Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 11
1.1 Краткая характеристика ассоциативного растительно-микробного взаимодействия и ассоциативных бактерий рода Azospirillum 11
1.2 Основные гликополимеры поверхности бактериальной клетки 16
1.3 Бактериальные жгутики 19
1.4 Социальное поведение бактерий 22
Глава 2 Объекты, материалы и методы исследования 32
2.1 Бактериальные штаммы и плазмиды 32
2.2 Питательные среды и условия культивирования бактерий 33
2.3 Растения, использованные в работе, и условия их выращивания 34
2.4 Инсерционный мутагенез бактерий 35
2.5 Анализ плазмидного состава бактерий. Препаративное выделение плазмидной и тотальной ДНК. Клонирование ДНК 35
2.6 Секвенирование ДНК. Биоинформационный анализ нуклеотидных и предсказанных аминокислотных последовательностей . 36
2.7 Анализ жирнокислотного состава бактериальных клеток 37
2.8 Изучение индивидуальной и социальной подвижности бактерий 37
2.9 Характеристика бактериальных биопленок . 38
2.10 Изучение бактериальной колонизации корней проростков пшеницы 38
2.11 Просвечивающая электронная микроскопия 40
2.12 Статистическая обработка результатов 40
Глава 3 Результаты и обсуждение 41
3.1 Характеристика кодирующих последовательностей р85, прилегающих к месту вставки вектора pJFF350 у мутанта
A. brasilense BK570 с ускоренным роением 43
3.2 Генетико-физиологическая характеристика омегонового мутанта A.brasilense SK039, имеющего дефекты в образовании полярного жгутика и роении 45
3.2.1 Анализ первичной структуры ДНК, прилегающей к вставке омегона у мутанта A. brasilense SK039, имеющего дефекты в образовании полярного жгутика и роении. Идентификация кодирующих последовательностей и характеристика предсказанных продуктов
Получение омегоновых мутантов A. brasilense Sp245 с дефектами в жгутиковании и подвижности и анализ их культурально-морфологических свойств . 53
Анализ первичной структуры ДНК, прилегающей к вставке омегона у мутантов A. brasilense Sp245.1063 и A. brasilense Sp245.1610.
Идентификация кодирующих последовательностей и характеристика предсказанных продуктов их трансляции 59
Инсерционный мутагенез хромосомной копии гена flhB сопровождается дефектами в образовании полярного и латеральных жгутиков у бактерий штамма A. brasilense Sp245.1063 59
Инактивация плазмидного гена fabG1, кодирующего гомолог 3-оксоацил-[ацил-переносящий белок]-редуктазы, и блокирование образования латеральных жгутиков и работающего полярного жгутика у бактерий штамма A. brasilense Sp245.1610
Формирование биопленок на абиотических поверхностях штаммом A. brasilense Sp245 и его мутантами, дефектными по роению
Колонизация корней проростков пшеницы бактериями штамма A. brasilense Sp245 и его мутантами с измененными полисахаридами 68
Заключение 76
Выводы 83
Список сокращений и условных обозначений 85
Список использованных литературных источников 87
- Основные гликополимеры поверхности бактериальной клетки
- Растения, использованные в работе, и условия их выращивания
- Секвенирование ДНК. Биоинформационный анализ нуклеотидных и предсказанных аминокислотных последовательностей
- Генетико-физиологическая характеристика омегонового мутанта A.brasilense SK039, имеющего дефекты в образовании полярного жгутика и роении
Введение к работе
Актуальность темы. Объект исследования – стимулирующие рост растений почвенные альфапротеобактерии вида Azospirillum brasilense. Эти бактерии обладают разнообразными характеристиками, существенными для взаимовыгодного ассоциативного взаимодействия с растениями: способностью к азотфиксации и денитрификации, синтезу фитогормонов, аэротаксису и хемотаксису, индивидуальной (активное плавание в жидкостях) и социальной (роение или распространение по влажным поверхностям с образованием микроколоний) подвижности, формированию биопленок и др.
Посредством активного передвижения (A. brasilense имеют редко встречающееся смешанное жгутикование), используя межклеточную коммуникацию и микромодификацию внешней среды, азоспириллы заселяют новые территории, в том числе, фитосферу. Эти бактерии распространены в разнообразных климатических поясах и приспособлены как к самостоятельному существованию, так и к формированию ассоциаций с широким кругом растений (Assmus et al., 1995; Bashan and Holguin, 1997; Molina-Favero et al., 2008; Spaepen et al., 2009, 2013; Fibach-Paldi et al., 2011; Helman et al., 2011). Достаточно давно известна способность азоспирилл и к существованию в организме человека (Cohen et al., 2004).
Геномом азоспирилл, как и многих других альфапротеобактерий, большого размера (до 8 миллионов пар нуклеотидов), состоит из одной или более хромосом и многочисленных плазмид. Это достаточно пластичная структура, что позволяет этим микроорганизмам свободно существовать в разнообразных экологических условиях (Martin-Didonet et al., 2000; Кацы, 2002; Петрова с соавт., 2005; Kaneko et al., 2010; Katsy, 2011; Wisniewski-Dy et al., 2011). С использованием разнообразных экспериментальных подходов наиболее хорошо изучены бактерии штаммов A. brasilense Sp7 (типовой) и Sp245 (факультативный эндофит, привлекающий особое внимание в связи со способностью к проникновению в корни пшеницы). Недавно были опубликованы данные о почти полной нуклеотидной последовательности хромосомы и шести плазмид (из семи известных) A. brasilense Sp245 (Wisniewski-Dy et al., 2011) и ряда других штаммов азоспирилл. Однако значительная часть предсказанных генов азоспирилл не имеет гомологов в существующих базах данных; функция лишь 60–67% генов может быть более или менее достоверно предсказана; и лишь очень небольшая фракция этих генов была исследована экспериментально.
