Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 12
1.1 Растительно–микробные взаимоотношения в ризосфере и современные представления о систематике и физиологии ассоциативных бактерий рода Azospirillum 12
1.2 Общая характеристика фенолоксидаз 21
1.3 Фенолоксидазная активность бактерии рода Azospirillum 29
1.4 Биологический синтез золотых наночастиц микроорганизмами 32
Глава 2 Объекты, материалы и методы исследования
2.1 Микроорганизмы и условия их культивирования 35
2.2 Материалы и методы исследования 2.2.1 Определение активности внеклеточной Mn–пероксидазы 35
2.2.2 Оценка активности Mn–пероксидазы при выращивании бактерий на среде содержащей соединения ароматической природы 36
2.2.3 Определение концентрации белка 36
2.2.4 Определение активности Mn–пероксидазы при инокуляции корней проростков пшеницы азоспириллами
2.2.4.1 Инокуляция проростков пшеницы бактериями 37
2.2.4.2 Качественное обнаружение Mn–пероксидазной активности на корнях
2.2.5 Выделение и очистка фермента 38
2.2.6 Электрофоретический анализ ферментов 39
2.2.7 Степень чистоты полученных препаратов 39
2.2.8 Определение pH–оптимумов выделенных ферментов 39
2.2.9 Установление температурного оптимума 40
2.2.10 Определение времени полуинактивации ферментов 40
2.2.11 Ингибирование этилендиаминтетраацетатом 40 2.2.12 Субстратная специфичность 40
2.2.13 Определение лигнинолитической активности азоспирилл 41
2.2.14 Определение лигниндеградирующей функции Mn–пероксидазы 41
2.2.15 Установление чувствительности азоспирилл к присутствию в среде золотохлористоводородной кислоты 42
2.2.16 Методы обнаружения и изучения частиц восстановленного золота 2.2.16.1 Просвечивающая электронная микроскопия 43
2.2.16.2 Ультрафиолетовая спектроскопия 43
2.2.16.3 Рентгеновская флуоресценция 44
2.2.16.4 Динамическое светорассеяние (фотонная корреляционная спектроскопия) 44
2.2.17 Статистическая обработка результатов 44
Глава 3 Результаты и их обсуждение 45
3.1 Обнаружение активности внеклеточной Mn–пероксидазы 45
3.2 Зависимость продукции Mn–пероксидазы A. brasilense Sp245 и Sp7 от условий культивирования 46
3.3 Влияние фенольных соединений на Mn–пероксидазную активность 49
3.4 Активность Mn–пероксидазы A. brasilense при инокуляции корней пшеницы 53
3.5 Выделение и очистка Mn–пероксидазы A. brasilense 55
3.6 Характеристика полученных препаратов MnПSp245 и MnПSp7 65
3.7 Лигнинолитическая активность A. brasilense Sp245 и Sp7 и участие Mn–пероксидазы в процессах окисления модельных соединений лигнина 68
3.8 Восстановление золота из хлораурата бактериями Azospirillum brasilense и возможная роль Mn-пероксидазы в данном процессе 77
3.8.1 Влияние золотосодержащего соединения HAuCl4 на рост азоспирилл 77
3.8.2 Биосинтез золотых наночастиц бактериями A. brasilense 78
3.8.3 Образование золотых наночастиц в присутствии препаратов Mn–пероксидаз A. brasilense Sp245 и Sp7 83
3.8.4 Предполагаемый механизм биовосстановления золота Mn–пероксидазами A. brasilense 86
Заключение 91
Выводы 94
Список сокращений и условных обозначений 96
Список использованной литературы
- Фенолоксидазная активность бактерии рода Azospirillum
- Определение активности Mn–пероксидазы при инокуляции корней проростков пшеницы азоспириллами
- Влияние фенольных соединений на Mn–пероксидазную активность
- Влияние золотосодержащего соединения HAuCl4 на рост азоспирилл
Введение к работе
Актуальность темы. На сегодняшний день проблема молекулярных механизмов взаимодействия микроорганизмов с растениями в зоне ризосферы, по-прежнему, остается особенно дискуссионной (Dutta and Podile, 2010; Fibach-Paldi et al., 2011). Одними из наиболее исследуемых модельных объектов ассоциативного симбиоза являются бактерии рода Azospirillum (Hartman et al., 2000). Некоторые штаммы азоспирилл способны к исключительно тесному взаимодействию с растением, в том числе к проникновению во внутренние ткани корня (Bashan et al., 2004; Saikia et al., 2012). Благодаря наличию большого генома азоспириллы обладают достаточно пластичным метаболизмом, позволяющим им адаптироваться к динамичным условиям ризосферы (Кацы, 2007).
