Введение к работе
ЛТУЪVoL
Актуальность проблемы. Развитие современных методов исследования в микробиологии, генетике, молекулярной биологии значительно продвинуло наше понимание механизмов взаимодействия геомериды - совокупности всех организмов, населяющих планету (Реймерс, 1991). Между тем нельзя не признать некоторую однобокость современных исследований в том, что касается объектов изучения: их подавляющее количество составляют организмы, напрямую связанные с жизнью человека: патогены и используемые в практических целях микроорганизмы.
В современном мире сформулирована задача изучения и сохранения биоразнообразия как неотъемлемой части поступательного и стабильного развития человечества. Почва является не только основой для обеспечения населения Земли продуктами питания, но и средой динамического взаимодействия между организмами разных таксонов и, в первую очередь, между растениями и микроорганизмами - основными компонентами биоразнообразия почв. Взаимодействия растений с микроорганизмами принято классифицировать на паразитизм, симбиоз, мутуализм или ассоциативное взаимодействие, синойкию (наименее тесное сожительство, безразличное для обоих сожителей). Если два первых варианта подробно изучаются как экономически важные для человеческой деятельности формы взаимодействия, то два последних привлекают меньше внимания. Между тем именно здесь находится часть, определяющая устойчивость почвы как системы, а, следовательно, и ее бонитет (качественная характеристика свойств почвы как суммарный показатель плодородия).
Бактерии рода Azospiriiium занимают уникальное положение: типичные представители почвенных микроорганизмов, они способны вступать в ассоциативное взаимодействие с разнообразными растениями (Bashan, Holguin, 1997). Необходимость жизни как в скудных по источникам питания условиях почвы, так и в специфичных условиях ассоциации, привела к наличию у этих бактерий широкого спектра адаптационных способностей и, как следствие, к формированию генома большого объема (Martin-Dido net et al., 2000). Необычна система хемотаксиса азоспирилл - энергетический таксис как основа существования в экстремальных и варьирующих почвенных условиях при наличии сложного метаболизма (Alexandre et al., 2000). Необычно разнообразие двигательных органелл (полярный жгутик, многочисленные латеральные жгутики, полярный пучок пилей) и, соответственно, типов подвижности (Шелудько, Кацы, 2001). Наличие необычных фазовых переходов в популяции азоспирилл свидетельствует о существовании тонких механизмов адаптации к конкретным экологическим нишам (Alexandre, Bally, 1999; Шелудько, Кацы, 2001). Все перечисленное выше, наряду с факторами, важными для взаимодействия с растениями, делает бактерии рода Azospiriiium крайне интересным объектом для изучения молекулярных основ адаптационного потенциала почвенных микроорганизмов.
Цель и задачи исследования. Пі ими шин їі |іміТіііім JMQIiii щ н ггпґг анализ вариаций в коллективной подвижнмМїс^Л9^Й5о&ньіхі структурах
^Ш
(двигательные органеллы, полисахариды) у стимулирующих рост и развитие растений бактерий вида Azospirillum brasilense. В связи с данной целью были поставлены следующие задачи:
Подобрать лабораторные условия, способствующие стабильному проявлению модельным штаммом A. brasilense Sp245 способности к нескольким видам коллективной подвижности.
Идентифицировать мутанты A. brasilense Sp245 с фенотипами, соответствующими определенным фазовым вариациям в подвижности штамма дикого типа.
3.Получить молекулярные зонды на основе фрагментов 85- и 120-МДа плазмид A. brasilense Sp245, применимые для анализа геномов мутантов и штаммов A. brasilense дикого типа.
Изучить генетические перестройки, сопровождающие вариации в подвижности и поверхностных структурах A brasilense.
Исследовать распространенность гомологичных локусов, определяющих подвижность, образование жгутиков и липополисахаридов, в ДНК штаммов А. brasilense Sp245, Sp7, Cd и SR75, выделенных на разных континентах.
Картировать вставки инсерционного элемента (омегона) в ДНК двух мутантов A. brasilense Sp245, имеющих дефекты в разных системах подвижности.