В последние годы стало понятно, что бактерии могут собираться в организованные группы, обмениваться информацией, распределять задачи, учиться на прошлом опыте благодаря краткосрочной эпигенетической памяти и совместно выбирать наиболее оптимальные варианты взаимодействия с внешней средой и другими организмами, т.е. вести “социальную” жизнь, ранее считавшуюся привилегией только высших организмов (Ben-Jacob, 2008). Исследования разнообразных проявлений социального поведения микроорганизмов (“ощущение кворума”, формирование биопленок, роение, тянущая подвижность и пр.) способствуют развитию нового раздела микробиологии – социомикробиологии (Parsek and Greenberg, 2005).
Одним из факторов, определяющих адаптивные возможности азоспирилл, является их подвижность. Она обеспечивается наличием жгутиков, что позволяет посредством тактических реакций перемещаться к наиболее благоприятным условиям, закрепляться на поверхности высших организмов, в том числе, растений. В жидких средах азоспириллы перемещаются благодаря наличию единственного полярного жгутика, а на плотных и полужидких средах подвижность обеспечивается синтезом многочисленных латеральных флагелл (Hall and Krieg, 1983, 1984; Falk et al., 1985; Khammas et al., 1989; Schloter et al., 1994). Коллективные перемещения микроорганизмов зависят не только от механизмов, обеспечивающих собственно движение, но и от межклеточных контактов, опосредуемых мажорными компонентами клеточной поверхности, продукции сурфактантов и ряда других факторов (Harshey, 2003).
Способность к колонизации корневой системы растений повышается благодаря способности микроорганизмов переходить от индивидуальной подвижности к коллективной миграции (Дебабов, 1999; Олескин с соавт., 2000; Verstraeten et al., 2008). Следствием этого является увеличение приспособляемости бактерий, в том числе азоспирилл к обитанию в гетерогенных экологических нишах.
При изучении механизмов становления ассоциативного симбиоза нельзя не учитывать наличие особого биологического явления – формирования бактериальных биопленок. Биопленки с дифференцированными клетками бактерий, с гетерогенными микронишами и водными каналами, представляющими примитивную циркуляторную систему, напоминают организацию многоклеточных организмов (Гостев и Сидоренко, 2010). Форма существования микроорганизмов в виде биопленок – это эволюционно выгодный способ надклеточной организации как патогенных, условно-патогенных, так и ассоциативных представителей прокариот.
Таким образом, альфапротеобактерии A. brasilense Sp245 являются удобным модельным объектом для экспериментального изучения феномена растительно-бактериальной ассоциативности и социального поведения бактерий. Использование в экспериментальных исследованиях не только штамма дикого типа, но и оригинальных мутантов определенных классов, по-видимому, может способствовать получению новой информации о генетических аспектах социального поведения этих бактерий.
Цель диссертационной работы заключалась в идентификации генетических локусов
A. brasilense, мутагенез которых сопровождается существенными изменениями в жгутиковании и социальном поведении бактерий.
Задачи диссертационного исследования:
1. Анализ изменений в первичной структуре 85-МДа плазмиды (p85), произошедших в результате ее слияния с вектором для омегонового мутагенеза pJFF350 у производного штамма A. brasilense Sp245 с ускоренным роением.
2. Генетико-физиологическая характеристика нескольких омегоновых мутантов
A. brasilense Sp245, имеющих дефекты в образовании полярного и латеральных жгутиков.
3. Мониторинг процесса формирования биопленок на абиотических поверхностях и корнях проростков пшеницы штаммом A. brasilense Sp245 и его мутантами по структуре гликополимеров клеточной поверхности и подвижности.
Научная новизна работы. Охарактеризованы изменения в первичной структуре плазмиды р85 у одного из дериватов штамма A. brasilense Sp245 с ускоренным роением; аннотированы несколько новых генов р85. На примере мутантов A. brasilense SK039 и
A. brasilense Sp245.1610 впервые показано, что вставка инсерционного элемента в одну из копий генов липидного обмена, кодирующих 3-гидроксиизобутиратдегидрогеназу (mmsB) или 3-оксоацил-[ацил-переносящий белок]-редуктазу (fabG), не сказываясь на жизнеспособности бактерий, вызывает появление дефектов в жгутиковании и подвижности. На примере мутанта A. brasilense Sp245.1063 впервые описано негативное влияние инактивации лишь одной из копий гена flhB, кодирующего компонент жгутикового экспортного аппарата, на сборку жгутиков двух видов – конститутивного полярного и индуцибельных латеральных. Выявлено влияние мутаций в генах flhB, mmsB или fabG на эффективность формирования биопленок
A. brasilense Sp245 на гидрофильной и гидрофобной абиотических поверхностях. У деривата
A. brasilense Sp245.5 с крупной плазмидной перестройкой и новым О-полисахаридом обнаружена способность к более активному, по сравнению с родительским штаммом, формированию биопленок на корнях растения-хозяина.
Научно-практическая значимость работы. Инсерционные мутанты A. brasilense Sp245, полученные в настоящей работе, могут быть использованы в новых работах по изучению механизмов регуляции социального поведения азоспирилл. Штаммы A. brasilense Sp245.1063 и A. brasilense Sp245.1610 депонированы в коллекции ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН под номерами IBPPM 521 и IBPPM 522, соответственно. Представленная в данной работе информация свидетельствует о необходимости более детального исследования вклада ферментов липидного метаболизма и мультисенсорной гибридной гистидинкиназы/регулятора ответа, кодируемой хромосомным локусом AZOBR_150176, в процессы, существенные для успешной сборки жгутиков и обеспечения подвижности A. brasilense Sp245 в средах разной плотности.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Определенные изменения первичной структуры 85-МДа плазмиды штамма Azospirillum brasilense Sp245 в результате интеграции чужеродной ДНК приводят к ускорению роения бактерий.