Известно, что в прикорневом слое почвы аккумулируются многие физиологически активные вещества, и в частности фенольные соединения, способные даже в связанном состоянии сохранять свою биологическую активность (Bugg et al., 2011). Вещества именно этой группы, являются наиболее распространенными токсинами, а также выступают активаторами или ингибиторами многих обменных процессов (Rudrappa et al., 2008). В частности, защитные реакции растительных тканей в ответ на механическое повреждение и на атаку микроорганизмов связаны с участием фенольных соединений (Запрометов, 1992). Кроме того, вещества ароматической природы служат специфическими сигналами вызывающими хемотаксис у ризобактерий (Somers et al., 2004; Dutta and Podile, 2010). Таким образом, очевидно, что азоспириллам необходимы механизмы, позволяющие преодолеть фенольный барьер, возникающий при становлении взаимодействий с растением-хозяином, при этом не исключено, что у эндофитных и эпифитных штаммов данных бактерий они могут различаться.
Относительно недавно появились сведения о наличии у азоспирилл фенолоксидазной активности (Givaudan et al., 1993; Faure et al., 1994; Diamantidis et al., 2000; Никитина и др., 2010). Большинство работ касались обнаружения и изучения оксидаз, в частности лакказ. К началу наших исследований, полностью отсутствовали данные о пероксидазах бактерий, аналогичных ферментам лигнинолитического комплекса грибов. Основываясь на способности данных ферментов окислять многие ароматические, гетероциклические, хлорорганические вещества (Дзедзюля и Беккер, 2000; Hofrichter, 2002; Лисов и др., 2007; Айзенштадт и Боголицын, 2009), мы предположили, что продукция азоспириллами внеклеточной неспецифической пероксидазы, в частности Mn-пероксидазы, может быть связана с механизмами адаптации, повышающими выживаемость, конкурентоспособность бактерий благодаря возможности окислять и нейтрализовать токсичные фенольные соединения. Вероятнее всего, что наличие метаболических путей, ответственных за окисление ароматических веществ, предопределяет способность бактерии и к деградации более сложных лигниноподобных соединений.
Показано, что почвенные бактерии A. brasilense, могут поддерживать жизнеспособность при высоких концентрациях ионов металлов (Beveridge et al., 1997; Камнев и др., 2007). Интересными представляются исследования о возможном участии фенолоксидаз некоторых грибов в снижении токсического действия соединений золота, за счет образования Au0 (Ramezani et al., 2010; Sanghi et al., 2011; Ветчинкина и др., 2013a). Не исключено, что фенолоксидазы азоспирилл также могут участвовать в восстановлении золота из золотосодержащих соединений до элементного состояния с образованием золотых наночастиц. Кроме того поиск и развитие нетоксичных, экологически чистых, так называемых «зелёных» методов синтеза наноматериалов, на сегодняшний день стоит особенно остро. В связи с этим, актуальным является исследование способности бактерий рода Azospirillum к биосинтезу золотых наночастиц и роли собственных Mn-пероксидаз в данном процессе.
Таким образом, исследование Mn-пероксидазы азоспирилл представляет несомненный интерес как с точки зрения изучения роли фермента в жизнедеятельности бактерий и взаимоотношениях с растением, так и с позиции применения данного микроорганизма для получения препаратов, которые могут использоваться в различных областях биотехнологии.
Целью работы явилось сравнительное исследование свойств и функциональной значимости внеклеточных Mn-пероксидаз бактерий A. brasilense Sp245 и A. brasilense Sp7.
Задачи исследования:
1. Выявить способность A. brasilense к продукции внеклеточной Mn-пероксидазы.
2. Определить оптимальные условия культивирования A. brasilense Sp245 и Sp7 с целью получения максимальной активности исследуемого фермента.
3. Изучить влияние ряда фенольных соединений на продукцию Mn-пероксидазы, и способность изучаемых штаммов к окислению данных веществ.
4. Оценить Mn-пероксидазную активность A. brasilense Sp245 и Sp7 при инокуляции бактериями корней проростков пшеницы сорта Саратовская 29.
5. Выделить гомогенные препараты Mn-пероксидазы A. brasilense Sp245 и Sp7, дать сравнительную характеристику выделенных ферментов.