Научная новизна работы. Выделены фенотипическис варианты А. brasilense Sp245, демонстрирующие ускоренное роение ("суперроение"), а также подобраны условия для стабильного проявления этим штаммом способности к распространению в полужидкой среде с образованием микроколоний. Идентифицированы инсерционные мутанты A. brasilense Sp245 с фенотипами, соответствующими известным на сегодняшний день фазовым вариациям в коллективной подвижности азоспирилл (роение; суперроение; отсутствие миграции в полужидкой среде; распространение с образованием микроколоний). На примере одного из мутантов A. brasilense Sp245 (ВК759), показано, что переход азоспирилл от распространения с образованием микроколоний к ускоренному роению сопровождается исчезновением 85-МДа репликона и появлением плазмиды с молекулярной массой 36 МДа. Показано, что процесс образования коинтегратов вектора для омегонового мутагенеза pJFF350 и 85-МДа плазмиды A. brasilense Sp245 не является сайт-специфичным и приводит к образованию мутантов с разным фенотипом (отсутствие жгутиков; паралич жгутиков или ускоренное роение). Показано, что одиночные вставки инсерционного элемента (омегона) в ДНК A. brasilense Sp245 могут сопровождаться одновременными дефектами в нескольких системах бактериальной подвижности. Выявлена дупликация локусов fla/laf/mot/swa, определяющих жгутикование и подвижность A. brasilense Sp245, с локализацией одной из копий в 85-МДа плазмиде, а второй - в ином клеточном репликоне. Установлено, что появление у спонтанного мутанта A. brasilense Sp245.5 дефектов в трофическом хемотаксисе, липополисахаридах и полисахаридах, связывающих флуоресцентный краситель калькофлуор, коррелирует с генетической перестройкой, приведшей к полной или частичной
утрате 85-МДа плазмиды и к включению, по меньшей мере, части 120-МДа плазмиды (при реорганизации локусов Ips) в новый мегарепликон. Показано наличие гомологичных фрагментов ДНК в плазмидах A brasilense Sp245, Sp7 и Cd. Установлено, что у штамма A. brasilense Sp7 и его производного штамма Cd, выделенных из разных растений, стабильные различия в морфологии колоний коррелируют с утратой 115-МДа плазмиды и ее молекулярного маркера. На модели штаммов A. brasilense Sp7 и Cd показана возможность использования 2.4-тпн EcoRI-фрагмент плазмиды р85 A. brasilense Sp245, несущего локусflaflaf/mot/swa, для дифференциации генетических перестроек, происходящих при пассажах на разных растениях. Впервые показано присутствие гомологичных //«-локусов в двух плазмидах неродственных штаммов A. brasilense Sp245 и SR75, взаимодействующих с пшеницей в разных географических регионах.
Научно-практическая значимость. Создана коллекция мутантов А. brasilense Sp245, имеющих фенотипы, аналогичные фенотипам фазовых вариантов по коллективной подвижности, используемая в ИБФРМ РАН для исследования генетико-физиологических механизмов адаптации бактерий к средам разной плотности. Подобрана тест-система для стабильного проявления штаммом A. brasilense Sp245 способности к распространению в полужидкой среде с образованием микроколоний, что позволяет начать изучение генетико-физиологических механизмов названного процесса. Создан набор зондов на основе фрагментов 85- и 120-МДа плазмид A. brasilense Sp245, применимый для исследования родственных взаимоотношений и функций многочисленных плазмид, обнаруженных у бактерий рода Azospirillum. Материалы, полученные в диссертации, использованы при выполнении в ИБФРМ РАН плановой темы НИР "Изучение генов азотофиксирующих бактерий, определяющих их взаимодействие со злаками" (№ госрегистрации 01960001676; рук-ли - д-р биол. наук Е.И. Кацы; д-р биол. наук, проф. В.И. Панасенко); гранта Президента РФ "Выяснение молекулярно-генетических механизмов взаимодействий микроорганизмов с растениями как основы для развития эффективных современных генно-инженерных, экологических, аграрных и иных технологий" для поддержки ведущей научной школы заслуженного деятеля науки РФ, д-ра биол. наук, проф. В.В. Игнатова (НШ-1529.2003.4); гранта РФФИ "Генетический анализ кодируемой плазмидами продукции О-специфических полисахаридов и жгутиков у ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense" (99-04-48034а; рук-ль - д-р биол. наук Е.И. Кацы).
