Введение к работе
з
Актуальность работы. Одной из наиболее характерных черт современной микробиологии можно признать переход от традиционного представления о бактериях как строго одноклеточных организмах без выраженного социального поведения к представлению о микробных сообществах как целостных структурах, регулирующих свои поведенческие реакции в зависимости от изменения условий обитания (Грузина, 2003). Понятие «социальное поведение» активно используется современными исследователями при описании процессов и явлений, обеспечивающих выживание бактерий в неблагоприятных условиях (Олескин с соавт., 2000).
Работы по изучению различных форм кооперативного поведения микробов, а также инициирующих его внешних условий и поверхностных бактериальных структур, обеспечивающих реализацию той или иной формы поведения, представляются перспективными для понимания оперативного «искусства» выживания бактериальных видов в природных экосистемах.
Бактерии рода Azospirillum оказывают рост-стимулирующее влияние на растения (Okon and Vanderleyden, 1997) и широко используются исследователями как модельный объект при изучении эффектов микробно-растительной ассоциативности (Steenhoudt and Vanderleyden, 2000). Исследования последних нескольких лет показали, что для азоспирилл характерны несколько типов «социальной» активности, такие как образование бактериальных биопленок на границе раздела фаз, коллективное распространение в вязких средах с формированием концентрических колец роения и коллективная миграция в полужидких средах с образованием микроколоний (Кацы, 2007).
Формирование специфически организованных биопленок является очень распространенной формой существования бактерий в природных условиях, и наиболее активно этот феномен исследуется на примере патогенных бактерий (Хмель и Метлицкая, 2006; Kievit and Iglewski, 2000). Особенности процесса формирования биопленок почвенными бактериями, в том числе, бактериями рода Azospirillum, практически не исследованы. Вместе с тем, можно предположить, что именно этот способ социальной активности позволяет обитателям почвы не только выживать в неблагоприятных экологических условиях, но и, в случае ассоциативных взаимоотношений с растениями, обеспечивает эффективное взаимодействие с корневой поверхностью.
Известно, что при колонизации корней растений азоспириллы могут формировать микроколонии (Burdman et al., 2000). Очевидный интерес представляет исследование зависимости этого явления от способности изучаемых бактерий образовывать микроколонии (Gri+ фенотип) при коллективной миграции в полужидких средах (Шелудько и Кацы, 2001), а также выявление поверхностных структур, обеспечивающих реализацию такого типа «социального» поведения.
Приспособление азоспирилл к различным условиям среды путем альтернативного запуска механизмов коллективного распространения в полужидких средах (роения или коллективной миграции с образованием микроколоний) может значительно повышать адаптивный ресурс данных бактерий (Schelud'ko et al., 2007). Поэтому заслуживает внимания поиск компонентов бактериальной поверхности, участвующих в определении способа коллективного поведения азоспирилл в средах, служащих прообразом пространства, окружающего корень растения.
В целом, выявление поверхностных полимеров, необходимых для реализации того или иного типа социальной подвижности ассоциативных бактерий, в первую очередь, в прикорневой зоне растений, представляется весьма актуальной проблемой, решение которой может способствовать развитию современных агробактериальных технологий. При этом развитие иммунохимических подходов, позволяющих оценивать роль компонентов бактериальной поверхности в осуществлении различных процессов с участием бактерий, является самостоятельным и актуальным методологическим аспектом исследования.
Целью настоящей работы являлось выявление поверхностных структур Azospirillum brasilense, участвующих в реализации различных типов «социальной» активности данных бактерий.
Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие задачи:
Исследовать природу межклеточного био полимерно го вещества, образуемого A. brasilense при формировании бактериальных биопленок на абиотических поверхностях и корнях пшеницы.
Отработать методики на основе иммуноферментного анализа для оценки эффективности колонизации азоспириллами корней пшеницы и эффективности формирования биопленок на абиотических поверхностях.
Исследовать иммуно химическую специфичность поверхностных иммуногенных белков A. brasilense и оценить возможность выявления антигенов, характеризующих бактерии с определенным типом социальной активности.
Изучить вклад полисахаридных и белковых антигенов в процесс коллективного распространения азоспирилл в полужидких средах и колонизации корней растений.
Оценить изменения поверхностных структур A. brasilense при контакте с соединениями, способствующими смене у бактерий способа социальной подвижности.