6. Исследовать лигнинолитическую активность азоспирилл и способность
Mn-пероксидаз к окислению модельных соединений лигнина.
7. Изучить способность A. brasilense к восстановлению золота из золотохлористоводородной кислоты до элементного состояния с образованием наночастиц и определить роль Mn-пероксидаз в этом процессе.
Научная новизна работы. Впервые в культуральной жидкости азоспирилл обнаружена внеклеточная Mn-пероксидаза. Впервые выделены и частично охарактеризованы гомогенные препараты Mn-пероксидаз эндофитного и эпифитного штаммов азоспирилл. Впервые обнаружена лигнинолитическая активность у бактерий рода Azospirillum и показана способность собственных Mn-пероксидаз деградировать модельные соединения лигнина. Получены приоритетные данные о формировании культурами A. brasilense золотых наночастиц при восстановлении хлораурата. Впервые показано, что в восстановлении золота участвуют внеклеточные Mn-пероксидазы, представлены гипотетические схемы данного процесса.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные в рамках настоящей работы результаты исследований расширяют и углубляют представления об адаптивных возможностях азоспирилл и вносят дополнительные коррективы в понимание механизмов взаимодействия микропартнера с растением-хозяином при становлении растительно-бактериальной ассоциации.
Полученные гомогенные препараты бактериальных Mn-пероксидаз могут быть использованы при проведении различного рода биологических исследований. Предложенная схема выделения и очистки внеклеточной Mn-пероксидазы азоспирилл может быть использована в различных областях биотехнологии, связанных с разрушением полициклических ароматических соединений, биоконверсией лигниноподобных веществ и детоксикации ксенобиотиков. Потенциально значимыми для разработки экологически чистых методов синтеза золотых наночастиц являются сведения о биовосстановлении золота с использованием азоспирилл и их ферментов. Материалы диссертации использованы при выполнении дипломной и курсовых работ студентами биологического факультета Саратовского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Обнаружена продукция внеклеточной Mn-пероксидазы в культуральной жидкости азоспирилл.
2. Индукция внеклеточной активности Mn-пероксидазы A. brasilense вторичными метаболитами растений, а также детекция фермента в области бактериальных скоплений, на поверхности корня инокулированного растения, косвенно подтверждают протекторную функцию Mn-пероксидазы, при становлении растительно-бактериальной ассоциации.
3. Выделенные из культуральной жидкости A. brasilense Sp245 и A. brasilense Sp7 электрофоретически гомогенные препараты Mn-пероксидазы представляют собой односубъединичные белки с молекулярной массой 42-44 кДа, способные к окислению ароматических субстратов только в присутствии H2O2 и являющиеся Mn-зависимыми.
4. Способность Mn-пероксидазы азоспирилл окислять модельные соединения лигнина свидетельствует об участии фермента в лигнинолитической активности бактерий
A. brasilense Sp245 и Sp7, которая в наибольшей степени выражена у эндофитного штамма.
5. Внеклеточная Mn-пероксидаза бактерий A. brasilense Sp245 и Sp7 опосредует способность бактерий к восстановлению золота из золотохлористоводородной кислоты с образованием золотых наночастиц.
Работа выполнена в лаборатории микробиологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН) в соответствии с плановыми темами НИР «Изучение гликопротеинов и биогенных низкомолекулярных соединений в жизнедеятельности бактерий и грибов» (№ гос. регистрации 01200904389, научный руководитель темы: д.б.н., профессор В.Е. Никитина) и «Физиолого-биохимические признаки адаптационных процессов у бактерий и грибов» (№ гос. регистрации 01201359054, научный руководитель темы: д.б.н., профессор В.Е. Никитина).
Апробация работы. Материалы диссертации, представлены на Международной научно–практической конференции «Вавиловские чтения – 2009» (Саратов, 25 – 26 ноября 2009); 14-й Пущинской Международной школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 19 – 23 апреля 2010); VII Международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Беларусь, Минск, 31 мая – 4 июня 2010); V Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 28 сентября – 1 октября 2010); VI молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 25 – 27 октября 2010); Conference «Ecology of Soil Microorganisms. Microbes as Important Drivers of Soil Processes» (Чехия, Прага, 27 апреля – 1 мая 2011); IV Всероссийском с международным участием Конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз – Россия 2011» (Воронеж, 23 – 27 мая 2011); XXIV зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 7 – 9 февраля 2012); VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 24 – 28 сентября 2012); международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве» (28 – 29 января 2013), VI Всероссийского с международным участием Конгресса молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия 2013» (Иркутск, 19 – 23 августа 2013), международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения–2013» (Саратов, 25 – 27 ноября 2013 г). Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории микробиологии ИБФРМ РАН протокол № 34 от 12.03.2014 г.
