Введение к работе
Актуальность проблемы. Являющиеся ассоциативными партнерами растений, бактерии рода Azospirillum из семейства Rhodospirillaceae способны к существованию в разнообразных климатических поясах и экологических нишах (Levanony et al, 1989; Bashan, Holguin, 1997, 1998; Katupitiya et al., 1995). Изучению особенностей метаболизма и многокомпонентных геномов азоспирилл посвящены многочисленные работы широкого круга исследователей. Повышенный интерес к биохимии и генетике этих бактерий объясняется их способностью стимулировать рост широкого круга растений (это plant-growth-promoting rhizobacteria, или PGPR).
У многих ассоциированных с растениями бактерий сформировались сложные мозаичные геномы - главным образом, за счет дупликаций генов и масштабного горизонтального генетического переноса (MacLean et al, 2007). Присутствие многочисленных мобильных генетических элементов в геномах азоспирилл также предполагает потенциальную возможность разнообразных генетических перестроек (Pothier et al, 2008; Katsy, Prilipov, 2009; Katsy, 2011). Пока известно очень немного оригинальных работ, посвященных изучению у азоспирилл динамики геномов и ее физиологических последствий. Между тем пластичность одной из плазмид (85-МДа плазмида, или р85) модельного штамма A. brasilense Sp245, исследуемого и в настоящей работе, привела к различиям в плазмидном составе культур Sp245, поддерживаемых в разных лабораториях мира, и к утрате р85 тем вариантом Sp245, геном которого был секвенирован недавно в США (Pothier et al, 2008; Khalsa-Moyers, 2010).
Среда обитания почвенных бактерий разнообразна по химическому составу, и существование в такой среде требует от организмов устойчивости и гибкости. В связи с этим пластичность генома является важной характеристикой бактерий, так как способствует возникновению неоднородных по своим адаптивным свойствам популяций. Получены первые данные о том, что образование фенотипических вариантов некоторых ризобактерий способствует их лучшему взаимодействию с растениями (Achouak et al, 2004).
Одним из факторов, жизненно важных для бактерий, является наличие в среде источника азота. Для азоспирилл характерна способность к азотфиксации в микроаэрофильных условиях и к использованию азотсодержащих солей (соли аммония, нитраты и нитриты) в условиях аэрации (Таї, Окоп, 1985). Процесс диссимиляторной денитрификации (как правило, при недостатке кислорода) у бактерий может катализироваться респираторной мембранносвязанной или периплазматической нитратредуктазой; цитохром cd\ или медьсодержащей нитритредуктазой; гетеродимерной, получающей электроны от питохрома с или однокомпонентной, получающей электроны от хинола NO-редуктазой и N2O-редуктазой (Zumft, 1997). Денитрификация может служить для нейтрализации редуцирующего потенциала в клетке, а также для дальнейшего превращения нитрита, в определенной концентрации способного ингибировать рост азоспирилл (Lee et al, 2002). Продукты нитрат- и нитритредукции могут влиять на поведение бактерий и их взаимодействие с растениями (Van Alst et al, 2007; Molina-Favero et al, 2008). У модельного штамма A. brasilense Sp245 охарактеризована периплазматическая нитратредуктаза и кодирующие ее гены парАВС (Steenhoudt et al, 2001), две копии гена нитритредуктазы nirK, локализованные в разных плазмидах (Pothier et al, 2008), гены погВ (Braker, Tiedje, 2003) и nosZ (Rich et al, 2003) с неопределенной локализацией в геноме. Других сведений об идентификации у азоспирилл генов денитрификации к началу наших работ в литературе не было.
Известны исследования, показавшие, что устойчивость азоспирилл к ряду тяжелых металлов выше по сравнению с другими ризобактериями (например, Tugarova et al., 2006). Несколько работ посвящены механизмам поступления металлов в клетку и их последующим превращениям (Ignatov et al., 2001; Kamnev et al, 1997, 2004). Для поддержания баланса ионов металлов в клетке бактериями используются несколько описанных в литературе систем (Bruins et al, 2000; Choudhury, Srivastava, 2001). Одним из способов выведения ионов из клетки является антипорт ионов и протонов, осуществляемый системой из трех-четырех белков. Мембранные белковые компоненты этой системы, или протон-субстрат антипортеры, из суперсемейства RND (restriction, nodulation, division - резистентность, образование клубеньков, деление клеток) подразделяются на основе экспортируемого субстрата. Разные экспортеры тяжелых металлов RND (НМЕ) осуществляют выброс одновалентных и двухвалентных катионов (Nies, 1999). Устойчивость бактерий к тяжелым металлам часто обеспечивается продуктами экспрессии плазмидных генов (Mergeay et al, 2003; Nies, 2003; и др.). Однако данных о генетических аспектах устойчивости азоспирилл к тяжелым металлам (кобальт, медь, цинк и др.) в литературе обнаружено не было.