2. Инактивация только одной из копий гена flhB, кодирующего компонент жгутикового экспортного аппарата, у бактерий A. brasilense Sp245 может сопровождаться дефектами в образовании и конститутивного полярного жгутика, и индуцибельных латеральных жгутиков.
3. Вставка инсерционного элемента только в одну из копий генов ферментов липидного обмена 3-гидроксиизобутиратдегидрогеназы (mmsB) и 3-оксоацил-[ацил-переносящий белок]-редуктазы (fabG) может приводить к дефектам в подвижности и жгутиковании A. brasilense Sp245.
4. У дефектных по жгутиковой подвижности flhB, mmsB или fabG мутантов
A. brasilense Sp245 модифицирована способность к формированию биопленок на гидрофобных и гидрофильных абиотических поверхностях.
5. Спонтанное изменение химической структуры О-полисахарида A. brasilense Sp245 оказывает позитивное влияние на процесс формирования биопленок азоспирилл на корнях проростков пшеницы.
Диссертационная работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН в рамках трех плановых тем НИР: “Изучение вклада плазмид в определение подвижности и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у почвенных ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense” (№ госрегистрации 01200606181), “Изучение генетической регуляции социальной подвижности и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у бактерий, ассоциированных с растениями” (№ госрегистрации 01200904390) и “Генетический анализ социального поведения альфапротеобактерий Azospirillum brasilense” (№ госрегистрации 01201359055) (научный руководитель – д.б.н. профессор Е.И. Кацы). Исследования частично поддержаны грантами Российского фонда фундаментальных исследований 06-04-48204-а, 12-04-00262-а (руководитель – д.б.н. профессор Е.И. Кацы) и 13-04-01276-а (руководитель – к.б.н. Л.П. Петрова).
Личный вклад соискателя. Экспериментальные данные, на основе которых сформулированы положения и выводы, представленные к защите, получены лично автором. Соискатель принимал непосредственное участие в постановке задач исследования, подготовке и проведении экспериментальных работ, обработке и обсуждении полученных результатов, подготовке публикаций.
Отдельные эксперименты выполнялись при участии коллег из ИБФРМ РАН: д.б.н. проф. Е.И. Кацы, к.б.н. Л.П. Петровой, д.б.н. А.В. Шелудько, к.б.н. М.П. Чернышовой, к.б.н. Ю.А. Филипьечевой, Е.М. Телешевой, д.б.н. О.И. Соколова, к.б.н. М.К. Соколовой и к.х.н. А.М. Бурова. Секвенирование ДНК выполнено в лаборатории молекулярной генетики НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития РФ под руководством к.б.н. А.Г. Прилипова. Автор признателен всем коллегам за помощь в работе.
Апробация работы. Сделаны доклады на IV Межрегиональной конференции молодых ученых “Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой” (Саратов, 2008); V и VI Всероссийских конференциях молодых ученых “Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой” (Саратов, 2010, 2012); III, IV и VI Всероссийских с международным участием конгрессах студентов и аспирантов-биологов “Симбиоз–Россия 2010” (Нижний Новгород, 2010), “Симбиоз–Россия 2011” (Воронеж, 2011; присужден Диплом оргкомитета конгресса за лучший доклад (1-е место) в подсекции “Микробиология”) и “Симбиоз–Россия 2013” (Иркутск, 2013; присужден Диплом оргкомитета конгресса за лучший доклад (2-е место) в секции “Микробиология и биотехнология”; объявлена Благодарность оргкомитета конгресса за активное участие и большое количество заданных вопросов), VII Молодежной школе-конференции с международным участием “Актуальные аспекты современной микробиологии” (Москва, 2011) и научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии “Х чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова” (Москва–Пущино, 2011; присужден Диплом лауреата конкурса молодых ученых на лучшую научно-исследовательскую работу). Диссертационная работа обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН 23.01.2014, протокол № 199.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе, 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата и доктора наук.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 107 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 21 рисунок. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 262 источников, из них 57 на русском и 205 на английском и немецком языках.
Основные гликополимеры поверхности бактериальной клетки
На любом этапе взаимодействия растений с бактериями очень важную роль играет клеточная поверхность. В качестве потенциальных факторов симбиоза обычно рассматривают поверхностно–ассоциированные и внеклеточные полисахариды, которые включают капсульные полисахариды (КПС), липополисахариды (ЛПС) и внеклеточные экзополисахариды (ЭПС). Для изучения свойств полисахаридов бактериальной поверхности часто используют краситель калькофлуор белый, проявляющий специфичность к ряду полисахаридсодержащих биополимеров, в связи с чем фенотип микроорганизмов не способных к синтезу ЭПС и КПС относится к Cal-. ЛПС - основной компонент клеточной стенки грамотрицательных микроорганизмов, вносящий существенный вклад в развитие симбиотических взаимоотношений микросимбионтов с растением-хозяином (Kannenberg, Carlson, 2001), на долю которого приходится около 15% от массы внешней мембраны, и заполняет примерно 75% площади поверхности бактериальной клетки (Lerouge, Vanderleyden, 2001). Среди изученных грамотрицательных бактерий только Fibrobacter succinogenes S85 и представители рода Sphingomonas не синтезируют ЛПС (Alexander, Zahringer, 2002).
В молекуле ЛПС можно выделить следующие структурные области: липид А, олигосахарид кора и О-специфический полисахарид (ОПС) (рисунок 1). Липид А является гидрофобной составляющей ЛПС и обеспечивает прочную связь данного биополимера с наружной мембраной, в то время как кор и ОПС направлены в окружающую среду (Alexander, Rietschel, 2001).