Личный вклад соискателя. Автором осуществлен аналитический обзор литературы и обобщение теоретических данных по теме диссертации. Экспериментальные исследования выполнялись автором лично и в составе научных групп. Соискателю принадлежит решающая роль в обработке, и интерпретации всех полученных результатов, а также в подготовке публикаций.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов, материалов и методов исследований, изложения и обсуждения результатов работы, заключения, выводов и списка используемой литературы, включающего 290 источников, в том числе 248 зарубежных, и 206 опубликованных в последние 15 лет. Работа изложена на 127 страницах, содержит 28 рисунков и 6 таблиц.
Фенолоксидазная активность бактерии рода Azospirillum
Как сообщается в обзорах последних десятилетий, первостепенную роль в становлении растительно–микробных взаимоотношений играют корневые экссудаты (Bais et al., 2006; Кравченко и др., 2011). Наиболее подвижными фракциями веществ, экскретируемых растением являются белки, углеводы, органические кислоты, а также фенольные соединения, гликозиды, алкалоиды, фитогормоны и витамины (Bertin et al., 2003; Bais et al., 2004), которые легко усваиваются почвенной микрофлорой и аккумулируются в корнеобитаемом слое (Dutta and Podile, 2010). Общеизвестно, что бактериальная колонизация корня находится в тесной взаимосвязи с физико–химическими особенностями среды, которые напрямую связаны с составом первичных и вторичных метаболитов растения, выделяемых в зону ризосферы (Dutta and Podile, 2010; Кравченко и др., 2011). Так качественный и количественный состав органических кислот экссудатов не только определяет pH среды (Dakora and Philips, 2002), и влияет на доступность марганца, магния, железа, фосфора, цинка и алюминия (Gahoonia, 1993; Jones and Darrah, 1994), но также оказывает селективное влияние на микрофлору. Помимо прямого действия на активность бактерий, кислоты влияют на видовой и штаммовый состав микроорганизмов прикорневой зоны (Somers et al., 2004; Phillis et al., 2004; Dutta and Podile, 2010). В некоторых работах отмечается, способность растений выделять вещества, схожие с молекулярными сигналами кворум–сенсинга, и тем самым влиять на социальное поведение многих ризобактерий, в том числе на подвижность и способность образовывать биопленки на корневой поверхности (Persello–Cartieaux et al., 2003; Waters and Bassler, 2005; Gera and Srivastava, 2006; Bais et al., 2006; Shelud ko et al., 2009; Borisov, 2009). Во многих исследованиях показана важность подвижности микроорганизмов в обеспечении конкурентоспособности в зоне ризосферы, например, в вирулентности Agrobacterium tumefaciens, Ralstonia solanacearum, Pseudomonas syringae и Erwinia carotovora subsp. atroseptica, определяющую роль играют именно подвижность и хемотаксис (Lugtenberg et al., 2001, Ichinose et al., 2003; Dutta and Podile, 2010).
Корневые выделения разных видов и сортов растений сильно отличаются по составу вторичных метаболитов (Bertin et al., 2003; Morgan et al., 2005), при этом качественный состав ароматических соединений изменяется даже в зависимости от зоны корня (Yang and Crowley, 2000). Среди веществ вторичного происхождения фенольным соединениям принадлежит ключевое место (Запрометов, 1992). По современным представлениям, они активно участвуют в микробно–растительных отношениях (Bais et al., 2006; Shaw et al., 2006; Kumar et al., 2007), а именно играют роль сигнальных молекул и индукторов генов вирулентности (Запрометов, 1992; Zhulin and Armitage, 1992; Макарова, 1998; Somers et al., 2004; Shaw et al., 2006; Макарова, 2007). Патогенные и полезные ризобактерии зачастую используют схожие начальные этапы взаимодействия с макропартнером (Lugtenberg et al., 2001; Soto et al., 2006). Устойчивость растения к поражению теми или иными патогенами коррелирует с высоким содержанием в их тканях фенольных соединений (Запрометов, 1992). При становлении симбиотических отношений срабатывает защитный механизм, аналогичный сверхчувствительной реакции «растение–патоген», в котором принимают участие ароматические соединения (Макарова, 2003; Narula et al., 2009). Так феруловая, салициловая и бензойная кислоты, пирокатехин, сирингол, танин и кверцетин активно подавляют почвенную микрофлору, оказывают ингибирующее действие на бактериальные –галактозидазы, нитратредуктазы, –глюкозидазы и другие ферменты (Makoi and Ndakidemi, 2007). Таким образом, фенольные соединения выступают лимитирующим фактором в процессе выживания ризобактерии в прикорневой зоне (Dutta and Podile, 2010). Наряду с вторичными метаболитами растений ароматической природы, вклад в фенольный статус почвы вносят лигниноподобные соединения и вещества, образующиеся при их разложении.