Научная новизна работы определяется ее следующими основными результатами:
Впервые выявлен белковый антигенный маркер, характеризующий бактерии A. brasilense, коллективно мигрирующие с образованием микроколоний.
Впервые показано, что реализация описанного ранее механизма распространения азоспирилл с образованием микроколоний (Шелудько и Кацы, 2001) может обеспечивать в ризосфере заселение этими бактериями растущих корневых волосков.
Впервые иммунохимическими методами продемонстрировано взаимодействие витального красителя конго красного (приводящего к стабильному проявлению у бактерий Gri+ фенотипа) с детерминантами липополисахаридов (ЛПС) азоспирилл.
Практическая значимость работы в значительной степени определяется развитыми в ходе ее выполнения методическими приемами, позволяющими оценивать эффективность колонизации азоспириллами корней пшеницы и эффективность формирования биопленок на абиотических поверхностях, а также уровень экспрессии тех или иных поверхностных структур, необходимых для реализации определенного типа социальной подвижности. Разработанный тест, основанный на точечной инокуляции бактерий в полужидкие агаризованные среды, содержащие антитела на ЛПС, может быть рекомендован для скрининга штаммов, демонстрирующих антигенные перекресты с модельными штаммами Azospirillum brasilense, и/или для отбора мутантов по структуре ЛПС.
Материалы диссертации использованы при написании учебно-методического пособия «Методы изучения бактериальной подвижности в приложении к биохимическим, генетическим и иммунохимическим задачам» (Саратов: Изд-во Научная книга, 2007 г.).
Основные положения, выносимые на защиту:
Липополисахариды участвуют в структурной организации биопленок А. brasilense на границе раздела фаз «жидкость - твердая гидрофильная/гидрофобная поверхность». Прикрепление азоспирилл к абиотическим поверхностям сопровождается усилением синтеза поверхностных полисахаридных антигенов, изолирующих бактерии от окружающей среды.
В составе наружной мембраны штаммов A. brasilense Sp7 и Sp245 дикого типа выявляется видо/родоспецифичный белковый антиген, идентичный таковому Gri+-MyTaHTOB A. brasilense Sp245, распространяющихся с образованием микроколоний.
Усиление синтеза предсуществующих белковых поверхностных структур, вовлеченных в процесс микроколониального распространения азоспирилл, происходит в результате взаимодействия с корнями пшеницы.
Тест, основанный на точечной инокуляции бактерий в полужидкие агаризованные среды, содержащие антитела на ЛПС, может применяться для скрининга штаммов, демонстрирующих антигенные перекресты с модельными штаммами A. brasilense, и/или для отбора мутантов по структуре ЛПС.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены в виде устных и стендовых сообщений на 9-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005); 2-м Агробиотехнологическом симпозиуме стран Балтии (Гамбург, Германия, 2006); Международной научной конференции «Микробные биотехнологии» (Одесса, Украина, 2006); 3-ей Региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2006); Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2006); Международной конференции «Ризосфера - 2» (Монпелье, Франция, 2007); Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007) и Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007).
Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН 1 февраля 2008 года.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованных источников, содержащего 160 источников, и двух приложений. Работа изложена на 114 страницах машинописного текста, включает 23 рисунка и 2 таблицы.
Работа выполнена в лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН в соответствии с плановыми темами НИР «Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений» (№ гос. регистрации 01890017743, научный руководитель зав. лаб. д.х.н., профессор Щеголев СЮ.) и «Комплексный иммунохимический анализ антигенных структур, определяющих ассоциативные взаимодействия микроорганизмов с растениями» (№ гос. регистрации 01200606177, научный руководитель зав. лаб. д.х.н., профессор Щеголев С.Ю.), а также в соответствии с планом НИР по проекту «Выяснение молекулярно-генетических механизмов взаимодействий микроорганизмов с растениями как основы для развития эффективных современных генно-инженерных, экологических, аграрных и иных биотехнологий» в рамках государственного контракта с Роснаукой № 02.445.11.7130 (ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы») (руководитель научной школы д.б.н., профессор Игнатов В.В.). Работа поддержана грантами Президента РФ №№ НШ-1529.2003.4 и НШ-6177.2006.4 на поддержку молодых российских ученых и ведущих научных школ.