Липид А связан с ОПС посредством олигосахарида кора, который подразделяется на внутреннюю и наружную области и вносит вклад в проявляемые молекулой ЛПС биологические свойства. Отличительной особенностью данного структурного домена является наличие в его составе 2-кето-3-дезоксиоктоновой кислоты – уникального для ЛПС соединения. Вступая во взаимодействие с отрицательно заряженными группировками внутреннего кора, катионы двухвалентных металлов образуют «мостики» между смежными молекулами ЛПС, что обеспечивает целостность и стабильность наружной мембраны грамотрицательных бактерий.
ОПС представляет собой наиболее вариабельную часть молекулы ЛПС. Данный компонент является полимером, состоящим из повторяющихся звеньев олигосахаридов. Структурными единицами повторяющегося звена чаще всего являются моносахариды и их производные, реже – компоненты неуглеводной природы. О-цепи, как и прочие полисахариды, могут быть линейными или разветвленными. ОПС большинства грамотрицательных бактерий состоит примерно из 50 олигосахаридных звеньев, представленных 2–7 моносахаридными остатками (Кабанов, Прохоренко, 2010). Различия качественного и количественного состава данной части молекулы ЛПС служат основой для серотипирования бактерий. Кроме того, ОПС играет существенную роль во взаимодействии бактерий с макроорганизмом (Домарадский, 1985; Attridge et al., 2001; Lerouge, Vanderleyden, 2001).
Есть предположение, что вещества, выделяемые корневой системой растений (например, антоцианы), могут влиять на изменение структуры бактериальных ЛПС (Книрель, Кочетков, 1993; Lerouge, Vanderleyden, 2001).
Ризобактерии штамма A. brasilense Sp245 продуцируют иммунохимически различные липополисахариды ЛПСI и ЛПСII (Katzy et al., 1998), у которых повторяющиеся звенья ОПС представлены идентичными пентасахаридами, построенными из остатков D-рамнозы (Fedonenko et al., 2002).
Показано, что ЛПС, выделенные из наружной мембраны бактерий рода Azospirillum, индуцируют деформацию корневых волосков у пшеницы, при этом показанная активность варьирует у разных штаммов (Jain, Partiquin, 1984; Yegorenkova et al., 2001). Кроме того, установлено, что ЛПС азоспирилл может влиять на синтез гидроксипролин-богатых белков апопласта корней пшеницы (Matora et al., 1995), что свидетельствует о важной роли бактериальных ЛПС в установлении не только патогенетических и симбиотических, но и ассоциативных взаимоотношений.
КПС, синтезируемый азоспириллами, связан с наружной мембраной, однако по мере роста культуры переходит в культуральную жидкость, в то время как ЭПС постоянно экспортируется в окружающую среду. Постепенное смешение в экстраклеточном пространстве мешает четкому разделению данных биополимеров на ЭПС и КПС. В составе внеклеточных полисахаридов обнаружены нейтральные бета-глюканы и кислые гетерополисахариды (Del Gallo, Haegi, 1990). Основными моносахаридами, входящими в состав ЭПС азоспирилл, являются галактоза, манноза, рамноза, глюкоза, фруктоза, галактуроновая кислота и глюкозамин. Соотношение данных структурных единиц варьирует у разных штаммов, а также определяется возрастом бактериальной культуры (Коннова с соавт., 1992).
К основным физиологическим функциям, которые выполняют поверхностные гликополимеры, можно отнести: создание вокруг клетки удерживающей влагу гидратированной оболочки, защита от воздействия окружающей среды, участие в формировании биопленок и адгезии к различным поверхностям. Показано, что на более поздних стадиях роста бактерии рода Azospirillum способны удовлетворять свои энергетические потребности за счет ЭПС, синтезируемых во время экспоненциальной фазы роста (Kefalogianni, Aggelis, 2002; Bahat-Samet et al., 2004).
Поверхностные полисахариды азоспирилл связывают растительные лектины. Эти взаимодействия вовлечены во флоккуляцию клеток и, следовательно, определяют межклеточные взаимодействия бактерий (Никитина с соавт., 2005).
На клеточной поверхности азоспирилл также экспонированы белки гемагглютинины. Синтезируемые бактериями рода Azospirillum гемагглютинины являются лектинами с разной специфичностью и обладают способностью выделяться в окружающую среду (Никитина с соавт., 2005).
Растения, использованные в работе, и условия их выращивания
У суперроящегося производного (BK570) штамма A. brasilense Sp245 интеграция р85 с вектором для омегонового мутагенеза pJFF350 опосредована элементом ISAzba3 плазмиды p85. В результате анализа ДНК p85, прилегающей к месту слияния с pJFF350 у мутанта BK570 (см. рисунок 6), кроме описанных ранее ISAzba3, гена фаговой интегразы int и orf246, кодирующей консервативный гипотетический белок (Katsy, Prilipov, 2009), выявлены четыре orf со свойствами кодирующих последовательностей. Две из них, неполная orf135x и orf1145, кодируют консервативные гипотетические белки.
Еще две, orf319, прилегающая к месту слияния p85 с pJFF350, и соседняя с ней orf119x, на наш взгляд, представляют наибольший интерес для последующего экспериментального изучения.
По результатам PsortB анализа (http://www.psort.org/psortb) предсказанный продукт трансляции orf319 локализован за пределами цитоплазмы – в цитоплазматической мембране и/или периплазме. Этот белок относится к семейству 3 -фосфоаденозин-5 -фосфосульфат сульфотрансфераз (3 -phosphoadenosine-5 phosphosulfate, или PAPS, sulfotransferase, Pfam00685).
Сульфотрансферазы катализируют реакцию переноса сульфатной группы от универсального донора – 3 -фосфоаденозин-5 -фосфосульфата – к акцепторным группам многочисленных субстратов. Реакции сульфатирования (сульфонирования) играют важную роль в осуществлении межклеточной коммуникации, в процессах роста и развития живых организмов (Negishi et al., 2001).