Для успешной адаптации и преодоления фенольного барьера почвенным бактериям необходим целый ряд механизмов. Многие микроорганизмы способны к ферментативной детоксикации ароматических субстратов (vanEtten et al., 2001). Так Pseudomonas putida в аэробных условиях дегидроксилирует наиболее распространенные флавоноиды – кверцетин и наренгинин, тем самым переводя их в менее токсичные формы (Pillai and Swarup, 2002). Способность к деградации бифенилов – суперэкотоксикантов почв – обнаружена у Sphingomonas, Burkholderia, Rhodococcus, Achromobacter, Comamonas, Ralstonia, Acinetobacter и Bacillus (Pieper, 2005). Некоторые штаммы псевдомонад способны эффективно деградировать бензойную смолу и хлорбифенилы (Davis and Sello, 2009), а также сирингол, фенолкумарин, сирингалдазин (Allocati et al., 2009). Предполагается, что для симбиотических бактерий характерны механизмы устойчивости к высоким концентрациям флавоноидов, не связанные с процессом разложения фенольных соединений, а опосредованные изменением проницаемости для них наружной мембраны (Burse et al., 2004; Dutta and Podile, 2010). Сообщается о наличии у A. tumefaciens и Rhizobium etli механизма, индуцируемого флавоноидами, и запускающего каскад реакций, по выведению ароматических соединений из бактериальной клетки (Palumbo et al., 1998; Gonzalez–Pasayo and Martinez–Romero, 2000). Вызывает интерес работа, посвященная исследованию способности почвенных ассоциативных бактерий Rhodococcus к деградации хлорбифенилов, в которой авторами высказывается предположение о генетической предрасположенности к деградации лигнина и полифенольных соединений, образующихся в процессе его деструкции, обусловленное ассоциативной природой бактерии (Leigh et al., 2006). Отмечается, что наличие метаболических путей, ответственных за окисление ароматических веществ вероятнее всего предопределяет способность бактерии к деградации более сложных лигниноподобных соединений (Bugg et al., 2011). При этом данная система должна быть внеклеточной и неспецифичной (Wong, 2009).
Определение активности Mn–пероксидазы при инокуляции корней проростков пшеницы азоспириллами
Для дальнейшего изучения свойств MnП азоспирилл, необходимо было выделение чистого ферментного препарата. Были выбраны оптимальные условия культивирования бактерий, исходя из ранее полученных результатов. Оба штамма выращивали на малатно–солевой среде с 0,1 мМ пирокатехином и 1 мМ MnSO45H2O при температуре 30C.
Выделение и очистку MnП азоспирилл, осуществляли по разработанной нами схеме, представленной на рисунке 6. Рисунок 6 – Схема очистки MnП Azospirillum brasilense В качестве первой стадии очистки использовали осаждение белков из культуральной жидкости дробным фракционированием сульфатом аммония. Для этого клетки A. brasilense Sp245 и Sp7 осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 7000 g, в супернатант при постоянном перемешивании добавляли 242 г/л сульфата аммония и оставляли раствор в холодильной камере на 12 ч. От образовавшегося осадка избавлялись центрифугированием. Далее белок из полученного супернатанта осаждали сульфатом аммония до 80% от полного насыщения, выдерживали 12 ч при –4C, центрифугировали, и осадок перерастворяли в 10 мл дистиллированной воды. Наличие стадии с осаждение сульфатом аммония до 40% помогает частично избавиться от пигментов, накапливающихся в процессе культивирования бактерий в присутствии пирокатехина.