Положения, выносимые на защиту.
Добавление в полужидкую малатно-солевую среду красителя конго красного (в концентрации 0.004%) способствует стабильному проявлению у штамма A. brasilense Sp245 способности к распространению с образованием микроколоний.
Создана коллекция мутантов A. brasilense Sp245, имеющих фенотип, соответствующий определенным фазовым вариациям в коллективной подвижности штамма дикого типа: суперроение; распространение с образованием микроколоний; отсутствие миграции в полужидком агаре.
3. Использование молекулярных зондов, полученных на основе фрагментов
85- и 120-МДа плазмид A brasilense Sp245, позволяет выявлять гомологичные
последовательности и перестройки в геноме разных штаммов азоспирилл.
4. Интеграция в 85-МДа плазмиду A. brasilense Sp245 вектора для
инсерционного мутагенеза (pSUP5011 или pJFF350) приводит к образованию
разных продуктов слияния и к разнообразным изменениям в жгутиковании и
коллективной подвижности бактерий.
Переход одного из мутантов A. brasilense Sp245 от распространения с образованием микроколоний к суперроению сопровождается перестройками в плазмидных ДНК этого штамма, заключающихся в исчезновении 85-МДа репликона и появлении плазмиды с молекулярной массой 36 МДа.
В плазмидахА brasilense (р85 из Sp245 и pi 15 из Sp7, а также в р 120 из Sp245 и р90 из штаммов Sp7 и Cd) существуют гомологичные локусы, определяющие подвижность, образование жгутиков и полисахаридов.
7. Стабильные различия в морфологии колоний близкородственных
штаммов A. brasilense Sp7 и Cd, выделенных из разных растений, коррелируют
с утратой 115-МДа плазмиды. Использование фрагмента р85 из A. brasilense
Sp245 для зондирования геномов азоспирилл позволяет дифференцировать
штаммыА brasilense Sp7 и Cd.
8. В двух плазмидах неродственных штаммов A. brasilense Sp245 и SR75
существуют гомологичные lps-локусы, что коррелирует с выявленной другими
авторами идентичностью повторяющегося звена О-специфических
полисахаридов этих штаммов.
9. Одиночные инсерции омегона в ДНК мутантов A. brasilense Sp245
(SK039 и SK586) сопровождаются появлением дефектов в системах
подвижности, зависящих от присутствия на клетке разных двигательных
органелл (полярный и латеральные жгутики, полярный пучок пилей): плавания,
роения и распространения в полужидких средах с образованием микроколоний.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 5-м и 6-м Международных совещаниях "Azospirillum and Related Microorganisms" (Ганновер, 1991; Шарвар, 1994), на 8-м Восточноевропейском симпозиуме по биологической фиксации азота (Саратов, 1992), на 9-м Баховском коллоквиуме по азотфиксации (Москва, 1995), на 10-м Международном конгрессе по азотфиксации (Санкт-Петербург, 1995), на 1-м Рабочем совещании микробиологов Поволжья (Саратов, 2000), на 5-й и 6-й Школах-конференциях молодых ученых "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000, 2002), на 10-м Международном конгрессе IUMS The "World of Microbes" (Париж, 2002), на 1-й и 2-й Региональных конференциях молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой" (Саратов, 2002, 2004), на Межрегиональной научной конференции молодых ученых и специалистов "Вавиловские чтения-2003" (Саратов, 2003), на 3-й Всероссийской школе-конференции "Химия и биохимия углеводов" (Саратов, 2004), на отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН (Саратов, 1999, 2003, 2004). Диссертационная работа обсуждена и одобрена на расширенном
заседании лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН 18.10.2004 г., протокол № 155.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы с изложением и обсуждением собственных результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 305 источников. Объем диссертации составляет 164 машинописные страницы. Работа содержит 32 рисунка и 7 таблиц.