Предсказанный продукт трансляции orf119х, по-видимому, также локализующийся вне цитоплазмы, относится к семейству белков толерантности к толуолу Ttg2 (Toluene tolerance, Ttg2, pfam05494). В данном контексте интересны косвенные данные других авторов о возможном влиянии флагеллярных генов Pseudomonas putida на устойчивость бактерий к органическим растворителям. Так, у мутантов псевдомонад по структурным белкам жгутиков и по белкам-экспортерам компонентов жгутика из клетки снижалась и устойчивость к толуолу (Kieboom et al., 2001; Segura et al., 2001). Не исключено, что возможна и обратная ситуация, когда компоненты клеточных мембран, обусловливающие толерантность бактерий к растворителям, оказывают влияние на функционирование жгутиков, поскольку их базальное тело и компоненты мотора также имеют мембранную локализацию.
Крупная структурная перестройка p85 у мутанта A. brasilense BK570 (p85::pJFF350) могла отразиться на экспрессии orf319 и orf119x и, как следствие, на структуре и/или функционировании компонентов клеточных мембран и подвижности этих бактерий. Известно, что на активность транскрипции генов может влиять укладка ДНК, особенно степень ее суперспирализации. Эта укладка модулирует, а иногда и определяет силу промоторов (Perez-Martin et al., 1994). Возможно, мы имеем дело с таким случаем, а интеграция в p85 вектора pJFF350 (ДНК которого, в отличие от p85, обогащена AT-парами) является препятствием для осуществления на должном уровне регуляции экспрессии ряда генов p85.
3.2 Генетико-физиологическая характеристика омегонового мутанта A. brasilense SK039, имеющего дефекты в образовании полярного жгутика и роении
В культурах полученного ранее омегонового leaky Fla мутанта (SK039) штамма A. brasilense Sp245 (Scheludko et al., 1998) до 21% клеток несут длинный Fla (но он парализован), 1.6% клеток – укороченную полярную органеллу, а остальные клетки полностью лишены полярного жгутика. Пример жгутикования клеток двух штаммов A. brasilense приведен на рисунке 7. Практически все клетки SK039 неподвижны в жидких средах (Mot фенотип) и, несмотря на способность к образованию Laf, не роятся (Swa фенотип), но могут мигрировать с образованием микроколоний (рисунок 8). Примечание: Стрелка указывает на полярный жгутик клеток штамма Sp245 дикого типа. Масштабная линейка соответствует 1 мкм.
Рисунок 7 – Электронные микрофотографии клеток штаммов A. brasilense Sp245 (1) и SK039 (2) из культур на жидкой (а) и плотной (б) среде
Примечание: Среда MSM содержит 0.4% Bacto агара. Время инкубации после точечной инокуляции культур – 72 ч.
Рисунок 8 – Роение (1) и распространение с образованием микроколоний (2) бактерий штаммов A. brasilense Sp245 (1) и SK039 (2) в полужидкой среде
Фрагмент хромосомной ДНК, в который произошло встраивание Omegon-Km, был ранее проклонирован в виде рекомбинантной плазмиды pOmegon-Km-SK039E (Кацы с соавт., 2004).
В настоящей работе нами осуществлена характеристика изменений в первичной структуре ДНК у A. brasilense SK039 и выполнен сравнительный анализ ряда культурально-биохимических свойств этого мутанта и родительского штамма A. brasilense Sp245. Этот подраздел работы выполнялся совместно с д.б.н. проф. Е.И. Кацы, д.б.н. А.В. Шелудько (ЛГМ ИБФРМ РАН) и к.б.н. М.П. Чернышовой (лаборатория экологической биотехнологии ИБФРМ РАН).
Анализ первичной структуры ДНК, прилегающей к вставке омегона у мутанта A. brasilense SK039, имеющего дефекты в образовании полярного жгутика и роении. Идентификация кодирующих последовательностей и характеристика предсказанных продуктов их трансляции Секвенирование ДНК SK039, прилегающей к вставке, и соседних районов показало, что инсерция омегона локализуется в orf (orf293, или mmsB), кодирующей предсказанный гомолог 3-гидроксиизобутиратдегидрогеназы и других дегидрогеназ 3-гидроксикислот (ферменты липидного обмена) (рисунок 9).
Примечание: открытые рамки считывания (orf) и направление их транскрипции обозначены стрелками. Цифры в названиях orf соответствуют количеству аминокислотных остатков в предсказанных продуктах трансляции (orf156x начинается за границей клонированной и секвенированной ДНК). Возможные функции белковых продуктов orf приведены на схеме. Место инсерции омегона () в orf293 (mmsB) у мутанта A. brasilense SK039 обозначено перевернутым треугольником.
Схема сегмента хромосомной ДНК бактерий штамма A. brasilense Sp245, омегоновый мутагенез которого привел к появлению leaky Fla Mot Swa мутанта A. brasilense SK039 На рисунке 10 показаны основные консервативные домены, выявленные в аминокислотной последовательности продукта orf293 из A. brasilense Sp245: “NAD(P)H/NAD(P)+-связывающие белки с Rossmann-складкой” (E-value = 1.6e–98) и “MmsB, 3-гидроксиизобутиратдегидрогеназа и родственные дегидрогеназы -гидроксикислот” [COG2084; Метаболизм липидов] (E-value = 1.5–48). Примечание: стрелкой показано место вставки омегона в orf293 (mmsB) у мутанта A. brasilense SK039.
Консервативные домены, выявленные в предсказанном продукте трансляции orf293 из хромосомы бактерий A. brasilense Sp245 3-гидроксиизобутиратдегидрогеназа катализирует NAD+-зависимое окисление 3-гидроксиизобутирата в метилмалонатный семиальдегид, а также обратную реакцию. Соответственно, на N-конце предсказанного продукта orf293 выявлены консервативные остатки глицина и аспартата, участвующие в связывании NAD+. Фермент обладает широкой субстратной специфичностью и может катализировать не только окисление 3-гидроксиизобутирата, но и других производных 3-гидроксикислот, L-серина, D-треонина (Chowdhury et al., 1996).