На второй стадии к 10 мл белкового препарата добавляли 42 мг NaF, и перемешивали при комнатной температуре до полного растворения соли. Затем приливали 100 мкл водного раствора 5M CaCl2, продолжали перемешивание суспензии CaF2 в течение 10–15 мин, образовавшийся осадок удаляли мягким центрифугированием (10 мин при 2500 g). В супернатант при перемешивании добавляли по каплям ледяной ацетон в соотношении: 14 мл ацетона на 10 мл раствора белка, и оставляли на 12 ч в морозильной камере при –4C. Выпавший в осадок грубый препарат фермента отделяли центрифугированием, перерастворяли в минимальном количестве 0,025 M Na–ацетатного буфера, pH 5,0, и использовали для проверки ферментативной активности и дальнейшей очистки белка. За основу данной стадии взят нехроматографический метод выделения белка, предложенный Новаковским с соавторами (Новаковский и др., 2006). Как видно из представленных электрофореграмм ДДС–Na–электрофореза в ПААГ MnП двух штаммов (Рисунок 7), в ходе второго этапа, основанного на селективной сорбции белков на геле CaF2, и дальнейшем осаждением препарата ледяным ацетоном, удавалось избавиться от высокомолекулярных белков. В полученных препаратах преобладали белки с массой от 70 до 20 кДа. При этом препараты не теряли ферментативную активность. Далее ферментную вытяжку освобождали от низкомолекулярных примесей с помощью гель–фильтрации на колонке с Sephadex G–25, уравновешенной 0,025 M Na–ацетатным буфером, рН 5,0. На данном этапе работы степень чистоты RZ технических препаратов MnП составляла для штамма Sp 245 – 0,3 ±0,03, для Sp 7 – 0,4±0,005 (Таблица 3). Стоит отметить, что подбор специфических условий для очистки бактериальной MnП представлял большую сложность. Фермент имел свойство сильно сорбироваться с целым рядом носителей. В процессе выделения, при использовании элюирующих буферов с pH 6,8–7,5, у фермента пропадала активность. Предварительно проведенное исследование показало, что для очистки бактериальной MnП неэффективно применение тонких методов разделения, таких, как высокоэффективная хроматография на Mono P и Mono Q, что справедливо и для некоторых грибных MnП (Беккер и др., 1992).
На следующем этапе препарат подвергли гель–фильтрации на колонке с Sephadex G–75, уравновешенной 0,025 M Na–ацетатным буфером, рН 5,0, содержащим 0,1 М NaCl. Фракции, обладающие Mn–пероксидазной активностью, объединяли и диализовали против буфера. Проведение хроматографии при низких значениях рН позволило отделить основную часть балластных белков. На полученных хроматограммах (Рисунки 8 А, Б) видны два хорошо разрешенных белковых пика. В результате данного этапа ферментный препарат MnП A. brasilense Sp245 и A. brasilense Sp7 удалось очистить в 1,7 и 5,2 раза соответственно (Таблицы 4 и 5).
Влияние фенольных соединений на Mn–пероксидазную активность
Как было описано в разделе 1.3, бактерии A. brasilense могут поддерживать жизнеспособность в жестких условиях ризосферы благодаря наличию различных механизмов адаптации. Не исключено, что MnП выполняют полифункциональную протекторную функцию в жизнедеятельности азоспирилл, связанную не только со снижением токсического действия фенольных соединений. Относительно недавно появились сведения о возможности участия оксидоредуктаз и фенолоксидаз грибов в восстановлении золота из золотосодержащих соединений с образованием наночастиц (Ramezani et al., 2010; Sanghi et al., 2011; Ветчинкина и др., 2013a). Так в работе Sanghi (Sanghi et al., 2011) высказывается предположение о возможном участии собственных лакказ и лигниназ Ph. chrysosporium во внеклеточном синтезе золотых наночастиц, связанным со снижением токсического действия соединений золота.
В связи с вышеизложенным, представляет несомненный интерес исследование способности бактерий рода Azospirillum к биосинтезу золотых наночастиц и роли фенолоксидаз, в частности MnП, в данном процессе.