Важным свойством, способствующим лучшему приспособлению бактерий к окружающей среде, является их подвижность. Наличие у азоспирилл специализированных двигательных органелл - жгутиков (Tarand et al, 1978; Hall, Krieg, 1984; Khammas et al, 1989) позволяет им перемещаться по направлению к наиболее благоприятным условиям, закрепляться на поверхности корней растений.
Исследования влияния плазмидных перестроек на такие важные механизмы приспособления бактерий к обитанию в гетерогенных экологических нишах, как подвижность, системы адаптации к разным источникам азота и устойчивость к солям тяжелых металлов, по-видимому, позволят расширить представления об адаптационном потенциале азоспирилл, обусловливаемым пластичностью генома.
Целью диссертационной работы явилось получение новых данных о функциях плазмид Azospirillum brasilense и о влиянии динамики геномов на физиолого-биохимические характеристики этих бактерий.
В соответствии с поставленной целью в ходе выполнения работы решались следующие задачи:
1. Характеристика нуклеотидной последовательности клонированного ранее 18.3-
т.п.н. Ji/гоІ-фрагмента 85-МДа плазмиды A. brasilense Sp245, утрата которой
дериватом Sp245.5 сопровождалась блокированием диссимиляторной
нитритредукции.
2. Сравнительный анализ геномов A. brasilense Sp245, Sp7 и Cd и вариантов
штамма Sp245 с новым плазмидным профилем с использованием в полимеразных
цепных реакциях праймеров к ДНК р85.
3. Исследование поведения у! brasilense Sp245 и его суперроящихся вариантов со
спонтанными геномными перестройками в средах, содержащих в качестве источника
азота хлорид аммония, нитрат или нитрит.
Анализ гемагглютинирующей активности и подвижности клеток штамма A.brasilense Sp245 и его деривата Sp245.5 (с крупной плазмидной перестройкой и новым липополисахаридом) в присутствии разных источников азота.
Сравнение устойчивости к солям тяжелых металлов у бактерий A. brasilense Sp245 и Sp7 и их производных со спонтанными плазмидными перестройками.
Научная новизна работы. Показано, что у модельного штамма A. brasilense Sp245 спонтанные геномные перестройки, затрагивающие плазмиду р85, могут
сопровождаться утратой протяженных сегментов р85 или их сохранением в геноме азоспирилл.
Кроме генов медьсодержащей нитритредуктазы (nirK) и гетеродимерной N0-редуктазы (погСВ), в плазмидной ДНК азоспирилл (р85 из штамма A. brasilense Sp245) впервые выявлены гены активатора NO-редуктазы NorD; АТФ-азы NorQ; предполагаемого сенсора N0; цистатион-Р-лиазы, катализирующей образование возможного антагониста N0 - гомоцистеина; одного из регуляторов транскрипции LysR типа и каталитической субъединицы I цитохром с оксидазы (ccoN); sl также последовательности, кодирующие компоненты предсказанной эфф люкс-помпы, осуществляющей выброс катионов из клеток. В ДНК типового штамма A. brasilense Sp7 и его производного Cd обнаружен локус, высоко гомологичный nirK и orf208 (кодирующей предсказанный белок с консервативным доменом "субъединица Е формилметанофурандегидрогеназы") из р85 штамма у! brasilense Sp245.
Впервые показано, что спонтанные плазмидные перестройки могут приводить к появлению субпопуляций (вариантов) штамма A. brasilense Sp245 с различиями в росте и подвижности в средах с N03~ и (или) N02~ и в эффективности восстановления нитрата и нитрита.
Установлено, что на подвижность бактерий A. brasilense Sp245 оказывают влияние межклеточные контакты, опосредуемые взаимодействиями поверхностного белка-гемагглютинина с О-специфическим полисахаридом (ОПС) этого штамма. Отсутствие таких белок-углеводных взаимодействий вследствие появления нового ОПС у деривата A. brasilense Sp245.5 (в клетках которого вместо двух резидентных плазмид образовалась новая мегаплазмида), по-видимому, является одной из причин заметных изменений в коллективной подвижности этих бактерий.
На примере A. brasilense впервые выявлено влияние динамики генома на устойчивость бактерий к ионам тяжелых металлов: описано необычное явление существенного спонтанного повышения толерантности бактерий к солям кобальта (II), цинка (II), меди (II) и серебра (I).