Обычно белки с Rossmann-складкой содержат второй домен, ответственный за связывание субстрата и катализирующий конкретную ферментативную реакцию; в ORF293 это – домен MmsB.
Предполагаемый белковый продукт orf293 (GenBank accession no. ADT80774) из штамма A. brasilense Sp245 обладает наиболее высоким сходством с такими белками из баз данных, как возможная 3-гидроксиизобутиратдегидрогеназа из клубеньковых бактерий Rhizobium sp. NT-26 (accession no. CCF19418) (68% идентичности/80% сходства; E-value = 2e–134) и 3-гидроксиизобутиратдегидрогеназа из Agrobacterium albertimagni AOL15 (accession no. EKF59600) (68% идентичности/79% сходства; E-value = 4e–134).
С использованием алгоритма BLASTn было установлено, что в рекомбинантной плазмиде pOmegon-Km-SK039E (GenBank accession nos GQ168586–GQ168588, HM776586 и HM776587) клонирован EcoRI-фрагмент хромосомы Sp245 с координатами 2561173–2568444 (GenBank accession no. HE577327). Однако в “американском” сиквенсе (GenBank accession no. HE577327) в позиции 2565187, 2565236 и 2567540 есть вставка “лишнего” G, C и С, соответственно. В связи с этим обстоятельством зарубежные коллеги описали псевдогены AZOBR_180076 и AZOBR_180076 вместо выявленной нами мембранной гибридной сенсорной гистидинкиназы/регулятора ответа (GenBank accession nos GQ168588) и только фрагмент гена mmsB/orf293 (в их обозначении – AZOBR_180080) (GenBank accession no. HM776586).
В pOmegon-Km-SK039E омегон встроился за 479-м нуклеотидным остатком orf293/mmsB с дупликацией 9 п.н. (TAGCAGGCС). Таким образом, вставка омегона (имеющего длину 3.8 т.п.н) локализуется примерно в середине orf293 (mmsB), и расчетная длина мутантного полипептида составляет 159 аминокислотных остатков вместо 293. Так как направление транскрипции orf293 и ближайших к ней orf не совпадает, возможный полярный эффект инсерции омегона на экспрессию генов предсказанной FAD/FMN-дегидрогеназы (orf156x) и консервативного гипотетического белка (orf076) нами не рассматривался. Предшественниками ряда ЖК (в том числе, гидроксиизобутирата) являются разветвленные аминокислоты (АК) валин (Val), изолейцин (Ile) и лейцин (Leu). Деградация этих аминокислот и ЖК используется многими протеобактериями для выработки энергии. Лейцин (и другие аминокислоты) также является важным предшественником разветвленных ЖК, входящих в состав клеточных мембран. Так, при росте Shewanella gelidimarina на лейцине в качестве единственного источника углерода наблюдалось двукратное увеличение содержания фракции разветвленных ЖК в мембране по сравнению с ростом на серине или аланине (Nichols et al., 1997). В работах на других бактериях, в частности, псевдомонадах, было показано, что синтез 3-гидроксиизобутиратдегидрогеназы индуцируется в присутствии валина и подавляется в анаэробных условиях.
Секвенирование ДНК. Биоинформационный анализ нуклеотидных и предсказанных аминокислотных последовательностей
w макроколонии меньшего (5 мм), чем в случае дикого типа ( 20 мм), диаметра составило 5.6%.
В результате нами были отобраны клоны A. brasilense Sp245.1610, у которого среди неподвижных и дрожащих клеток в жидкой среде встречались медленно двигающиеся особи, и A. brasilense Sp245.1063, клетки которого были полностью неподвижны. Колонии, сформированные клетками мутанта Sp245.1610, инокулированного уколом в среды, содержащие 0.4% Bacto агара, в отличие от роящихся бактерий штамма Sp245, остаются на месте укола. Штамм Sp245.1063 образует зернистые зоны распространения, так же, как и полученный ранее мутант SK039 (рисунок 13, таблица 3). Примечание: время инкубации 72 ч. Масштабная линейка 10 мм. и его мутантов через 18 ч становятся шероховатыми и имеют бледно-розовый цвет. Сравнительный электронно-микроскопический анализ клеток штаммов
A. brasilense Sp245 и Sp245.1063 выявил у мутанта полную утрату способности к образованию латеральных жгутиков и существенные дефекты в продукции полярного (рисунок 14). До 90% клеток мутанта Sp245.1063 из культур, выращенных в жидких (18 ч) или на плотных (42 ч) средах, лишены Fla; около 10% клеток несут очень короткую полярную органеллу. В случае штамма Sp245 дикого типа 90% клеток в популяции снабжены Fla, а бактерии без жгутика 5% или с коротким жгутиком составляют примерно по 5% от общего количества клеток. На плотных средах у штамма Sp245, но не у его мутанта, индуцируется образование многочисленных Laf (рисунок 14). Существенных различий в среднем размере клеток двух штаммов A. brasilense из культур, выращенных в одинаковых условиях, не выявлено.
Примечание: бактерии выращивали в жидкой (1, 3) или на плотной (2, 4) MSM. Масштабная линейка соответствует 1 мкм.
Рисунок 14 – Электронные микрофотографии клеток штамма A. brasilense Sp245 (1, 2) и его омегонового мутанта A. brasilense Sp245.1063 (3, 4) Результаты электронной микроскопии продемонстрировали полную утрату способности мутанта A. brasilense Sp245.1610 к образованию латеральных жгутиков и существенные дефекты в продукции полярного. Примерно 62% клеток мутанта Sp245.1610 из культур, выращенных в жидких (18 ч) или на плотных (42 ч) средах, лишены Fla; около 29% клеток несут очень короткую полярную органеллу; на остальных клетках в популяции выявляется длинный Fla. При этом около 2.5% клеток в популяции Sp245.1610 сохранили подвижность в жидких средах.