Первоначально нами была протестирована чувствительность A. brasilense Sp245 и Sp7 к присутствию золотохлористоводородной кислоты в среде культивирования. Оценено влияние данного соединения на ростовые характеристики и накопление биомассы бактериальных колоний при культивировании на жидкой малатно–солевой среде. В 24 часовую культуру бактерий был добавлен водный раствор HAuCl4 в диапазоне концентраций от 5 до 500 мкМ, и через 18 ч инкубации определены концентрации, характеризующие токсичность золотосодержащего соединения. Минимальная ингибирующая рост концентрация составляла 40 мкМ, при 100–500 мкМ рост полностью отсутствовал, а при 5 мкМ фактически не изменялся по сравнению с контролем, что справедливо как для эндофитного так и для эпифитного штамма. В работах по биовосстановлению золота микроорганизмами, часто используются более высокие концентрации золотохлористоводородной кислоты от 0,5 до 1 мМ (Konishi et al., 2004; Husseiny et al., 2007; He et al., 2010). Так клетки Aspergillus oryzae не инактивировались и оставались жизнеспособными при культивировании 120 ч в присутствии 1 мМ HAuCl4 (Binupriya et al., 2010). Для ксилотрофа Lentinula edodes ингибирующая рост концентрация хлораурата составляла 0,5 мМ (Ветчинкина и др., 2013c).
Биосинтез золотых наночастиц бактериями A. brasilense В ходе исследования установлено, что в присутствии HAuCl4 в диапазоне концентраций 5–30 мкМ при культивировании A. brasilense Sp245 и Sp7 на вторые сутки среда начинала приобретать слабое сиреневое окрашивание, которое с течением времени (72 ч) становилось более интенсивным (Рисунок 19). Такое окрашивание указывает на накопление в культуральной жидкости наночастиц золота (Philip, 2009).
Так как в состав среды культивирования азоспирилл входит яблочная кислота, нами была проведена инкубация HAuCl4 в концентрациях от 5 до 500 мкМ со средой выращивания. В синтетической среде того же состава с внесенной HAuCl4 без инокуляции бактерий в течение 72 ч изменения цвета и выпадения осадка не происходило. Это свидетельствовало о том, что процесс образования золотых наночастиц, в данном случае, не связан с химическим восстановлением золота под действием компонентов среды культивирования.
Для дальнейших экспериментов была выбрана концентрация HAuCl4 30 мкМ, при которой не наблюдалось ингибирования роста бактерий и отмечалось сиреневое окрашивание среды культивирования. Рисунок 19 – Фотография колб с культурой A. brasilense Sp7, выращенной на синтетической среде в отсутствии (слева), и присутствии 30 мкМ HAuCl4 (справа)
С применением просвечивающей электронной микроскопии и метода негативного контрастирования были исследованы культуральная жидкость и бактериальные клетки двух штаммов A. brasilense Sp245 и Sp7, выращенных в течение двух (Рисунки 20А, Б) и трех суток (Рисунки 20В, Г) в присутствии 30 мкМ HAuCl4. Как видно на представленных рисунках, в культуральной жидкости и около бактериальных клеток, наблюдаются электронно–плотные образования различной формы, при этом размер частиц сильно варьирует. С увеличением времени культивирования количество наночастиц возрастало. Для изучения наночастиц восстановленного A. brasilense Sp245 и Sp7 золота, культуральную среду отделяли от бактериальных клеток через фильтр с размерами пор 0,45 мкм и подвергали лиофилизации. Далее лиофилизат с наночастицами ресуспензировали в дистиллированной воде и наносили на никелевые сеточки с подложкой. Отделенные фильтрованием частицы золота представляли собой довольно большое количество наносфер и нанопризм размерами от 5 до 300 нм (Рисунок 21).
Влияние золотосодержащего соединения HAuCl4 на рост азоспирилл
Одной из интенсивно исследуемых моделей растительно–микробного взаимодействия являются ассоциативные бактерии рода Azospirillum (Lugtenberg and Kamilova, 2009; Saikia et al., 2012). Немаловажную роль в становлении ассоциации играют фенольные соединения, активно синтезируемые растением (Запрометов, 1992). Они способны выступать в роли ингибиторов наиболее важных процессов в жизнедеятельности бактериальной клетки. Для поддержания физиологически активного состояния в зоне ризосферы азоспириллам необходима система адаптации к агрессивному воздействию многих токсичных соединений. Нами было выдвинуто предположение, что такой протекторной функцией может обладать MnП.