Научно-практическая значимость работы. Новые знания о влиянии динамики геномов PGPR A. brasilense на экологически значимые свойства этих бактерий (осуществление денитрификации; заселение новых территорий благодаря индивидуальной и социальной подвижности; устойчивость к солям тяжелых металлов и др.) будут полезны при разработке аграрных биотехнологий. Выявленные в плазмиде р85 из A. brasilense Sp245 последовательности, кодирующие ферменты денитрификации и компоненты предсказанной эффлюкс-помпы, могут быть клонированы в других бактериях с целью расширения адаптационного потенциала новых хозяев. Дериват Sp245.5 PGPRyl brasilense Sp245, обладающий, как оказалось, относительно высоким уровнем устойчивости к ряду тяжелых металлов, может быть использован в работах по биоремедиации загрязненных почв. Бактерии штамма A.brasilense Sp245.5, подробно охарактеризованные в данной работе, уже нашли применение в исследованиях пяти лабораторий ИБФРМ РАН (генетики микроорганизмов, микробиологии, биохимии, иммунохимии, экологической биотехнологии).
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
В плазмиде р85 из штамма A. brasilense Sp245 находится комплекс генов, потенциально важных для обеспечения диссимиляторной редукции N02~ и N0 и для защиты этих бактерий от токсического действия N0 и ионов тяжелых металлов.
Спонтанные генетические перестройки могут приводить к утрате из генома А. brasilense Sp245 протяженных сегментов 85-МДа плазмиды или к их сохранению в составе новых молекул ДНК.
3. Плазмидные перестройки в ряде случаев сопровождаются появлением
вариантов штамма A. brasilense Sp245 с индивидуальными различиями в скорости
движения и роста в присутствии разных источников азота, нитрат- и нитритредукции,
гемагглютинирующей активности и устойчивости к солям тяжелых металлов.
4. Существенное повышение толерантности деривата^, brasilense Sp245.5 к солям
серебра, кобальта, меди и цинка определяется несколькими факторами, в том числе,
усилением протонзависимого эффлюкса ионов Ag , Си и Zn .
Диссертационная работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН в рамках двух плановых тем НИР (науч. рук. -д.б.н. проф. Е.И. Кацы): "Изучение вклада плазмид в определение подвижности и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у почвенных ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense''' (№ госрегистрации 01200606181) и "Изучение генетической регуляции социальной подвижности и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у бактерий, ассоциированных с растениями" (№ госрегистрации 01200904390). Исследования были частично поддержаны грантами Российского фонда фундаментальных исследований (06-04-48204-а; рук. - д.б.н. Е.И. Кацы) и Президента РФ (НШ-3171.2008.4; рук. - заслуженный деятель науки РФ, д.б.н. проф. В.В. Игнатов).
Личный вклад соискателя. Экспериментальные данные, на основе которых сформулированы положения и выводы, представленные к защите, получены лично автором. Соискатель принимала непосредственное участие в постановке задач исследования, подготовке и проведении экспериментальных работ, обработке и обсуждении полученных результатов, подготовке публикаций.
Автор выражает благодарность зав. лаб. генетики микроорганизмов (ЛГМ) ИБФРМ РАН д.б.н. проф. Е.И. Кацы, сотрудникам ЛГМ ИБФРМ РАН в.н.с. д.б.н. А.В. Шелудько и с.н.с. к.б.н. Л.П. Петровой, сотрудникам лаборатории микробиологии ИБФРМ РАН (зав. лаб. - д.б.н. проф. В.Е. Никитина) с.н.с. к.б.н. Е.Г. Пономаревой и с.н.с. к.б.н. Е.П. Ветчинкиной и зав. лаб. молекулярной генетики ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития РФ к.б.н. А.Г. Прилипову за помощь при выполнении работ и сотрудничество.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на IV Межрегиональной конференции молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 2008), 5-м Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2009) и V Всероссийской конференции молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 2010). Диссертационная работа обсуждена и одобрена на расширенном заседании ЛГМ ИБФРМ РАН 22.11.2011, протокол № 185.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе, три статьи в рецензируемых журналах и две статьи в сборниках.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 173 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 23 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований (из 9 подразделов), а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 305 источников, из них 52 на русском и 253 на английском языке. В Приложении приведены обсуждаемые в работе кодирующие последовательности из двух сегментов р85, депонированные в базу данных GenBank (NCBI, США) под номерами EU194339, EU595700-EU595706, EU784144, GU904166, GU904167 и GQ168585).