Необходимо отметить, что изучение большого количества сконструированных ранее мутантов A. brasilense, отнесенных к классу Fla или Laf, показало, что в их культурах всегда встречается незначительное количество клеток, несущих полярный или несколько латеральных жгутиков. Создается впечатление, что одиночные вставки инсерционных элементов в ДНК азоспирилл не обеспечивает получение штаммов, у которых 100% клеток были бы лишены подвижности или жгутиков. Появление в популяциях мутантов определенного процента клеток с филаментами в ряде случаев может быть следствием существования у азоспирилл множественных копий флагеллярных генов, которые эспрессируются независимо друг от друга (Кацы, 2002а).
Существенных различий в среднем размере клеток двух штаммов A. brasilense из культур, выращенных в одинаковых условиях, не выявлено. Каких-либо различий в скорости роста штаммов A. brasilense Sp245, Sp245.1063 и Sp245.1610 не обнаружено.
Ранее было показано, что изменения в плазмидном составе могут влиять на продукцию и функционирование жгутиков (Кацы c соавт., 2001). Поэтому мы проверили плазмидный состав полученных эксконьюгантов A. brasilense Sp245.1610 и Sp245.1063 методом Eckhardt (1978). Плазмидный состав проверенных клонов не отличался от штамма дикого типа.
В результате проделанной работы идентифицирован полностью неподвижный Fla Laf мутант A. brasilense Sp245.1063 и leaky Fla/Mot Laf мутант A. brasilense Sp245.1610, большинство клеток в популяции которого неподвижны, а клетки, сохранившие подвижность, единичны. 3.3.2 Анализ первичной структуры ДНК, прилегающей к вставке омегона у
Следующим этапом нашей работы стал анализ первичной структуры ДНК, мутагенез которой сопровождался изменениями в характере жгутикования и подвижности бактерий.
Наличие сведений о первичной структуре геномов нескольких штаммов азоспирилл, в том числе, A. brasilense Sp245 (GenBank accession nos HE577327– HE577333), является хорошим подспорьем для работ по экспериментальному анализу генетической регуляции синтеза и работы двух флагеллярных систем. В почти полной нуклеотидной последовательности генома бактерий A.brasilense Sp245 предсказанные гены жгутикования (нередко присутствующие в геноме в двух или более копиях) обнаружены в хромосоме и нескольких плазмидах (AZOBR_p1, AZOBR_p3 и AZOBR_p4) (Wisniewski-Dy et al., 2011). Закономерен вопрос о том, каков относительный вклад хромосомных и плазмидных генов в образование и определение работы жгутиков, в чем биологический смысл разбросанности таких генов по разным репликонам?
Для характеристики мутантного локуса было осуществлено клонирование EcoRI фрагмента геномной ДНК штамма A. brasilense Sp245.1063, несущего вставку омегона-Km – с отбором трансформантов E. coli DH1, приобретших устойчивость к канамицину. В результате секвенирования полученной таким образом рекомбинантной плазмиды pOmegon-Km-Sp245.1063E установлено, что в ее составе клонирован 16.4-т.п.н. EcoRI-фрагмент хромосомы A. brasilense Sp245 с координатами 2337237–2353586, включающий локусы AZOBR_150175– AZOBR_150194 (GenBank accession no. HE577327). У мутанта A. brasilense Sp245.1063 вставка омегона-Km локализована в районе 924-го нуклеотидного остатка хромосомной копии гена flhB, кодирующего компонент жгутикового экспортного аппарата. По концам омегона в ДНК штамма A. brasilense Sp245.1063 выявлен прямой повтор последовательности из 9 п.н. (5 -CTCCTCGGC-3 ).
Расположенные перед flhB гены fliE-fliQ2-fliR кодируют соответственно белок крюка–базального тела FliE и участвующие в синтезе жгутика белки FliQ и FliR (GenBank accession nos YP_005032138, YP_005032137 и YP_005032136) (рисунок 15).
Примечание: горизонтальными стрелками обозначены кодирующие последовательности и направление их транскрипции; вертикальной стрелкой – место вставки омегона () в ген flhB.
Схема сегмента хромосомной ДНК мутанта A. brasilense Sp245.1063, содержащего вставку инсерционного элемента Omegon-Km
На расстоянии 51 п.н. от 3-конца гена flhB находится транскрибируемая в том же направлении orf AZOBR_150176, предполагаемым продуктом которой является гибридная мультисенсорная гистидинкиназа/регулятор ответа (GenBank accession no. YP_005032134). Не исключено, что вставка омегона-Km недалеко от 3 -конца гена flhB оказала влияние на экспрессию близлежащей AZOBR_150176. Перспективным представляется анализ возможного участия белкового продукта orf AZOBR_150176 в восприятии сигнала о попадании бактерий на плотные/вязкие среды и в передаче этого сигнала к генетическому аппарату синтеза латеральных жгутиков. Orf AZOBR_150175, кодирующая гипотетический белок (GenBank accession no. YP_005032133), транскрибируется в противоположном направлении.
Генетико-физиологическая характеристика омегонового мутанта A.brasilense SK039, имеющего дефекты в образовании полярного жгутика и роении
Вставка омегона локализуется примерно в середине orf293 и расчетная длина мутантного полипептида составляет 159 аминокислотных остатков вместо 293. Так как направление транскрипции orf293 и ближайших к ней orf не совпадает, возможный полярный эффект инсерции омегона на экспрессию генов предсказанной ФАД/ФМН-дегидрогеназы (orf156x) и консервативного гипотетического белка (orf076) нами не рассматривался.