О возможном участии MnП азоспирилл в адаптации бактерии к условиям ризосферы свидетельствуют полученные данные о повышении ферментативной активности при инокуляции растений бактериями, а также качественное обнаружение MnП в зоне бактериальных скоплений, на поверхности корня инокулированного растения. В ходе исследования установлено, что штаммы А. brasilense Sp245 и Sp7 способны окислять ряд фенольных соединений, присутствующих в среде культивирования, при этом данный процесс сопровождался стимуляцией Mn–пероксидазной активности. Пирокатехин и 2,6–диметоксифенол в большей степени влияли на ферментативную активность A. brasilense Sp245, а кверцетин и феруловая кислота на активность MnП A. brasilense Sp7. Вероятнее всего, субстратная специфичность ферментов эндофитного и эпифитного штаммов обусловлена адаптационными возможностями, связанными с различиями в условиях существования бактерий (внутри корня или в ризосфере).
Для изучения свойств MnП A. brasilense, была разработана схема выделения и очистки фермента. Сопоставление данных нативного и денатурирующего форезов показало, что внеклеточные MnП A. brasilense Sp245 и A. brasilense Sp7 (MnПSp245 и MnПSp7) – односубъединичные ферменты, обладающие примерно одинаковой молекулярной массой, лежащей в диапазоне 42–44 кДа.
Относительная активность выделенных ферментов была в десятки–сотни раз ниже грибных MnП (Леонтьевский, 1990; Беккер, 1992; Дзедзюля и Беккер, 2000), но одного порядка с ранее изученными бактериальными (Oliveira et al., 2009b). В отличие от MnП B. pumilus и Paenibacillus sp. (Oliveira et al., 2009b), обладающих максимальной активностью в щелочных условиях, pH–оптимум полученных в ходе нашей работы ферментов был равен 4,5, что согласуется с известными MnП грибного происхождения. Фермент как A. brasilense Sp245, так и A. brasilense Sp7 проявлял Mn–зависимую активность к ряду ароматических веществ.
Существенных отличий по физико-химическим свойствам между ферментами эндофитного и эпифитного штаммов не выявлено, однако следует отметить большую удельную активность у фермента A. brasilense Sp245.
Нами установлено, что представители рода Azospirillum способны расти на лигнинсодержащих субстратах, при этом лигнинолитический потенциал штамма A. brasilense Sp245 оказался выше, по сравнению с Sp7. Учитывая этот факт, а также опираясь на гипотезу, предложенную Bugg с соавторами (Bugg et al., 2011) об использовании бактериями аналогичной грибам лигниндеградирующей ферментной системы, мы предположили, что MnП азоспирилл может участвовать в процессах разрушения лигнина. Проведённые эксперименты показали способность очищенных препаратов MnП окислять лигнин Классона, что косвенно подтверждает возможность участия MnП в проникновении эндофитной бактерии внутрь корня, и нахождении там в метаболически активном состоянии.
В ходе данной работы впервые получены результаты о способности бактерий A. brasilense к образованию из хлораурата золотых наночастиц. В литературе фрагментарно представлены сведения об участии оксидоредуктаз в восстановлении золота до элементного состояния и образовании наночастиц. Нами обнаружено, что биосинтез коллоидного золота протекает внеклеточно. Впервые показано, что в редукции HAuCl4 принимают участие внеклеточные MnП, относящиеся к фенолокисляющим ферментам. Мы предположили, что восстановление ионов Au3+ до Au0 идет в обход основного каталитического цикла фермента, либо за счет образования MnП пероксида водорода, способного к биоредукции золотосодержащего соединения, либо за счет окислительно– восстановительной реакции с Fe2+ простетической группы активного центра фермента. Известно, что многие микроорганизмы, как и почвенные бактерии A. brasilense, могут поддерживать жизнеспособность при высоких концентрациях ионов металлов в среде обитания (Beveridge et al., 1997). Вероятнее всего, именно благодаря наличию защитных механизмов, азоспириллы оказались способны к биосинтезу золотых наночастиц из золотохлористоводородной кислоты. Можно предположить, что биоредукция золотой кислоты с образованием Au0 необходима для снижения токсического действия высоких концентраций данного вещества. Необходимо отметить, что доступность, простота и безопасность биосинтеза наночастиц золота при помощи ассоциативной почвенной бактерии A. brasilense делают этот метод перспективным для экологически чистого получения наночастиц.
Таким образом, экспериментальные данные, полученные в ходе наших исследований, подтверждают предположения о полифункциональной протекторной роли MnП в жизнедеятельности азоспирилл. Кроме того, принимая во внимание высокую окислительную способность фермента, простоту в использовании, не исключена возможность применения бактериальной MnП в современных тонких биотехнологических методах.
