерных молекул ДНК в присутствии ауторегуляторных dr факторов (на примере исследования вязкостных характеристик и электрофоретической подвижности), что моделирует длительное нахождение генетического материала в цитозоле покоящихся клеток микроорганизмов.
В качестве подхода, позволяющего оценить взаимодействие АОБ с ДНК, нами было использовано явление тепловой денатурации (плавления) макромолекулы, заключающееся в нарушении стекинга между комплементарными основаниями с последующим переходом ДНК из состояния дву-нитчатой спирали в однонитчатый клубок, что регистрируется по степени увеличения ее оптической плотности. При этом распространенным взглядом на роль низкомолекулярных веществ в данном процессе является их сравнение со «скрепками», стабилизирующими структуру ДНК и, тем самым, изменяющими количественные параметры плавления. В частности, ранее эффект повышения температуры плавления ДНК был показан у целого ряда низкомолекулярных лигандов - ионов двухвалентных металлов, акридиновых красителей и, что наиболее важно, для некоторых органических растворителей [178], также как и АОБ способных к гидрофобным взаимодействиям с ДНК.
Изучение процесса термической денатурации ДНК, проводимое на основе измерения значений поглощения растворов данной молекулы при 260 нм, позволило зарегистрировать типичные кривые плавления, возникающие в результате нарушения стекинга оснований между взаимнокомпле-ментарными нитями и переходом «спираль —» клубок» с формированием гиперхромного эффекта. Соответствующий прирост оптической плотности в этом случае характеризовался величиной (ДН) - 0,37, а прочими зарегистрированными параметрами являлись температуры начала и окончания плавления (Т1т=41С, Т0П=69С), ограничивающие диапазон плавления (ДТ) равный 27С (рис.2.3 и табл.2).
На этом фоне наиболее общим результатом, регистрируемым в смесях ДНК+АОБ, стал сдвиг кривых плавления в сторону более высоких температур, наиболее выраженный при использовании максимальных концен траций АОБ и проявляющийся в увеличении значений точки начала плавления (Тнп) в среднем на 4-5С, а точки окончания плавления (Топ) на 1-3С, с соответствующим уменьшением диапазона плавления. В наибольшей степени подобные изменения были выражены в вариантах комплексо-образования ДНК с ГР, затрагивали единичные параметры плавления при использовании Т и были статистически незначимы в случае MP.
Концентрационные зависимости формирования тугоплавкости комплексов АОБ+ДНК продемонстрированы на примере ГР на рис. 4ЛА. При этом каждое увеличение концентрации ГР на порядок вело к росту значений Т„п на 2-3С, так что ее величина при соотношении ГР:ДНК (по нук-леотидам) 10:1 составила 46С. Дополнительной особенностью выявленных концентрационных зависимостей стало снижение выраженности ги-перхромного эффекта при увеличении концентрации ГР, в случае использования его максимальной концентрации составившего около половины от контрольных значений (ДН=0,18).
Похожие диссертации на Взаимодействие алкилоксибензолов - ауторегуляторных d1-факторов микроорганизмов с ДНК