В ходе исследований нами обнаружены новые гены, продукты экспрессии которых, по–видимому, могут опосредовать поведенческие реакции бактерий и приводить к дефектам в подвижности и жгутиковании бактерий. Так, на примере мутанта A. brasilense SK039 впервые показано, что к обездвиживанию бактерий и к дефектам в образовании полярного жгутика может приводить мутагенез гена (mmsB), кодирующего такой фермент липидного метаболизма, как 3-гидроксиизобутиратдегидрогеназа. В настоящей работе нами впервые показано, что инсерция омегона у мутанта A. brasilense Sp245.1610 в расположенный в плазмиде AZOBR_p1 ген 3-оксоацил-[ацил-переносящий-белок (АПБ)]-редуктазы (fabG) сопровождается полной утратой латеральных жгутиков и способности к роению, а также существенными дефектами в сборке полярного жгутика (но некоторые клетки штамма еще подвижны в жидких средах). В результате секвенирования полученной рекомбинантной плазмиды pOmegon-Km-Sp245.1610E установлено, что она содержит 19.5-т.п.н. EcoRI-фрагмент плазмиды AZOBR_p1 A. brasilense Sp245 с координатами 1617965–1637479, включающий локусы AZOBR_p1160039– AZOBR_p1160053 (GenBank accession no. HE577328). У мутанта Sp245.1610 вставка омегона-Km выявлена за 462-м нуклеотидным остатком плазмидной копии гена fabG (локус AZOBR_p1160043).
Ген fabG кодирует компонент мультиферментного комплекса ЖК синтаз II типа – 3-оксоацил-[ацил-переносящий-белок (АПБ)]-редуктазу (GenBank accession no. CCD01190). Данный фермент катализирует NADPH-зависимое восстановление 3-оксоацил-[АПБ] до 3-гидроксиацил-[АПБ] на первом восстановительном этапе циклического синтеза ЖК (EC no. 1.1.1.100).
В доступной литературе отсутствовали какие-либо сведения о влиянии мутаций в генах mmsB и fabG на подвижность и жгутикование бактерий. Наиболее близким к описанным здесь результатам является сообщение о почти полной утрате одним из штаммов Rhizobium leguminosarum bv. vicae способности к продукции жгутиков после того, как его липид А перестал модифицироваться длинноцепочечной жирной кислотой из-за мутаций в двух копиях гена fabH (Vanderlinde et al., 2009).
Представленная в данной работе информация, на наш взгляд, свидетельствует о перспективности работ по более детальному исследованию вклада ферментов липидного метаболизма в процессы, существенные для успешной сборки жгутиков и обеспечения бактериальной подвижности.
Кроме того, впервые на примере A. brasilense Sp245 показано, что у бактерий со смешанным жгутикованием инсерционный мутагенез одной из копий хромосомного гена flhB1, который кодирует компонент жгутикового экспортного аппарата, сопровождается дефектами в образовании конститутивного полярного и индуцибельных латеральных флагелл. Несмотря на то, что в составе плазмидного кластера генов имеется вторая копия гена flhB, необходимого, по-видимому, для образования латеральных жгутиков, flhB1::Omegon-Km мутант полностью утратил способность к их продукции. Поскольку к 3 -концу гена flhB прилегает транскрибируемая в том же направлении открытая рамка считывания AZOBR_150176, предполагаемым продуктом которой является гибридная мультисенсорная гистидинкиназа/регулятор ответа (GenBank accession no. YP_005032134), не исключено участие этого белка в индукции синтеза латеральных жгутиков в ответ на повышение плотности окружающей среды. Описанный эффект вставки омегона-Km в ген flhB1 может объясняться использованием FlhB1 для сборки жгутиков двух типов. Перспективным представляется анализ возможного участия белкового продукта orf AZOBR_150176 в восприятии сигнала о попадании бактерий на плотные/вязкие среды и в передаче этого сигнала к генетическому аппарату синтеза латеральных жгутиков. Кроме коллективной подвижности, для бактерий характерен такой вид социального поведения, как формирование биопленок. В данной работе получены новые данные о том, что дефекты в синтезе и функционировании полярного и латеральных жгутиков азоспирилл сопровождаются изменениями в эффективности формирования их биопленок на абиотических поверхностях. Было установлено, что на гидрофобной поверхности толщина пленок, формируемых нероящимися мутантами Fla Laf Sp245.1063, leaky Fla/Mot Laf Sp245.1610 и leaky Fla–/Mot– SK039 значительно ниже по сравнению с таковой у родительского штамма. Мутанты Sp245.1063 и SK039 формируют менее выраженные биопленки и на гидрофильной поверхности. Однако у fabG мутанта A. brasilense Sp245.1610 выявлена активизация процесса образования биопленок на поверхности стекла, что можно объяснить изменением в ЖК составе клеточных мембран этого штамма. Мы предполагаем, что основной вклад в процесс образования биопленок у исследованных мутантов с нарушением продукции и функционирования жгутиков вносит их способность к микроколониальному распространению. Высказанные предположения требуют дальнейшей экспериментальной проверки.
Так как основу биопленок составляют полисахариды, все, что влияет на их продукцию, может оказать влияние на способность бактериями образовывать биопленки. В ходе наших исследований показано, что синтез бактериями полноценных ЛПС и ПССК во многом определяет численность клеток штамма Sp245, колонизирующих корни растений и формирующих биопленки, степень выраженности биопленок и их расположение на корневой поверхности. Как оказалось, спонтанные (как у деривата Sp245.5 с крупной плазмидной перестройкой) или индуцированные (как у мутантов KM018, KM139, KM252, содержащих вставку омегона в 120-МДа плазмиде) изменения состава и (или) структуры плазмид A. brasilense Sp245 оказывают заметное влияние на социальную активность этих бактерий, проявляющуюся, в частности, в формировании биопленок. Так, утрата одного из ЛПС с пента-D-рамнановым ОПС приводит к уменьшению количества клеток, заселивших корни пшеницы (мутанты серии KM). Хуже всего адсорбировался мутант, который утратил и подвижность (KM018).
